甲狀腺癌生物標誌物的製作方法

2023-05-31 22:20:11

甲狀腺癌生物標誌物的製作方法
【專利摘要】本文提供的方法將微陣列數據用於特徵選擇並隨後使用選定的靶標以用新的臨床樣本測定數據產生工業標準的qPCR陣列以便建立分類模型。這種多步驟方法克服了傳統生物標誌物鑑定的缺點。
【專利說明】甲狀腺癌生物標誌物
[0001] 發明背景 序列表 本申請包含以ASCII形式通過EFS-Web提交的序列表並且通過引用以其整體併入此 處。將創建於2013年3月5日的所述ASCII拷貝命名為0051-0096-W01_SL. txt且大小為 5,019位元組。 發明領域
[0002] 本文提供的方法將微陣列數據用於特徵選擇並隨後使用選定的靶標以用新的臨 床樣本測定數據產生工業標準的實時定量（qPCR)陣列以便建立分類模型。這種多步驟方 法克服了傳統生物標誌物鑑定的缺點。
[0003] 發明背景 在使用傳統方法對甲狀腺結節的臨床分類中具有挑戰。這些挑戰影響臨床決策並導 致非必需手術的執行。雖然一些研究者已經探索了使用新的分子分類法以克服這些挑戰， 但是這些努力在臨床環境下仍然遠沒有實現。
[0004] 甲狀腺結節在大多數人群中常見。例如，據估計2010年在美國會驗明44, 670名 新病患。通常侵入診斷法對於病患中結節類型的準確診斷是必需的。自從1970年代引進 以來，細針抽吸活組織檢查（FNAB)提供了最重要的診斷手段，然而20-30%的FNAB細胞學 結果仍然不確定。儘管可重複不確定的、可疑的或非診斷的FNAB，但這些只對於小部分的病 患有幫助而且需要額外的費用和侵入步驟。
[0005] 許多研究者已經嘗試開發其他的診斷測定法和生物標誌物以提高診斷精確度。 例如，細針抽吸活組織檢查（FNAC)在更好的精確度上具有它的價值但其局限性在濾泡性 甲狀腺癌（FTC)中尤其明顯。免疫組化生物標誌物例如Hector Battifora間皮細胞1 (HBME-I)、高分子量細胞角蛋白19 (CK19)和半乳凝素-3已經展現出具有甲狀腺癌相關的 表達，但是它們的表達在靈敏性和特異性上高度可變。其他嘗試例如惡性甲狀腺細胞中使 用基因重排和/或體細胞突變的研究已取得的進展有限。進一步的研究已聚焦於轉化/乳 頭狀甲狀腺癌的重排（RET/PTC)，其中已發現BRAF和RAS基因的重排和突變增加診斷、預後 和驗證研究的精確性。最後，微陣列基因概況分析已展示有助於良性結節和惡性腫瘤的分 類。但是，這些研究大多數僅專注於簡單的微陣列分析和驗證以鑑定在良性和惡性群體之 間差異表達的基因。顯然，使用生物信息學模型的更穩健的測定和更精密的分析將更好地 適應腫瘤異質性的挑戰和臨床樣本的複雜性，尤其對於甲狀腺瘤。
[0006] 但是，基於微陣列的測定具有一些固有缺點。他們對樣本質量敏感，這在臨床環境 中通常表現為挑戰。基於微陣列的技術也需要增加的樣本製備時間和複雜的數據分析程 序。
[0007] 傳統地，微陣列被直接用於生物標誌物特徵（signature)的產生。然而，微陣列的 直接使用在臨床環境中產生了許多挑戰，儘管觀測到一些重要的靶標，但是並沒有形成如 何將通過微陣列實驗所得的觀察結果轉化為用戶友好的臨床檢測的共識。對於傳統直接使 用微陣列的另一個缺點是不同微陣列平臺間的標準化。存在多種微陣列平臺，其各自使用 截然不同的基因集合併採用不同雜交和信號檢測方法。例如，一些微陣列包含可變長度的 cDNA，而其它微陣列包含小的寡核苷酸序列。不同微陣列平臺的使用使得額外的平臺間的 標準化和轉化工作成為必要，這使結果一致性較低且增加出錯的風險。
[0008] 研究者們已將例如無監管的分級聚類和2組k-平均數聚類等傳統發現聚類分析 用於甲狀腺癌鑑定的靶標鑑定和最終分類。除了良好設計的基於多模型的特徵篩選和qPCR 陣列優化外，本文還提供用於監管的機器學習的新訓練樣本集，其隨後用於普遍接受的分 類方法-隨機森林（Random forest)中用於最終惡性甲狀腺結節鑑定。
[0009] 傳統地，用於分類的發現工具的使用限制了他們用於臨床診斷的潛在應用。 Marschall Stevens Runge 在他的著作 "Principles of molecular medicine (分子醫藥 原理）"中陳述，"分析的非監管方法，包括主要成分分析、分級聚類、k-平均數聚類和自組 織圖，可用作用於類別發現的工具。"此外，"用於確定在疾病狀況間基因表達概況的差異的 非監管方法具有可通過使用監管的學習方法規避的限制。"本文提供的方法將監管的機器 學習方法用於惡性甲狀腺結節和良性結節的分類並避免先前方法的問題和限制。
[0010] 發明概述 在實施方案中，提供實時定量聚合酶鏈反應（qPCR)陣列。合適地，該陣列包含一種或 多種選自即02、510(^11、5004、0)53、]\^1\60511和011311的甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物 標誌物；一個或多個選自TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ的參考基因；和用於產生 單一惡性腫瘤分數和可調整（scalable)的截止閾值的相伴分類算法。
[0011] 該陣列合適地包含3種或者更多種甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物標誌物和3個或 更多個參考基因，該陣列更合適地包含5種或更多種甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物標誌物 及4個或更多個參考基因。
[0012] 在實施方案中，該陣列包含甲狀腺結節惡性分類生物標誌物NPC2、S100A11、SDC4、 CD53、MET、GCSH 和 CHI3L1 及參考基因 TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1 和 YWHAZ。
[0013] 在本文描述了用於該陣列的示例性的替換基因，在本文亦描述了用於所述算法的 示例性的數學模型。
[0014] 附圖簡述 圖1展示用於製備本文所述生物標誌物PCR陣列的開發路線圖的實例。
[0015] 圖2展示本文所描述的qPCR陣列開發進程。
[0016] 圖3展示使用本文所述的qPCR陣列系統進行的從樣本到生物標誌物特徵小組 (panel)的工作流程。
[0017] 圖4A-4D展示本文所描述甲狀腺惡性腫瘤qPCR陣列的開發。
[0018] 圖5展示所述甲狀腺惡性腫瘤特徵的結果。
[0019]圖6A展示人類（Homo Sapiens) TATA框結合蛋白（TBP)、轉錄變體2、mRNA(SEQ ID NO :1)的序列。
[0020] 圖6B展示人類TATA框結合蛋白（TBP)、轉錄變體UmRNA (SEQ ID NO : 2)的序列。
[0021] 圖 7A 展不人類尼曼-皮克病（Niemann-pick disease)、C2 類型（NPC2)、mRNA (SEQ ID NO : 3)的序列。
[0022] 圖 7B 展示人類 S100 鈣結合蛋白 All(S100All)、mRNA(SEQ ID NO :4)的序列。
[0023] 優選實施方案的詳細說明 應該理解的是，本文描述和展示的具體實現是實例而不意圖以任何方式另外限制本申 請的範圍。
[0024] 本文提到的公開專利、專利申請、網址、公司名稱及科學文獻通過引用以其整體並 入此處，其程度如同各自具體地且單獨地指出通過引用併入一樣。本文引用的任何參考文 獻和本說明書的具體教導之間的任何衝突應該按支持後者的方式決斷。同樣地，單詞或短 語的本領域理解定義與本說明書中具體教導的該單詞或短語的定義之間的任何衝突應該 支持有後者的方式決斷。
[0025] 如本說明書中使用，除非內容清晰地另外指示，單數形式"一"、"一種"和"該"具 體還包括它們所提及的術語的複數形式。術語"約"在本文中用於意指大概、在…左右、大 致的或大約。當術語"約"連同數值範圍使用時，它通過延伸高於和低於陳述的數值的邊界 修飾該範圍。通常，術語"約"在本文中用於修飾高於和低於陳述值達20%變化的數值。
[0026] 除非另外定義，本文使用的技術和科學術語具有本申請所屬領域的技術人員通常 理解的含義。本文對本領域中普通的技術人員所知的各種方法和材料進行了提及。
[0027] 生物標誌物qPCR陣列的開發 在實施方案中，提供了製備生物標誌物實時定量聚合酶鏈反應（qPCR)陣列的方法。合 適地，這些方法包括選擇一種或多種高通量特徵表達數據集，標準化該特徵表達數據集，通 過一種或多種數學模型分析該數據集以產生最終候選特徵，和生成包含最終候選特徵的生 物標誌物qPCR陣列。
[0028] 如本文使用，"生物標誌物"是指可測量的特徵，這些特徵提供關於以下方面的信 息：在病患體內疾病或受累狀態的存在情況和/或嚴重度、與生物通路的關係、藥效關係或 產出、相伴診斷、特定物種或生物樣本的質量。生物標誌物的實例包括基因、蛋白質、肽、抗 體、細胞、基因產物、酶、激素等等。
[0029] 本文使用的"特徵"是指基因、基因的部分或其它基因組信息。合適地，特徵是指 用以製備本文所述陣列的基因。
[0030] 在實施方案中，所述一種或多種高通量特徵表達數據集（包括微陣列數據集，以 及包括下一代測序平臺的其它測序數據集）是基於臨床效用（例如，疾病特異性生物標誌 物）、研究興趣（例如，生物通路特異性生物標誌物）、藥物響應（例如，藥效生物標誌物或 相伴診斷生物標誌物）、物種和品質中的一種或多種而進行選擇的。
[0031] 在實施方案中，分析包含用一種或多種數學模型對數據集進行的分析，所述數學 模型包括但不局限於：隨機森林（RF)建模、支撐向量機（support vector machine, SVM) 建模和最近縮小形心（nearest shrunken centroid, NSC)建模。在本領域中已知的另外 的模型也能應用於本文描述的方法，包括例如各種遺傳算法、決策樹（decision tress)和 樸素貝葉斯建模（Naive Bayes modeling)。
[0032] 實施這些建模的方法在本領域中為熟知的，且得到了描述，例如RF模型在以 下中描述：Touw等人，"Data mining in the Life Sciences with Random Forest: a walk in the park or lost in the ,BriefingsinBioinformatics,2Q\2 ^ 5 月 26 日，Kursa 和 Rudnicki，"The All Relevant Feature Selection using Random Forest，" Cornell University Library， ， arXiv:11065112,2011 年 6 月 25 日，Genuer ^ A? ^Variable Selection using Random Forests,^ Pattern Recognition Zettens的文章，2010年3月17日，OstrofT等，"Early Detection of Malignant Pleural Mesothelioma in Asbestos-Exposed Individuals with a Noninvasive Proteomics-Based Surveillance Tool，"，PLOS ONE 7:e46091(2012年10月），Chen 等人，"Development and Validation of a qRT-PCR Classifier for Lung Cancer Prognosis,"JThorac Onocl 6:1481-1487 (2011年9月）；NSC模型在以下中描述： Klassen和Kim, "Nearest Shrunken Centroid as Feature Selection of Microarray Data，'，，可從http://wwwresearchgatenet/獲得，Tibshirani等，"Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression, ，' Proc Natl Acad Sci 99:6567-6572 (2002年5月14日）；及SVM模型在以下中描述：Yousef等 人，"Classification and biomarker identification using gene network molecules and support vector machines,10:337 (2009年），和Brank,J， "Feature Selection Using Linear Support Vector Machines,Microsoft Research TfecAflica/ Tfeporh MSR-TR-2002-63 (2002年6月12日）（其各自的公開內容通過引用 以其整體併入本文，特別針對本文描述的模型和它們的實現的公開內容）。在實施方案中， 分析包括將這些模型中的兩種或更合適地，所有三種用於數據，以產生組合特徵集和最終 qPCR陣列。
[0033] 合適地，分析包含基於由數據集所暗示的所需分類組合來自一種或多種數學模型 的區別性特徵。亦即，依據所需的分析（即，臨床的結果，研究興趣等等），選出區分一種 生物標誌物與另一種生物標誌物的特徵。例如，相對於不指示疾病狀態或其他特徵的基因 挑選存在於疾病狀態中的基因。
[0034] 如本文所述，分析可另外包括文獻挖掘（mining)以產生最終候選特徵。這允許添 加進一步的信息以闡明和限定所需的候選特徵。
[0035] 合適地，該方法另外包括選擇一種或多種對照數據集，以在生物標誌物qPCR陣列 中包含對照特徵。如本文所述，正是這些對照特徵（即，並不表現出生物標誌物特性方面 的變化的特徵）的選擇提供了本文所提供的方法和陣列的獨特特徵之一，使得產生最有用 的陣列信息。
[0036] 還提供了按本文所述方法製備的qPCR陣列。在合適的實施方案中，在陣列中每個 限定的位置對應於生物靶標。例如，陣列合適地包含特徵選擇（例如，基因選擇）以致陣 列板的每個孔代表用於分析的靶標。
[0037] 在實施方案中，將qPCR陣列設計用於各種生物標誌物（包括各種核酸分子） 的分析，例如用於信使RNA (mRNA)的分析、用於微小RNA(miRNA)的分析、用於長非編碼 RNA(IncRNA)的分析等，以及它們的組合。
[0038] 如本文所述，在合適的實施方案中qPCR陣列包括一種或更多種，合適地兩種或更 多種，三種或更多種，四種或更多種或五種或更多種對照特徵（即，基因），包括而不局限於 的：ACTB、B2M、⑶ SB、HPRTI、RPL13A、S100A6、TFRC、YWHAZ、CFLI、RPS13、TMED10、UBB、ATP5B、 GAPDH、HMBS、HSPCB、RPLP0、SDHA、UBC、PPIA、FL0T2、TMBM6、TBTl、MRPL19 和 RPLPO。在合 適的實施方案中，該陣列包含6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10 種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種、15種或更多種、 16種或更多種、17種或更多種、18種或更多種、19種或更多種、20種或更多種、21種或更多 種、22種或更多種、23種或更多種、24種或更多種或全部25種本文所述的對照特徵。
[0039] 在進一步的實施方案中，還可將另外的對照特徵（參考基因）包括進qPCR陣列， 所述對照特徵包括來自不同於人的動物（包括例如小鼠、大鼠、猴、狗等）的特徵。這些參 考特徵可通過將本文描述的各種方法應用於來自其它動物的信息而選定。
[0040] 進一步的示例性的參考特徵包括例如： 小鼠參考特徵： Actb NM_007393 B2m NM_009735 Gapdh NM_008084 Gusb NM_010368 Hsp90abl NM_008302 大鼠參考特徵： Actb NM_031144 B2m NM_012512 Hprtl NM_012583 Ldha NM_017025 Rplpl NM_001007604 牛參考特徵： ACTB NM_173979 GAPDH NM_001034034 HPRTl NM_001034035 TBP NM_001075742 YffHAZ NM_174814 恆河猴參考特徵： ACTB NM_001033084 B2M NM_001047137 GAPDH XM_00I105471 L0C709186 XM_00109769I RPL13A XM_001115079 miRNA參考特徵： SN0RD61 MS00033705 SN0RD68 MS00033712 SN0RD72 MS00033719 SN0RD95 MS00033726 SN0RD96A MS00033733 RNU6-2 MS00033740 在仍進一步的實施方案中，本文所述方法提供對一種或多種生物標誌物賦予單一概率 分數的方法。合適地，這些方法包括收集樣本集。合適地，這些樣本集是核酸溶液，但還可 以是細胞或組織樣本、血樣、唾液樣本、尿樣或其它生物流體樣本，並可另外包括各種蛋白 質或其它生物材料。
[0041] 合適地，核酸分子提取自樣本集的各個樣本。用於實施這種提取的方法在本領域 是熟知的。
[0042] 各個核酸分子隨後用如本文所述的qPCR陣列詢問。本文所使用的"詢問"是指將 樣本施加到陣列的一個或多個位置（即，孔）。該方法合適地包括評估一種或多種獨立的特 徵的辨別力。亦即，對陣列的一種或多種特徵（例如，基因）的能力進行評估以確定它們區 分生物標誌物的特徵（即，疾病對比非疾病狀態）的程度如何。
[0043] 該方法進一步包括通過用一種或多種數學模型分析兩種或更多種獨立特徵的組 合的辨別力生成組合特徵。本文描述了用於生成該組合特徵的方法(包括應用的數學模 型)，其包括例如隨機森林（RF)建模、支撐向量機（SVM)建模和最近縮小形心（NSC)建模。 在本領域中已知的另外的模型也能應用於本文描述的方法，包括例如各種遺傳算法、決策 樹和樸素貝葉斯建模。
[0044] 該方法隨後進一步地包含對組合特徵賦予單一概率分數。亦即，將單一值賦予該 組合特徵，其可用來確定生物標誌物的水平是否表明所測量/需要的結果。生物標誌物的 "截止"值--低於或高於其的話生物標記物的存在是決定的的概率分數--合適地為可 調整的，即根據需要升高或降低。
[0045] 在示例性的實施方案中，所述詢問包含對在單一陣列中的2-40個獨立的特徵（即 基因)進行評估。如本文所述，陣列合適地為96孔板，因此所需特徵數量合適地取決於該板 的物理特性(排或列的孔的數量）及將所述特徵(例如，基因等）儲存於板上的能力。在合適 的實施方案中，所述詢問包含對2-8個獨立的特徵、8-16個獨立的特徵、16-24個獨立的特 徵、24-32個獨立的特徵、32-40個獨立的特徵、或20個獨立的特徵及在這些範圍內的值和 範圍進行評估。
[0046] 本文提供的方法將微陣列數據用於特徵選擇並隨後使用選定的靶標以用新的臨 床樣本測定數據產生工業標準的qPCR陣列，以便建立分類模型。這種多步驟方法克服了傳 統生物標誌物鑑定的缺點。
[0047] 本文提供的方法將一種微陣列平臺用於特徵選擇分析以避免與平臺標準化和合 並數據集相關的問題。
[0048] 本文提供的方法合適地將7個靶標基因（比上述的小組少很多)連同對照一起用以 產生dCt數據以輸入用於分類的機器學習模型(診斷)。
[0049] 本文提供基於模型的分類系統。在訓練和測試後，將模型固定並只需要向模型中 輸入新的樣本數據。在不需要任何以前的訓練數據的情況下計算分類。
[0050] 本文提供使用組織特異性輸入對照的模型，與傳統上使用的一般微陣列或qPCR 對照不同，所述輸入對照可提供樣本間更精確的比較。
[0051] 本文提供這樣的模型，其即使用訓練集也用2-組K-平均數聚類分析實現88%精 確度和82%特異性，用無監管分級聚類分析實現92%精確度和82%特異性且合適地100%正 確地分類該訓練集。
[0052] 本文的方法提供基於機器學習分類模型的實用分子診斷qPCR測定特徵小組以鑑 定惡性甲狀腺結節。
[0053] 為更好地將惡性甲狀腺結節區分於良性甲狀腺結節，本文提供的方法使用更實用 的qPCR平臺。將來自微陣列測定的甲狀腺癌和對照樣本數據集用於針對甲狀腺惡性腫瘤 鑑定的最終特徵選擇。使用幾種特徵選擇方法（比如隨機森林和支撐向量機）以對靶標排 序。利用選擇的基因，將384-孔qPCR陣列(包括10個所選的特異性甲狀腺結節持家基因 和3個qPCR測定對照）用於研究49個良性和惡性甲狀腺樣本的集用於特徵小組開發。基 於分析進一步地鑑定出5個持家基因。使用隨機森林分類模型開發精細調和的分類特徵（7 個靶基因和5個對照）。除訓練集以外，本文提供的方法也在不同於訓練集的測試集中執行 良好。該方法提供91. 7%精確度、87. 5%靈敏性和100%特異性、100% PPV和80% NPV。在混 合樣本試驗中，該方法鑑定僅包含與75%良性樣本混合的25%真的惡性樣本腫瘤樣本。這 些結果表明所公開生物標誌物PCR陣列系統是用於生物標誌物開發的有效工具。
[0054] 本文提供的方法聚焦於可將惡性甲狀腺結節與良性或正常組織區分開的定量分 子分類物小組。提供這樣的方法，其使用生物標誌物測定友好平臺-實時PCR以針對測量 用於限定分類的靶標核苷酸表達水平獲得更好的精確度、特異性和一致性。提供以下方法， 其將組織特異性標準化對照小組用於靶基因表達的更好標準化並針對臨床實踐中生物標 志物的使用提供堅實基礎。本文提供甲狀腺結節惡性腫瘤生物標誌物，其通過交叉驗證和 交叉平臺再分類方式產生。生物標誌物來自具有對照開發-qPCR陣列樣本測定和實時PCR 數據分析和分類特徵重鑑定的高通量篩選特徵選擇-qPCR陣列開發。結果表明在鑑定惡性 樣本上有強大的性能。
[0055] 提供生物化學基因表達分類系統，以尤其當標準病理學檢驗不明確或不確定時， 分類甲狀腺結節。
[0056] 甲狀腺組織微陣列基因表達數據可同以下四種基於機器學習的基因排序和選擇 方法一起使用：隨機森林（RF)、最近縮小形心（NSC)、貝葉斯因子回歸建模（BFRM)和支撐向 量機（SVM)。將預先鑑定的靶標列表也用於最終靶基因列表中。
[0057] 本文提供的小組中的靶標也可用其他靶標代替，合適的替換物包括： 〇小組中的NPC2可被它的高度相關的備選基因所替換，例如：RXRG、CITED1、TGFA、 GALE、KLK10、LRP4、CDH3、NAB2、HMGA2、DPP4、SDC4、TIPARP、S100A11、PSD3、LGALS3、RAB27A、 ADORAl、TACSTD2、KLKlI、DUSP4、HMPl、PIAS3、CTSH、MRC2、SCEL、ABCC3、CHI3L1、TSC22D1、 PROS I、QPCT、ODZI、IGFBP6、RRAS、CAPN3、KRT19、SFN、ENDODI、PLP2、PDUM4、D0CK9、MAPK4、 CDH16、KIT、MATN2、TLEl、ANK2、KIAA1467、C0L9A3、TCFL5、TEAD4、SNTAl。
[0058] o小組中的S100A11可被它的高度相關的備選基因所替換，例如：TMP1、CHI3L1、 SFN、LGALS3、MRC2、MVP、NPC2、DPP4、CYPlBl、TACSTD2、PROSl、FNl、RXRG、PDUM4、DUSP6、 CTSH、ABCC3、MTMRl I、SDC4、IGFBP6、PLAUR、PIAS3、TIPARP、RRAS、ANXAl、QPCT、MAPK4、KIT、 TLE1、KIAA1467、SNTA1、S0RBS2、GPR125。
[0059] o小組中的SDC4可被它的高度相關的備選基因所替換，例如：TACSTD2、MET、 PDUM4、SERPINA1、TIPARP、TGFA、TSC22D1、GALE、LGALS3、NPC2、CYP1B1、FN1、IL1RAP、KLK10、 ZNF217、DUSP5、CTSH、ANXA1、CHI3L1、DPP4、MSN、RXRG、PR0S1、SFN、BID、DUSP6、END0D1、DTX4、 TMP1、NRIPl、CD55、NAB2、PIAS3、SlOOAlI、PRSS23、SCEL、LAMB3、CDH3、IGFBP6、CDC42EP1、 HMGA2、ADORAI、SLC4A4、HGD、S0RBS2、ELMOI、TFF3、TPO、KIT、ITPRI、MAPK4、FMOD、MTIF、FHLI、 SLC39A14、TLEl、VEGFB、CDH16、SNTAl、ANK2。
[0060] O小組中的⑶53可被它的高度相關的備選基因所替換，例如：TMSB4X、SELL、⑶86、 CCR7、PLAUR、MY07A、NFKBIE、S100B 和 ARHGEF5。
[0061] 〇小組中的MET可被它的高度相關的備選基因所替換，例如：SDC4、TACSTD2、DTX4、 IL1RAP、LGALS3、TGFA、GALE、KLK10、PARP4、HMGA2、PDUM4、CHI3L1、SERPINA1、PR0S1、 TIPARP、FNl、ENDODl、SLC39A14、HGD、ELMOl、TPO、S0RBS2。
[0062] o小組中的CHI3L1可被它的高度相關的備選基因所替換，例如：LGALS3、TMP1、 DPP4、PDUM4、SFN、CYPIBI、ENDODI、KRT19、CTSH、TACSTD2、PROS I、ANXAl、PLAUR、S100A11、 FN1、DUSP5、PLAU、SERPINA1、TIPARP、KLK10、S100B、MVP、IGFBP6、RAB27A、CDH3、SDC4、 IL1RAP、MRC2、ABCC3、BID、NPC2、AD0RA1、SLPI、LAMB3、RXRG、DUSP6、GALE、CITEDl、TGFA、 SCEL、RRAS、MET、ZFP36L1、CD55、ZNF217、RUNXl、SELL、PLP2、MY07A、KIT、ELMOl、KIAA1467、 TPO、S0RBS2、HGD、CDH16、ADIP0R2、MATN2、SLC4A4、FASTK、MTIF、MAPK4、PRPSI、SNTAI、HMGCR、 ITPRl、PGF、HKl、MPPED2、DIOl、TRAPPC6A、PRUNE、NDUFA2、FHLl、ARHGEF5、FLRTl、TFF3、 CSRP2、SLC39A14、TLEl、TMEM50B、P0LD2、FARS2、BMP7、BDHl、FCGBP、TCFL5、PEG3、GPR125、 P⑶、HSPB11、C0L9A3、FKBP4、BCAT2。
[0063] 表I.甲狀腺結節惡性腫瘤分類基因小組
【權利要求】
1. 一種實時定量聚合酶鏈反應（qPCR)陣列，其包括： a. -種或多種選自以下的甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物標誌物：NPC2、S100A11、 SDC4、CD53、MET、GCSH 和 CHI3L1 ; b. -個或多個選自以下的參考基因：TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1和YWHAZ ;和 c. 用於產生單一惡性腫瘤分數和可調整的截止閾值的相伴分類算法。
2. 權利要求1的qPCR陣列，包括3種或更多種甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物標誌物 和3個或更多個參考基因。
3. 權利要求1的qPCR陣列，包括5種或更多種甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物標誌物 和4個或更多個參考基因。
4. 權利要求1的qPCR陣列，包括甲狀腺結節惡性腫瘤分類生物標誌物NPC2、SlOOAl 1、 SDC4、CD53、MET、GCSH 和 CHI3L1 及參考基因 TBP、RPL13A、RPS13、HSP90AB1 和 YWHAZ。
5. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中所述陣列中的NPC2用選自以下的基 因替換：RXRG、CITEDl、TGFA、GALE、KLK10、LRP4、CDH3、NAB2、HMGA2、DPP4、SDC4、TIPARP、 S100A11、PSD3、LGALS3、RAB27A、AD0RA1、TACSTD2、KLK11、DUSP4、HMP1、PIAS3、CTSH、MRC2、 SCEL、ABCC3、CHI3LI、TSC22DI、PROSI、QPCT、ODZI、IGFBP6、RRAS、CAPN3、KRT19、SFN、ENDODI、 PLP2、PDUM4、D0CK9、MAPK4、CDHl 6、KIT、MATN2、TLEI、ANK2、KIAA1467、C0L9A3、TCFL5、TEAD4 和 SNTAl。
6. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中所述陣列中的S100A11用選自以下的 基因替換：--ΜΡ1、CHI3L1、SFN、LGALS3、MRC2、MVP、NPC2、DPP4、CYPlBl、TACSTD2、PROSl、 FNl、RXRG、PDUM4、DUSP6、CTSH、ABCC3、MTMRl I、SDC4、IGFBP6、PLAUR、PIAS3、TIPARP、RRAS、 ANXAl、QPCT、MAPK4、KIT、TLEl、KIAA1467、SNTAl、S0RBS2 和 GPR125。
7. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中所述陣列中的SDC4用選自以下的基 因替換：TACSTD2、MET、PDLIM4、SERPINA1、TIPARP、TGFA、TSC22D1、GALE、LGALS3、NPC2、 CYPIBI、FNI、ILI RAP、KLK10、ZNF217、DUSP5、CTSH、ANXAI、CHI3LI、DPP4、MSN、RXRG、PROS I、 SFN、BID、DUSP6、ENDODl、DTX4、--ΜΡ1、NRIPl、CD55、NAB2、PIAS3、SlOOAl I、PRSS23、SCEL、 LAMB3、CDH3、IGFBP6、CDC42EP1、HMGA2、ADORAl、SLC4A4、HGD、S0RBS2、ELMOl、TFF3、TPO、 KIT、ITPRl、MAPK4、FM0D、MT1F、FHLl、SLC39A14、TLEl、VEGFB、CDH16、SNTAl 和 ANK2。
8. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中所述陣列中的CD53用選自以下的基因 替換：TMSB4X、SELL、CD86、CCR7、PLAUR、MY07A、NFKBIE、S100B 和 ARHGEF5。
9. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中所述陣列中的MET用選自以下的基 因替換：SDC4、TACSTD2、DTX4、ILlRAP、LGALS3、TGFA、GALE、KLK10、PARP4、HMGA2、PDUM4、 CHI3L1、SERPINA1、PR0S1、TIPARP、FNl、END0D1、SLC39A14、HGD、ELMOl、TP0、S0RBS2。
10. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中所述陣列中的CHI3L1用選自以下的 基因替換：LGALS3、--ΜΡI、DPP4、PDUM4、SFN、CYPIBI、ENDODI、KRT19、CTSH、TACSTD2、PROS 1、 ANXAl、PLAUR、S100A11、FNl、DUSP5、PLAU、SERPINA1、TIPARP、KLK10、S100B、MVP、IGFBP6、 RAB27A、CDH3、SDC4、IL1RAP、MRC2、ABCC3、BID、NPC2、AD0RA1、SLPI、LAMB3、RXRG、DUSP6、 GALE、CITED1、TGFA、SCEL、RRAS、MET、ZFP36L1、CD55、ZNF217、RUNX1、SELL、PLP2、MY07A、 KIT、ELMOl、KIAA1467、ΤΡ0、S0RBS2、HGD、CDH16、ADIP0R2、MATN2、SLC4A4、FASTK、MT1F、 MAPK4、PRPSI、SNTAI、HMGCR、ITPRI、PGF、HKI、MPPED2、D101、TRAPPC6A、PRUNE、NDUFA2、FHLI、 ARHGEF5、FLRTI、TFF3, CSRP2、SLC39A14、TLEI、TMEM50B、P0LD2、FARS2、BMP7、BDHI、FCGBP、 TCFL5、PEG3、GPR125、P⑶、HSPB11、C0L9A3、FKBP4、BCAT2。
11. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中的相伴算法基於隨機森林（RF)建模。
12. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中的相伴算法基於支撐向量機（SVM)建 模。
13. 權利要求1-4的任意之一的qPCR陣列，其中的相伴算法基於貝葉斯回歸模型 (BRM)建模。
【文檔編號】C12Q1/68GK104321439SQ201380014443
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2012年3月15日
【發明者】S.田, X.曾, J.迪卡羅, J.俞, T.J.法希, V.德夫根, G.J.奎爾霍爾斯特, R.K.比安查 申請人:凱傑科技有限公司