白紋病的控制的製作方法

2023-05-31 14:47:16 1

專利名稱：：白紋病的控制的製作方法
技術領域：
：本發明的領域本發明涉及在植物中，更具體地說在甘蔗中白紋病的控制及植物毒素albicidin的滅活。
背景技術：
：白紋病是甘蔗中的主要疾病，它在超過50個國家中發生(Chen等，1991，臺灣糖類研究所報導，0(132)，19-27；Comstock和Shine，1992，植物疾病74(4)，426；Grisham等，1993年，植物疾病，77(5)，537；IrVine等，1993，植物疾病，77(8)，846)。病原體被鑑定為甘蔗白紋病黃單胞菌(Xanthomonasalbilineas)。甘蔗白紋病黃單胞菌產生稱為albicidin的一個家族的抗生素和植物毒素。albicidin選擇性地阻斷細菌和葉綠體中的DNA複製。Albicidin是美國專利US4525,354的主題。不產生albicidin的甘蔗白紋病黃單胞菌的突變體在接種的甘蔗中不產生萎黃病或任何系統疾病症狀(Birch和Patil，1987，生理學及分子植物病理學，30，199-206)。這表明albicidin導致甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗的萎黃病症狀，並在甘蔗白紋病中充當重要角色。在細菌中已鑑定了兩種不同的albicidin抗性的機制。一種機制涉及在一些大腸桿菌突變體中喪失對albicidin的細胞通透性(Birch等，1990年，普通微生物學雜誌，136，51-58)。另一機制涉及經過形成可逆的蛋白質-albicidin結合複合物滅活albicidin。已顯示可逆結合複合物的形成在Klebsiellaoxytoca中涉及albicidin抗性蛋白AlbB。然而，不幸的是，這些蛋白質不能不可逆地滅活albicidin，因而認為不能作為控制白紋病的有效的候選物。白紋病是一種在經濟上重要的疾病，如果種植的是敏感性栽培品種，它會在甘蔗工業上引起較大的商業損失。因此，有效抵抗該疾病的方法具有重大的經濟意義。例如，植物中的白紋病抗性是每種商用澳大利亞甘蔗品種的基本需要。選擇該抗性經過降低某些所需雜交的價值並導致否決非優良的新品種而不可避免地對培育程序具有顯著的影響。培育一個新甘蔗品種大約需花費10年時間，在培育程序的最後階段否決一個品種的工業花費大約為1百萬美元。最近開發的甘蔗遺傳轉化系統(Franks和Birch，1991，8月植物生理學雜誌，18，471-480；Bower和Birch，1992，植物雜誌，2，409-416)能使甘蔗品種得到分子改進且提供了常規培育程序的一個補充機制。本發明的概述本發明起因於細菌所產生的albicidin解毒酶這一預料不到的發現。進一步發現albicidin解毒酶分泌到胞外，並且不像AlbA和AlbB，該酶不可逆地失活albicidin。該細菌被鑑定為草生歐文氏桿菌，也稱為Pantoeadispera。因此，本發明的一個目的是提供一種albicidin解毒酶，用於治療感染白紋病的植物或減少植物被白紋病感染的可能性。本發明的另一個目的是提供編碼albicidin解毒酶的DNA序列，用於產生基本上抗albicidin的轉基因植物和植物細胞，使其基本上獲得對白紋病的抗性。因此，還有另一個目的是提供基本上抗白紋病的轉基因植物。因此，在本發明的第一個方面，提供了一種能不可逆失活albicidin的albicidin解毒酶。albicidin解毒酶優選是一種水解酶。合適的albicidin解毒酶包括但不限於包含圖3A所示的胺基酸序列的AlbD多肽。或者，AlbD多肽是一種「AlbD多肽同源物」。因此，本發明包含在功能上相似於AlbD多肽的多肽。這類多肽與圖3A的AlbD多肽相比含有保守的胺基酸取代。從諸如包括酵母細胞的真核細胞的任意合適的微生物中均可獲得AlbB多肽同源物。優選的是，AlbD多肽同源物從諸如，例如，歐文氏菌屬或Pantoea菌株的細胞中獲得。另外，AlbD多肽或其多肽同源物可經過按例如下文所述首先分離編碼AlbD型多肽的DNA序列來獲得。本發明的albicidin解毒酶可經過包括下列步驟的程序來製備(a)將編碼albicidin解毒酶或其生物學片段的DNA序列連接進合適的表達載體中以形成表達構建體；(b)將該表達構建體轉染進合適的宿主細胞；(c)表達該重組蛋白；並(d)分離重組蛋白。如本說明書中所使用的，表達構建體是一種包含編碼一種多肽的第一核苷酸序列的核苷酸序列，其中所說的第一序列有效連接到誘導所說的第一序列表達的調節核苷酸序列(如啟動子和終止序列)上。組成型和誘導型啟動子均是表達本發明的albicidin解毒酶的有用的附加序列。本發明的表達構建體可以是一種載體，如質粒克隆載體。本發明的載體可以是原核或真核表達載體，這些都是本領域的技術人員所熟知的。用於表達的合適的宿主細胞可以是原核或真核的。用於表達本發明的多肽的優選的宿主細胞是細菌。使用的細菌可以是大腸桿菌。表達蛋白質可由本領域的技術人員使用標準方案，如在Sambrook等(1989，第二版，冷泉港實際室出版，1989，特別是第16和17部分)中所述按常規製備。而且，還提供了大幅度降低或抑制植物中白紋病形成的方法，所說的方法包含給植物施用albicidin解毒酶的步驟。在這種情況下，植物優選是苷蔗和其它對白紋病敏感的植物。albicidin解毒酶可與其它試劑組合併且可以經任何合適的方法用藥。合適的方法包括栽種前浸泡植物的莖或插枝，將albicidin解毒酶滲入或注射入植物。在第二方面，本發明涉及編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列。該核苷酸序列可包含編碼P.dispersa的albD的核苷酸序列。因此，該核苷酸序列可包含圖3B所示的完整的核苷酸序列。另外，該核苷酸序列可包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。本文使用的術語「核苷酸序列」指mRNA，RNA，cRNA，cDNA或DNA。本發明還提供了如上所述的本發明的albD核苷酸序列的同源物。本說明書中所使用的該「albD同源物」包括編碼提供albicidin抗性的這種多肽的亞序列的核苷酸序列。在這方面，密碼子序列重複意味著可改變核苷酸序列而不影響相應的多肽序列。本發明的同源物進一步包括編碼與本發明的AlbD多肽具有相同功能特徵的多肽的核苷酸序列。本領域的技術人員可預料到可對本發明的AlbD多肽進行保守的胺基酸取代，且該取代的多肽會保留本發明的AlbD多肽的功能特徵。本發明的同源物進一步包括在嚴格條件下與本發明的albD核苷酸序列雜交的核苷酸序列，合適的雜交條件如下所述。可根據下列程序製備本發明的albD同源物(i)設計優選為簡併的引物，它至少跨越本發明的核苷酸序列的一個片段；(ii)經PCR技術使用該引物從合適的宿主獲得的核酸提取物擴增所述的至少一個片段。在該方面，合適的宿主優選是一種細菌，諸如，例如歐文氏菌屬或Pantoea菌株。這裡使用的「雜交」指互補核苷酸序列的配對以產生DNA-DNA雜交體或DNA-RNA雜交體。互補鹼基序列是那些由鹼基配對規則所涉及的序列。在DNA中，A與T配對，C與G配對。在RNA中，U與A配對，C與G配對。典型地是，使用斑點印跡，狹線印跡或Southern印跡對以雜交方式比較的核苷酸序列進行分析。Southern印跡用於測定DNA序列的互補性。Northern印跡確定DNA與RNA序列的互補性。斑點和狹線印跡可用於分析DNA/RNA的互補性。這些技術是本領域的技術人員所熟知的。在《分子物學常規方法》(Ausubel等，編輯)(JohnWileySons，Inc.1995)第2.9.1頁至2.9.20中描述了典型的方法。簡單地說，對於Southern印跡，使用凝膠電泳按大小分離DNA樣品。將按大小分離的DNA樣品轉移並固著於膜(典型地是，硝酸纖維素)上，用放射性互補核酸探測DNA樣品。在斑點印跡中，將DNA樣品直接斑點印跡到膜(硝酸纖維素或尼龍)上。在狹線印跡中，加長斑點DNA樣品。然後用放射性互補核苷酸探測膜。探針用放射性同位素進行生化標記或以易於鑑定的其它方式標記。探針用於鑑定基因，基因產物或蛋白質。因此，核苷酸序列探針可用於鑑定互補核苷酸序列。mRNA探針與其相應的DNA基因雜交。典型地是，可使用下列一般程序測定在嚴格條件下的雜交。使用上述印跡程序之一可將本發明的核苷酸(如albD或其亞序列)固著於膜上。可標記樣品核苷酸序列並用作探針。使用本領域的技術人員熟知的，用於上述印跡的程序，可分析探針與本發明的核苷酸序列雜交的能力。本領域的技術人員將認識到許多因素可影響結合於固著的DNA上的探針的量和鑑別率。探針的比活必須足夠高以允許檢測。典型地是，當使用放射性雜交探針時必須至少108dpm/μg的比活以避免較弱的或不可檢測的雜交信號。具有108至109dpm/μg比活的探針可檢測大約0.5pg的DNA。本領域中熟知的是必需有足夠的DNA固著於膜上以允許檢測。需要具有過量的固著DNA，且在大多數情況下允許最佳檢測的可接受的量一般為塗點10μgDNA。向雜交溶液中加入諸如10％(w/v)硫酸葡聚糖(分子量500,000)或PEG6000的惰性聚合物也可增加雜交的敏感性。已知加入這些聚合物可增強雜交信號，見Ausubel，出處同上，第2，10，10部分。為了從固著於膜上的第一種核苷酸序列和用作雜交探針的第二種核苷酸序列之間的雜交獲得有意義的結果，(1)必須有足夠的探針結合於固著的DNA上以產生可檢測的信號(敏感性)，(2)洗滌程序後，探針必須僅附著於那些與探針序列有所需互補程度的固著序列上(特異性)。本說明書中使用「嚴格性」指關於溫度，離子強度和某些有機溶劑存在的條件，在該條件下進行核酸雜交。使用的嚴格性越高，探針與固著DNA間的互補程度越高。「嚴格條件」指在該條件下僅具有高頻率的互補鹼基序列的核苷酸序列互相雜交的那些條件。舉例性的嚴格條件是(1)0.75M磷酸氫二鈉/0.5M磷酸二氫鈉/1mMEDTA二鈉/1％十二烷基肌氨酸鈉，在大約42℃下至少大約30分鐘，(2)6.0M尿素/0.4％月桂磺酸鈉/0.1％SSC(20倍；3MNaCl，0.3M檸檬酸三鈉-2H2O，pH7.0)，在大約42℃下至少大約30分鐘，(3)0.1×SSC/0.1％SDS在大約68℃下至少大約20分鐘，(4)1×SSC/0.1％SDS，在大約55℃下大約1小時，(5)1×SSC/0.1％SDS，在大約62℃下大約1小時，(6)1×SSC/0.1％SDS，在大約68℃下大約1小時，(7)0.2×SSC/0.1％SDS，大約55℃下大約1小時，(8)0.2×SSC/0.1％SDS，在大約62℃下大約1小時，(9)0.2×SSC/0.1％SDS，在大約68℃下，大約1小時。例如，見《分子生物學常規方法》(Ausubel等，編輯)(JohnWileySons，Inc.1995)，2.10.1-2.10.16頁(本文引用以供參考)和Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(冷泉港出版社，1989)，1.101-1.104部分。嚴格洗滌典型地進行總共大約20分鐘到大約60分鐘。在某些情況下，需要超過一次的嚴格洗滌以去掉與albD或其亞序列並不高度相似的序列。典型地是，使用等時間的2次洗滌，如2次15或30分鐘的洗滌。本領域的技術人員可預料到對於嚴格洗滌可採用其它更長或更短的時間以保證鑑定相似於albD的序列。儘管嚴格洗滌典型地在大約42℃到大約68℃的溫度下進行，但本領域的技術人員可預料到其它溫度可適用於嚴格條件。最大雜交典型地在低於DNA-DNA雜交體Tm的約20到25℃進行。本領域熟知Tm是解鏈溫度，或兩核苷酸序列分離的溫度。估測Tm的方法是本領域中熟知的。例如，見Ausubel，出處同上，2.10.8頁。最大雜交典型地在低於DNA-RNA雜交體Tm約10到15℃處出現。其它典型的嚴格條件是本領域中熟知的。本領域的技術人員將認識到可控制各種因素來使雜交的特異性最大化。最終洗滌嚴格性的優化可用於保證albD基因(或其亞序列)與其它相似的核苷酸序列之間的高度雜交。在典型的雜交程序中，DNA首先固著於諸如硝酸纖維素膜或尼龍膜的膜上。將DNA固著於這類膜上的方法是本領域熟知的，例如，見Ausubel，出處同上，2.9.1-2.9.20頁。在0.75M磷酸氫二鈉/0.5M磷酸二氫鈉/1mMEDTA二鈉/1％十二烷基肌氨酸鈉中將膜在42℃下預雜交30-60分鐘。然後在含標記探針的ACES雜交溶液(生命技術公司，Gaithersburg，Md.)中42℃下雜交膜1小時。接著在0.75M磷酸氫二鈉/0.5M磷酸二氫鈉/1mMEDTA二鈉/1％十二烷基肌氨酸鈉中42℃下對膜進行2次高嚴格性的10分鐘洗滌。此後，在室溫下用2×SSC洗滌膜以去掉未結合的探針。在另一典型的雜交程序中，固著於膜上的DNA在預雜交溶液中42℃下雜交過夜。雜交後，用2次嚴格洗滌洗滌印跡，如6.0M尿素/0.4％月桂磺酸鈉/0.1％SSC，42℃。此後，在室溫下用2×SSC洗滌膜。用於檢測結合於膜上的放射性標記的探針的放射自顯影技術是本領域熟知的。還提供了生產基本上抗albicidin和白紋病的轉基因植物的方法，包括將編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列導入植物、植物部分或植物細胞並進行表達，生長該植物、植物部分或植物細胞以產生轉基因植物的步驟。所述的核苷酸序列可以通過各種方法導入，如轉染、粒子轟擊、電穿孔或用根癌土壤桿菌感染。編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列可包括上文所述的任意序列。該核苷酸序列可包括圖3B所示的完整核苷酸序列。優選的是，該核苷酸序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。從任意被白紋病感染的合適的植物可獲得植物、植物部分或植物細胞。優選的是，植物、植物部分或植物細胞從甘蔗80種獲得。另外，本發明提供了具有穩定摻入到植物細胞中的編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列的轉基因植物，該穩定摻入到植物細胞中的核苷酸序列提供了對植物毒素albicidin和白紋病對植物的感染的至少部分抗性。當然，可預料到如果為了實現對albicidin的抗性需要將albicidin解毒酶運輸到特異性細胞區室，通過構建包含與編碼轉運肽的DNA序列框內融合的albicidin解毒酶的翻譯融合體可實現該運輸。轉運肽是本領域熟知的且可包括，例如，質體轉運肽，如玉米澱粉轉運肽，如在Klosgen和Weil的論文(1991，分子普通傳學，225-297-304)中所述，本文引用以供參考。該轉運肽用於將各種蛋白質運向各種植物種類的質體，例如，用於將NPTII蛋白質定位於菸草葉綠體中(VandenBroeck等，1985)及將GUS蛋白質定位於馬鈴薯植物葉綠體中(Klosgen和Weil，1991，自然，313，358-363)。在本發明的第三方面，提供了一種可生產用於治療被白紋病感染的植物和/或減小植物被白紋病感染的可能性的albicidin解毒酶的細菌。當以優選的實施方案所列的程序篩選時，該細菌可以是來自天然存在的能生產albicidin解毒酶的菌株的任何合適的菌株。合適的細菌可以是諸如草生歐文氏桿菌SB1403(也稱為PantoeadispersaSB1403)的草生歐文氏桿菌菌株。草生歐文氏桿菌SBl403的描述在優選的實施方案中給出。該菌株以保藏號N95/21834於1995年4月11日保藏於澳大利亞政府分析實驗室。或者，該微生物可以是能在細胞外表達編碼本文所述的albicidin解毒酶的核苷酸序列的任意合適的菌株。合適的菌株包括含有編碼albicidin解毒酶的基因拷貝的大腸桿菌和合適的土壤或植物商用細菌。還提供了大幅度減小或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法，所說的方法包含給植物或其莖施用細胞外生產albicidin解毒酶的細菌的步驟。該方法可包括將P.dispersa菌株或表達編碼albicidin解毒酶的克隆序列的合適的宿主作為生物控制劑。該菌株可經過包括噴射到葉上的任意合適的方法來施用。其它施用的例子包括將培養物滴到根部切割器或切割種植機上，或通過噴嘴噴到新切的殘株上。該生物控制劑可與有助於其操作或完成其它功能的一種或多種其它試劑組合。其它試劑可包括殺真菌劑。附圖的簡要描述圖1是草生歐文氏桿菌SB1403的無細胞提取物的albicidin解毒的時間過程；圖2描繪了QZB103和其衍生物的物理圖譜；圖3A示出albD基因編碼的預測的多肽序列；圖3B顯示了albD基因的核苷酸序列；圖4示出albD基因產物編碼的胺基酸序列與分別由脫硝產鹼桿菌albB基因和K.oxytodaalbA基因編碼的蛋白質的最佳匹配的比較；圖5A顯示了albD基因的內部HincII-StuI片段；圖5B為質粒pJPAldHS的圖譜；圖6為用大腸桿菌DH5α[pQZE533]和大腸桿菌DH5α[pSB6]滅活albicidin的圖示；圖7A顯示了使用PCR和特異性側翼寡核苷酸引物擴增的790個鹼基對的albD結構基因片段；圖7B顯示了albD預計的起始密碼子上遊的凝血酶裂解位點的位置；圖7C表示GST-albD基因融合物構建體pGSTALD的圖譜；圖8為顯示溫度對albD酶活性影響的條線圖；圖9代表顯示pH對AlbD酶活性影響的條線圖；圖10A代表命名為pTacAld的質粒克隆圖譜，顯示了在tac啟動子影響下的albD結構基因部分的取向；圖10B是與圖7A相同的圖；圖11A顯示了甘蔗表達載體pU3Z的圖譜；圖11B是與圖7A相同的圖；圖11C顯示了構建體pU3ZALD的圖譜；圖12為顯示在從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系中疾病嚴重性的頻率分布的條線圖，其中該植物品系用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3接種；圖13描繪了顯示在從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系中疾病嚴重性的頻率分布的線條圖，其中該植物品系用甘蔗白紋病黃單胞菌XA15接種。優選的實施方案實施例1來自Pantoeadispersa的albicidin解毒酶在轉基因甘蔗中的表達材料和方法細菌及培養用於本研究的細菌菌株和質粒在表1中列出。大腸桿菌菌株DH5α用作albicidin活性指示劑菌株且也用作DNA克隆和亞克隆的宿主菌株；從澳大利亞昆士蘭州染病的甘蔗中分離的甘蔗白紋病黃單胞菌菌株XA3用作albicidin生產菌株；從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗中分離的不同的albicidin抗性(Albr)分離物在表2中列出。大腸桿菌菌株在LM培養基中生長和維持(Miller，1972，分子遺傳學實驗。冷泉港，紐約，冷泉港實驗室出版社)，其它菌株在SP培養基中生長和維持(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075)。除了通常在37℃生長的大腸桿菌菌株外，所有其它菌株和分離物在28℃生長。經過在有軌搖床上以200rpm搖動對肉湯培養物通氣。細菌的分離從澳大利亞昆士蘭EightMilePlains收集甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗樣品，這些樣品以70％乙醇進行表面滅菌，然後切成小片。將片狀樣品懸浮於無菌水中並在塗布到SP瓊脂板之前在往復移動搖床上搖動1小時(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075)。以形態學為基礎收集出現的菌落用於進一步分析。albicidin的製備由甘蔗白紋病黃單胞菌在培養物中產生的albicidin按以前所述純化(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075；Birch等，1990，普通微生物學雜誌，136，51-58)。除非另有說明，HW-40(s)色譜後獲得的albicidin混合物用於本文報導的實驗。abicidin的生物測定按以前所述定量albicidin(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075)。以完整的細菌細胞來滅活albicidin向等體積的含有終濃度為1000單位/ml的albicidin的SP或LM液體培養基中加入OD600等於約1.5的生長活躍的細菌培養物。以一定的間隔取樣品並放於冰上或煮沸5分鐘。反應後，離心樣品並收集上清。對於未煮沸的處理，將上清在生物測定前接觸UV光10分鐘。無細胞提取物的製備將細菌分離物接種於100ml的SP液體培養基中並在28℃搖動生長24小時。以11020×g離心10分鐘收穫細胞並在TEMM緩衝液(10mMTrispH7.45，10mMEDTA，10mMMgCl2和2mMβ-巰基乙醇)中洗滌。細胞重懸於2mlTEMM緩衝液中並用微探針(250型，BransonUltrasonicCorporation，Danbury，CT)以50％能率循環和輸出檔3在冰上經超聲處理破碎。超聲處理以8秒破碎期及隨後8秒休息期進行3分鐘。經過使用相差顯微鏡檢術證實細胞破碎。以11020×g離心20分鐘去掉細胞碎片。然後使用牛血清白蛋白作為標準對照以染料試劑方法測定細胞提取物中的蛋白質濃度(Bradford，1976，分析生物化學，72，248-254)。分類學鑑定方法使用KOH方法試驗革蘭氏反應(Suslow等，1982，植物病理學，72917-918)，使用BIOLOGGNMicroplateTM(BiologInc.)試驗不同碳源的利用，使用Hugh和Leifson(HL)試驗(Collins和Lyne，1984，微生物學方法，第5版，倫敦，Gutterworths)進行氧化發酵試驗。植物材料和細菌接種甘蔗品種Q44用於所有的生物控制實驗，來自無甘蔗白紋病黃單胞菌的健康甘蔗植物的單結插條在接種前盆栽入PH1汙染的溫室大約2個月。以前描述的去頂法(Birch和Patil，1983，植物病理學，73-1368-1374)用於接種甘蔗白紋病黃單胞菌和草生歐文氏桿菌菌株。活躍生長的細菌(2天的甘蔗白紋病黃單胞菌培養物及24小時的草生歐文氏桿菌菌株培養物)以14000rpm離心1分鐘，用無菌水重懸並稀釋至恰當濃度，保存於冰上直至接種。albD基因的克隆和測序用BamHI限制性核酸內切酶部分消化SB1403DNA並連接進粘粒克隆載體pLAFR3的BamHI位點在大腸桿菌DH5α中構建草生歐文氏桿菌SB1403的粘粒基因組文庫。經過將重組粘粒克隆轉化子轉移到含10μg/mlTC和20U/mlalbicidin的LB瓊脂培養基上選擇albicidin抗性重組克隆。經交叉劃線培養證實T6噬菌體的敏感性。根據常規技術(Sambrook等，1989，紐約，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室)實現亞克隆進pBluescriptIISK(+)。Albr克隆pQZE533和4個ExoIII缺失亞克隆(pQZE456，pQZE457，pQZE540和pQZE560)用於從克隆的albD基因雙鏈中獲得完整的DNA序列。DNA測序以(Sanger等，1977，PNASUSA，74，5463-5467)雙脫氧核苷酸鏈終止法為基礎。PRISMTMReadyReactionDyeDeoxyTM終止子循環測序試劑盒來自應用生物系統。草生歐文氏桿菌SB1403中的albD基因的定點誘變組成草生歐文氏桿菌SB1403的albD基因內部片段的326bpHincII-StuI片段連接進自殺載體pJP5603中。連接產物用於轉化大腸桿菌JM109(λpir)。以限制性酶消化瓊脂糖凝膠電泳鑑定重組克隆pJPAldHS。將它轉移進遷移菌株S17-1(λpir)中，並遷移進草生歐文氏桿菌SB1403rif中。在含50μg/ml卡那黴素和50μg/ml利福平的SP瓊脂培養基上選擇接合後體菌落並測試albicidin解毒酶的產生。albD基因的PCR擴增和修飾含albD基因的質粒克隆pQZE533用作PCR擴增的模板。合成相應於albD結構基因5』和3』側翼區的2個寡核苷酸引物，5』和3』引物分別是(5』-TTAAGCGGGATCCGTTTTGATGGAC-3』)和(5』-GATTGAATCGTATCAGCTGGAAGAG-3』)。在200μl反應體積中使用2ngpQZE533DNA，0.4ng/μl引物濃度，脫氧核苷三磷酸各400μM，2mMMgCl2，0.5單位Vent(exo-)DNA聚合酶和1×PCR反應緩衝液(新英格蘭生物實驗室)進行PCR反應，Perkin-ElmerCetusDNA熱循環儀用於該反應，起始熱變性溫度為95℃5分鐘，然後在95℃變性溫度下1分鐘，55℃的退火溫度下1分鐘及72℃的聚合溫度下1分鐘循環30次。完成30個循環後使用72℃的聚合溫度最後進行7分鐘。對每次完成的PCR反應的等份試樣(10μl)進行1％瓊脂糖凝膠電泳並在溴化乙錠染色及紫外透射後觀察產物。以酚-氯仿提取和乙醇沉澱純化790bp的PCR產物。純化的PCR產物溶於LTE緩衝液(10mMTrizma鹼，1mMNa2EDTA，pH8.0)中並在-20℃保藏備用。AlbD酶的純化以BamHI和PvuII消化PCR擴增的結構基因片段並連接到BamHI和SmaI消化的GST基因融合載體pGEX-2T上。所得的構建體pGTAld含在IPTG誘導型tac啟動子控制下的在閱讀框內融合到穀胱甘肽S轉移酶(GST)基因上的嵌合albD基因(圖10)。培養大腸桿菌DH5α(pGSTAld)並以IPTG誘導。AlbD酶的純化基本上按廠家說明書(Pharmacia)進行。簡單地說，離心沉澱細菌培養物，經超聲處理製備無細胞提取物並過穀胱甘肽瓊脂糖4B親和柱。GST-AlbD融合蛋白結合到親和柱基質上，用蛋白酶凝血酶室溫下消化16小時從GST蛋白質分離AlbD酶蛋白質。消化後，收集含純AlbD蛋白質的洗脫物並以SDS-PAGE分析。純化酶在-20℃下保存於PBS緩衝液(140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，pH7.3)加20％甘油中。單子葉表達載體的構建單子葉植物表達載體構建體的基礎是pGEM-4Z。從GUS基因融合質粒pBI101(CLONTECH)分離含土壤桿菌Ti質粒胭脂氨酸合酶基因終止子序列(nos3』)的260bpUSstI-EcoRI片段並插入pGEM-4Z的SacI-EcoRI位點。從含遍在蛋白啟動子/蟲螢光素酶(ubiluc)融合基因的構建體pAHC18(Bruce等，1989，美國科學院學報，86-9692-9696)分離含遍在蛋白啟動子和內含子序列的大約1.9kb的HindIII-BamHI片段。然後將該片段連接到pGEM-4Znos3』的HindIII-BamHI位點上。所得的單子葉植物表達載體pU3Z在啟動子/內含子與終止子區域之間有一些諸如BamHI，SmaI，KpnI和SacI的單一限制性酶位點，用於隨後克隆感興趣的基因(圖16)。pU3Zald和pU3ZGUS構建體及甘蔗的轉化為了構建pU3Zald，將Ubi-albD融合基因，PCR擴增的albD結構基因的BamHI-PvuII片段連接到經BamHI和SmaI線型化的pU3Z上(圖16)。經過將來自pBI101(CLONTECH)的BamHI-SstIGUS片段融合到載體pU3Z(未顯示基因譜)的BamHI和SacI位點構建pU3ZGUS。甘蔗的轉化簡單地描述如下。按Franks和Birch(1991)，澳大利亞植物生理學雜誌，18，471-480所述形成並維持甘蔗栽培品種Q63的胚性愈傷組織。在轟擊前4小時將胚性愈傷組織以2.5cm直徑的環形放在滲壓劑平板(MSC3加0.2M甘露醇和0.2M山梨醇)上。使用Franks和Birch(1991)，澳大利亞植物生理學雜誌18，471-480所述的裝置和技術用DNA包被的鎢微粒轟擊愈傷組織。轟擊後，愈傷組織在相同的滲壓板上再維持4小時，然後轉移到MSC3(Heinz和Mce，1969)選擇培養基上。選擇程序和轉基因甘蔗的再生按下文所述的副標題「轉基因植物的生產和分析」所述用構建體轟擊後，在含20μg/mlgeneticin的起始選擇培養基上培養胚性愈傷組織2周。將健康的愈傷組織轉移到含30μg/mlgeneticin的培養基中再培養2周。然後經過將健康的愈傷組織轉移進含45μg/mlgeneticin的MSC3培養基中大約4周實施無逃避選擇。然後，將活躍生長的愈傷組織轉移到含相同濃度的抗生素的再生MSC培養基中。將這些再生平板放入螢光照射下的28℃的組織培養室中。培養大約2周後，分離小植物並放在相同的再生培養基上再生長直至易於盆栽。在轉基因甘蔗中表達的AlbD酶的檢測將1克甘蔗葉切成小片並在液氮中冷凍，在研缽中磨成粉末，之後加入4ml提取緩衝液(10mMKPO4，10mMDTT，1mMEDTA，3％TritonX-100，pH7.0)用於再研磨1分鐘；轉移進10ml試管中並使其在冰盒中靜置30分鐘。4℃離心20分鐘(14000rpm)後收集上清。測量上清中的蛋白質濃度。將上清加入到albicidin溶液中並在生物測定前在28℃保溫2小時。反應混合物中的albicidin消失表明存在AlbD酶。結果和討論albicidin抗性細菌的分離從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗的不同部分收集到在非選擇培養基上顯示出菌落大小，顏色和形狀有差異的15個不同的細菌分離株。其中，13個分離株顯示出不同水平的albicidin抗性，有些具有高度抗性(1000Ualbicidin/mL)，而其它僅顯示出中等或低水平的抗性(表2)。在該研究中，albicidin的一個活性單位定義為在平板覆蓋生物測定中能產生3mm抑制圈的毒素的量(Birch和Patil，1985，普通繳生物學雜誌，131，1069-1075)。篩選能產生albicidin解毒酶的細菌albicidin是熱穩定的，且其活性在100℃下30分鐘內不受影響(Walder等，1988，分子微生物學，2(4)，443-454)，而經過短時間煮沸細菌細胞膜和許多蛋白質會變性。因此可設計簡單而有效的試驗來檢測不同albicidin抗性機制。試驗了抗500U/mlalbicdin的細菌分離株的可能的抗性機制。已知albicidin抗性機制的一些細菌菌株用作對照。將新鮮的細菌培養物與albicidin溶液混合，培養後將混合物分成2部分。一部分煮沸，另一部分保持未煮沸。然後測定上清中的albicidin。表3的結果表明，經煮沸作為可逆毒素結合機制的典型的脫硝產鹼桿菌和大腸桿菌(pBS6)細胞可恢復albicidin活性(Basnayake和Brich，1995，微生物學，141Walder等，1988，分子微物學，2(4)，443-454)。大腸桿菌菌株RR1Albr阻止albicidin進入細菌細胞。經過與這些對照進行比較，我們可將這些albicdin抗性分離株分成具有不同的推斷的抗性機制的3組。分離株SB1401和SB1402很可能具有類似於脫硝產鹼桿菌和大腸桿菌(pBS6)的毒素可逆結合機制。SB501，SB1301和SB1404的抗性機制可能是毒素排斥或抗性靶。能不可逆地解毒albicidin的分離株SB101，SBl07和SB1403很可能具有albicidin解毒酶。其中，菌株SB1403顯示出最強的albicidin解毒活性。以無細胞提取物實驗可證實菌株SB1403可產生albicidin解毒酶。圖1是SB1403無細胞提取物的時間過程反應。在存在活性無細胞提取物時，迅速且逐漸從反應混合物中除去abicidin。但如果在與albicidin反應前經煮沸變性無細胞提取物則幾乎所加的全部毒素保留在反應混合物中。菌株SB1403的鑑定菌株SB1403是革蘭氏陰性，ONPG試驗陽性，遊動的杆形細菌，具有4-8根向周邊的鞭毛，其細胞大小為大約0.6-1.0μm寬×1.3-3.0μm長。它在SP培養基上可產生黃色色素。陽性反應導致試驗Hugh和Leifson’s培養基中的葡萄糖氧化或發酵。經過使用含95碳源利用試驗(BIOLOG)的GNMicroPlates進一步分類該菌株。在該試驗中，碳的利用檢測為孔中細胞呼吸的增加，導致四唑染料的不可逆減少。由此獲得的「呼吸印跡」與含569革蘭氏陰性種類/組鑑定型的革蘭氏陰性資料庫相匹配。這種匹配的結果表明分離株SB1403是草生歐文氏桿菌(EnterobacteragglomeransA)。以草生歐文氏桿菌SB1403生物控制白紋病表4顯示了草生歐文氏桿菌SB1403在白紋病的生物控制中非常有效。甘蔗白紋病黃單胞菌引起甘蔗Q44的嚴重損傷，接種後50％的新生葉死亡，在存活的葉中觀察到139條白色束狀紋。但在與草生歐文氏桿菌SB1403共同接種的植物中，沒有葉片死亡且僅觀察到2或3條白色束狀紋。而且，生物控制劑草生歐文氏桿菌對甘蔗無任何可檢測到的副作用。一些產生抗生素的草生歐文氏桿菌分離株用於生物控制火燒病，它是一種由解澱粉歐文氏桿菌引起的玫瑰植物的疾病(Vanneste等，1992，細菌學雜誌，174，2785-2796)。但草生歐文氏桿菌SB1403不產生抗大腸桿菌和甘蔗白紋病黃單胞菌的任何可檢測到的抗生素。測定在白紋病的生物控制中由草生歐文氏桿菌SBl403產生的albicidin解毒酶的作用在隨後的部分中描述。克隆albicidin解毒基因大約1600個Tcr粘粒克隆以膜片轉移到含500U/mlalbicidin的LB平板上，檢測到5個albicidin抗性菌株。用BamHI消化來自4個菌株的粘粒，發現均含有一條8kb的共同的帶。將這一共同的片段克隆進DNA測序載體pBluescript並命名為pQZB103(圖2)。以HincII部分消化pQZB103的質粒DNA並再連接，再連接產物用於轉化大腸桿菌DH5α且在含albicidin的LB平板上選擇轉化子。分離albicidin抗性菌落的質粒且以瓊脂糖凝膠電泳測定其大小。限制性酶消化最小的質粒克隆pQZH301表明它僅含有2條HincII片段，一條1.9kb長，另一條為0.6kb。以雙外切核酸酶III單向缺失並再連接到克隆載體上獲得一系列pQZB301的亞克隆。將每個這類質粒轉化進大腸桿菌DH5α且測定各自對albicidin的敏感性(圖2)。所有的Albr克隆均保持對噬菌體T6感染的敏感性，表明抗性不是由涉及albicidin吸收的Tsx孔的自發突變引起(Birch等，1990，普通微生物學雜誌，136，51-58)。albicidin解毒基因的核苷酸序列該albD基因的一部分的DNA序列和推導的胺基酸序列在圖3B中顯示。我們僅發現一個開放閱讀框，它編碼一個235個胺基酸的親水蛋白質，具有24511道爾頓的分子量。在AlbD蛋白質的235個胺基酸中，有59個帶電殘基；32個為酸性，27個鹼性，導致等電點為6.23。在引導唯一的開放閱讀框的ATG起始密碼子(箭頭所示)上遊10bp處發現與16SrRNA3』-UCUUUCCUCCACUA序列最佳互補的序列，但與AGGAGGShine-Dalgarno序列(Shine和Dalgarno，1974，美國科學院學報，71，1342-1346)不完全匹配。albD的轉錄終止位點可能屬於因子依賴型一類(Platt，1986，生化年鑑，55，339-372)。在albD基因的終止密碼子下遊發現非常類似於因子依賴型終止位點特徵性TCTG共有序列(Brendel和Trifonor，1984，核酸研究，12，4411-4427)的兩個TCTT盒和一個TGTG盒。此外，T-富集區位於2個TCTT盒的上遊，儘管T含量不是高度明顯。但在終止密碼子下遊沒有GG富集的二聯體對稱區。使用Lipman和Person的FASTA程序通過澳大利亞國家基因組信息服務比較該基因的DNA和蛋白質序列(圖3A)與主要序列資料庫(GenBank，EMBL，PIR和Swiss-Prot)中的所有DNA和蛋白質序列。然而，沒有檢測到與任何已知的DNA或蛋白質序列具有明顯的相似性。在這一方面，在蛋白質水平上表現出最大同源性的
背景技術：
序列包括小鼠T-細胞特異性轉錄因子-IP(在136個胺基酸重疊中有28.7％的相同性，PIR保存號JH0401)；根癌土壤桿菌假擬蛋白質2(在107個胺基酸重疊中有29.0％的相同性，PIR保存號S07977)；枯草芽孢桿菌二氫乳清酸酶(在95個胺基酸重疊中有30.5％的相同性，PIR保存號D39845)；苜蓿根瘤菌鞭毛蛋白flaA(在154個胺基酸重疊中有21.4％的相同性，PIR保存號A39436)；蔥頭假單胞菌β-內醯胺酶(在210個胺基酸重疊中有22.4％的相同性，PIR保存號48903)；和XanthomonascampestriscopD同源物(在152個胺基酸重疊中28.3％的相同性，PIR保存號D36868)。我們也比較了AlbD蛋白質序列與兩個已知albicidin結合蛋白質的保守區(walker等，1988，分子微生物學，2(4)，443-454；Basnayake和Birch，1995，微生物學，141)。圖4顯示了AlbD胺基酸序列與分別來自K.oxytoca和脫硝產鹼桿菌的Albr結合蛋白質N端的前16個胺基酸的最佳匹配。這一短的寡肽是2個蛋白質中僅有的明顯保守區域並且很可能是albicidin結合區(Basnayake和Bich，1995，微生物學，141)。如圖4所示，這3個albicidin抗性蛋白的基序似乎是「SxxxLxxL」或不太嚴格的「MYxxxFSxxxLxxLL」。草生歐文氏桿菌SB1403的AlbD酶在甘蔗白紋病黃單胞菌生物控制中的作用草生歐文氏桿菌SB1403對甘蔗白紋病黃單胞菌引起的白紋病提供了非常有效的生物控制(表4)。為確定由SB1403產生的albicidin解毒酶在白紋病控制中的作用，我們分離了喪失生產AlbD酶能力的SB1403定點突變體，並比較了它們與其親本菌株在白紋病生物控制中的效力。只有當以反式提供R6Kpir基因時才能複製的「通用」自殺載體pJP5603用於在SB1403中產生albD基因插入突變(Penfold和Pemberton，1992，基因，118，145-146)。將AlbD基因的HincII-StuI內部片段克隆進pJP5603，所得的重組克隆pJPAldHS(圖5)遷移進SB1403。以大約3.5×10-7的頻率獲得轉移接合體菌落，且75％的菌落失去其產生AlbD酶的能力，表明albD已成功地突變。這也表明albD基因對細菌生長不是必需的且它是一個單拷貝基因。已試驗了SB1403的2個AlbD突變體對白紋病的生物控制。表5顯示用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3和草生歐文氏桿菌SM1或SM18共同接種的甘蔗與用XA3和SB1403fir處理的植物相比白色束狀帶大約多5倍。這些數據表明，AlbD酶負責白紋病的生物控制。比較克隆的albB和albD基因產物在大腸桿菌中的活性圖6顯示了含從脫硝產鹼桿菌克隆的albB的大腸桿菌DH5α[pSB6]和含從草生歐文氏桿菌SB1403克隆的albD基因的大腸桿菌DH5α[pQZE533]的相對albicidin滅活活性。DH5α[pQZE533]逐漸從反應混合物中除去albicidin且在120分鐘內產生100％的albicidin的不可逆解毒。菌株DH5α[pSB6]在前15分鐘內降低了超過50％的抗微生物活性，但不再進一步減少。這可能是因為結合蛋白以結合蛋白albicidin的摩爾比為1∶1結合併因此滅活albicidin(Basnayake和Birch，1995，微生物學，141)。蛋白質結合的albicidin在抗微生物試驗中無活性。一旦經形成不能再循環的蛋白質albicidin複合物耗盡了結合蛋白，則剩餘的albicidin可抑制細菌細胞中的DNA合成。經結合蛋白降低的albicidin的抗微生物活性是可逆的；當經煮沸變性蛋白質albicidin複合物時釋放出大部分的毒素活性。該數據表明AlbD酶與AlbB結合蛋白相比導致albicidin的不可逆解毒，與albicidin結合蛋白的可逆相互作用相比導致產生更有效的albicidin抗性方法。AlbD酶的純化及特徵使用GST基因融合系統(Smith和Johnson，1988，基因，67∶31-40)純化albicidin解毒酶，即albD基因產物。PCR擴增的albD結構基因部分在相同的開放閱讀框中融合到穀胱甘肽S-轉移酶(GST)基因的C端(圖7)。經IPTG誘導後在大腸桿菌DH5α中表達的融合蛋白質結合到GST親和柱上。用識別位於GST重組C端的裂解識別序列的位點特異性蛋白酶凝血酶消化融合蛋白從柱中釋放純AlbD酶蛋白質。SDS/PAGE分析表明純化的AlbD酶具有大約25.5KDa的分子量，這與AlbD蛋白質的預期的25411Kda分子量一致。純化的AlbD酶可在-20℃穩定地保存於20％的甘油緩衝液中。圖8顯示該酶可在45℃解毒albicidin，但優選具有最大活性的適宜溫度28℃。圖9顯示了AlbD酶對反應溶液中的pH變化不敏感；該酶在pH5.8到pH8.0的範圍內幾乎同樣好地解毒albicidin。由於純化酶能在非常簡單的磷酸緩衝液中有效解毒相當純的albicidin，因此似乎AlbD的活性不需任何複雜的輔因子。AlbD酶的這些特徵表明它能在植物細胞的細胞質或質體中有效工作。為在植物中表達而進行的DNA修飾在天然albD基因中，在+lbp上遊8bp處有一個讀框外的ATG起始密碼子，當轉移進植物時它能干擾albD基因的高水平表達。經過在albD基因的PCR正向引物中插入一個點突變可消除該假起始密碼子。結果，ATG改變成ATC，該改變還在albD基因PCR產物5』端產生了一個BamHI限制性酶位點，用於隨後的克隆(圖10)。將PCR擴增的無啟動子的albD結構基因部分融合到細菌表達載體pKK223-3(Pharmacia)tac啟動子上。一個這種所得的克隆pTacAld被鑑定為含有取向正確的tac-albD融合基因(圖10)。經過證實以pTacAld轉化的大腸桿菌解毒albtcidin證實該正確的功能。轉基因植物的生產和分析為了檢驗該新的albicidin解毒基因是否也能在甘蔗中提供對白紋病的抗性，將PCR擴增的無啟動子的albD結構基因部分插入單子葉植物表達載體pU3Z(圖11)的ubi-內含子啟動子區和胭脂氨酸合酶聚腺苷化信號之間。所得的質粒pU3ZAld用於經微粒轟擊將嵌合albD基因轉化進甘蔗(Q63)(Bower和Birch，1992，植物雜誌，2，409-416)。將在合成Emu單子葉植物啟動子控制下的編碼對geneticin抗性的新黴素磷酸轉移酶(npt-II)基因(pEmuKN)與pU3Zald共同轉移進甘蔗以提供可選擇的標記。作為對照，ubi-luc和ubi-gus報導基因構建體pAHC18和pU3ZGUS以相同的方式與pEmuKN共同轉移進甘蔗。在含geneticin的培養基上選擇穩定轉化的胚性愈傷組織並再生。檢驗從未轉化的對照，用gus報導系統轉化的品系，及用albD共同轟擊後選擇的品系的Q63植物選擇的葉片的蛋白粗提物滅活albicidin的能力。表6顯示了在陰性對照品系中檢測不到albicidin解毒。然而，在這種轉化品系中檢測到活性，表明albD基因在這些轉基因品系中穩定地整合併表達。而且，作為albD表達的結果，具有albicidin解毒活性的轉基因品系對白紋病具有抗性，表現為在接種葉上缺乏特徵性白色束狀紋(表6)。不是所有的用albD共同轟擊的品系均顯示出albicidin解毒活性或疾病抗性。這是一種預期的結果，因為僅選擇了轉基因品系對抗生素G418(geneticin)的抗性，即由aphA(nptII)基因編碼的表型。在這些條件下用aphA共同轟擊的其它基因共同表達的效率典型地範圍為20％到60％。用病原菌攻擊轉基因植物在溫室中生長大約3個月後，用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3或XA15攻擊植物。圖12-13顯示了用albD共同轟擊後再生的許多轉基因植物顯示出對白紋病抗性增加，表現為在接種葉上少或沒有特徵性的白色束狀紋症狀，而未用albD轟擊的對照品系典型地形成多條白色束狀紋。在轉基因品系中缺乏白色束狀紋與解毒albicidin的能力相關(表6)。結論分離出了產生強有力的植物毒素(albicidin)解毒酶(AlbD酶)的細菌菌株SB1403並鑑定為草生歐文氏桿菌(或Pantoeadispersa)。SB1403在對由甘蔗白紋病黃單胞菌引起的甘蔗白紋病的生物控制中非常有效，且AlbD酶是該生物控制的決定因素之一。已克隆並測序了編碼AlbD酶的基因，albD基因是新基因，在DNA或蛋白質水平上與任何其它已知的DNA或蛋白質序列沒有任何明顯的序列同源性。已將AlbD酶純化成均質。該酶在5.8-8.0的pH範圍內有效滅活albicidin。該酶活性的最適溫度為28℃。該酶不需複雜的輔因子。經PCR去除幹擾在植物細胞中表達的閱讀框外ATG(起始)密碼子。將PCR修飾的albD基因的編碼序列克隆進含有玉米遍在蛋白啟動子和胭脂氨酸合酶3』終止子的甘蔗表達載體中。經粒子轟擊將它導入甘蔗中。表達AlbD酶的轉基因植物對由甘蔗白紋病黃單胞菌引起的白紋病具有抗性。實施例2以滅活albicidin的Pantoeadispera菌株對甘蔗白紋病進行生物控制材料和方法細菌，培養基和生長條件按以前所述(Birch和Patil，1987，生理學及分子植物病理學，30，199-206)從患白紋病的甘蔗分離甘蔗白紋病黃單胞菌XA3。用於該研究的所有其它細菌在表7中列出。大腸桿菌在37℃的LM培養基中生長(Miller，1972，分子遺傳學實驗，冷泉港，紐約冷泉港實驗室出版社)。所有其它細菌於28℃在SP培養基(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075)中生長。經過在有軌搖床上以180rpm搖動給液體培養基通氣。albicidin的製備和測定按以前所述(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075；Birch等，1990，普通微生物學雜誌，136，51-58)純化在甘蔗白紋病黃單胞菌XA3培養物中產生的albicidin。HW-40(s)色譜後獲得的albicidin混合物用於此處報導的實驗。按以前所述(Birch和Patil，1985，普通微生物學雜誌，131，1069-1075)定量albicidin，不同之處是大腸桿菌DH5用作指示菌株，1％瓊脂糖用於覆蓋。albicidin抗性細菌的分離從澳大利亞Brisbane糖類實驗站辦公署進行的疾病抗性試驗中收集患白紋病的甘蔗。顯示出甘蔗白紋病黃單胞菌侵染徵狀的葉和莖樣品經70％乙醇進行表面滅菌，然後切碎，在搖動條件下懸浮於無菌水中1小時，然後塗布到SP瓊脂平板上。再劃線培養明顯可見的菌落類型以確保分離株的純度，經過劃線到含特定濃度抗生素的平板上試驗其albicidin抗性。試驗albicidin抗性機制將活躍生長的細菌培養物(600nm下的光密度為1.5)加到等體積的含終濃度為500ngml-1的albicidin的SP培養基中，然後在28℃培養6小時。將樣品放於冰上或煮沸5分鐘，然後以11020xg離心10分鐘。在未煮沸的處理中接觸UV(312nm)10分鐘後測定上清的albicidin。以無細胞過濾物和細胞提取物滅活Albicidin菌株SB1403在培養基中生長40小時，然後在冰上冷凍並以11020xg離心10分鐘。上清過濾滅菌(GelmanAcradisc0.2μm)，然後貯存於冰上或用20μgml-1蛋白酶K(sigma)處理1小時。然後如上所述檢驗SP培養基中滅活albicidin的能力。為了製備細胞提取物，經過在11020xg下離心10分鐘收穫24小時肉湯培養物中的細胞，洗滌並重懸於TEMM緩衝液(10mmol.l-1TrispH7.45，1mmol.l-1EDTA，1MMOLl-1MgCl2和2mmoll-1p-硫基乙醇)中，用微探針(Branson250型)，以50％能率循環和25-45W的輸出在冰上聲處理破碎細胞，處理為8秒聲處理及隨後8秒靜止期共進行3分鐘。用相差顯微鏡檢術證實細胞破碎。以11020xg在4℃離心20分鐘去掉細胞碎片。使用牛血清白蛋白作校準經染料結合(Bradford，1976，分析生化，72，248-254)測量細胞提取物中的蛋白質濃度。分類鑑定和抗生測定使用Hugh和Leifson試驗(Collins和Lyne，1984，微生物學方法，第5版，倫敦Butterworths)檢測菌株SB1403的葡萄糖氧化和酵解，並檢測其中β-半乳糖苷酶的產生(ONPG檢驗)，在BIOLOGGN微板系統中碳源的利用，及在3％KOH中的可溶性作為草蘭氏反應的斷定(Suslow等，1982，植物病理學，72-917-918)。使用大腸桿菌DH5α和甘蔗白紋病黃單胞菌XA3作指示菌株檢驗菌株SB1403中抗生素的生產。使用如對albicidin所述的覆蓋試驗檢測在SP肉湯中生長了1，2和3天後的無細胞培養基濾過物。經過與CHCl3蒸汽接觸殺死在SP瓊脂中培養2天後的菌落，然後用指示細菌覆蓋。植物材料和細菌接種對自紋病高度敏感的甘蔗品種Q44用於所有生物控制實驗中。來自健康植物的單節插枝在溫室中生長大約2個月，然後按以前所述(Birch和Patil，1983，植物病理學，73，1368-1374)的去頂方法用甘蔗白紋病黃單胞菌和P.dispersa菌株接種。接種物由來自活躍生長的培養物(甘蔗白紋病黃單胞菌的2天培養物，P.dispersa的24小時培養物)中的細菌組成，將它們以11020xg離心1分鐘，用無菌水重懸並稀釋至指定濃度，並保存於冰上直至接種。經過覆蓋到新切的植物表面進行接種。接種2周後檢查植物切過的葉片上的症狀，監測系統症狀形成共6周。從接種1個月後的葉片及從接種後6個月的幼莖組織嘗試溶解細菌。含200μgml-1氨苄青黴素或500ngml-1氨苄青黴素或500ngml-1albicidin的SP平板分別用於選擇性地再分離甘蔗白紋病黃單胞菌ZA3和P.dispersaSB1403。結果和討論albicidin抗性細菌的分離在從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗中分離的具有明顯的集落特徵的15個細菌分離株中，有13個分離株被證實為抗50ngml-1(大腸桿菌的最小抑制濃度)的albicidin，3個分離株對1000ngml-1albiidin有抗性(表1)。篩選解毒albicidin的細菌許多細菌活躍地從周圍培養基中積累albicidin。對於大腸桿菌，已知該過程涉及經Tsx外膜孔活躍地吸收，消除吸收則導致albicidin抗性(Birch等，1990，普通微生物學雜誌，136，51-58)。一些細菌由於產生結合該抗生素的細胞內蛋白而對albicidin具有抗性(Wallker等，1988，分子微生物學，2，443-454；Basnayake和Birch，1995，微生物學，141，551-560)。albicidin具有熱穩定性，在100℃處理30分鐘損失較少活性，而細菌細胞膜和許多蛋白質在煮沸時變性，釋放出可逆結合的albicidin。這使得可以以一個簡單的試驗來區分albicidin抗性的各種機制。將細菌樣品與albicidin溶液混合，培養後取出等份試樣並保存於冰上或煮沸，之後在上清中測定albicidin活性。當使用新鮮的細菌培養物時，該試驗區分毒素失活與其它已知的抗性機制。在該試驗中使用稠密的細胞懸液，細胞提取物或培養上清進一步區分作為抗性機制的毒素排斥，毒素結合，可能的抗性靶及胞內對輸出的蛋白。與用已知抗性機制的對照相比，使用來自甘蔗的albicidin抗性細菌的新鮮培養物的結果顯示出包括albicidin解毒的第一個實施例在內的不同抗性機制(表7)。顯示出最強albicidin解毒的菌株SB1403以更詳細地方式進行鑑定。隨培養物的時間從24小時到40小時，該菌株的培養濾過物顯示出細胞外活性逐漸增加。來自40小時的培養物的培養濾過物在6小時的保溫期間消除300ngml-1albicidin溶液的抗生素活性，煮沸混合物時不能恢復抗生素活性。培養濾過物滅活albicidin的能力經過用蛋白酶K處理而消除。菌株SB1403的細胞提取物也引起albicidin的逐漸的和不可逆的失活(圖13)。這些觀察表明菌株SB1403以酶促解毒albicidin。分類鑑定菌株SB1403是革蘭氏陰性，杆形細菌(0.6-1.0μm×1.3-3.0μm)，具有4-8條外周鞭毛。在SP瓊脂上菌落為黃色。該菌株對於葡萄糖的氧化和酵解，β-半乳糖苷酶的生產，L-阿拉伯糖，纖維二糖，甘油，肌醇，麥芽糖，N-乙醯-D-葡糖胺，D-甘露醇，D-甘露糖，L-鼠李糖，蔗糖和海藻糖的代謝為陽性。在對苯丙氨酸脫氨酶，精氨酸二水解酶，鳥氨酸脫羧酶的試驗中，及丙二酸，D-阿東糖醇，乳糖，Lactulose，L-赤蘚糖醇，L-巖藻糖，松二糖，木糖醇，D-半乳糖醛酸內酯和N-乙醯-D-半乳糖胺的代謝為陰性。這些特徵使得鑑定菌株SB1403為Pantoeadispera(Gavtni等，1989，國際分類細菌學雜誌，39，337-345)。然而，菌株SB1403從棉子糖，山梨糖醇和α-甲基-D-葡萄苷產酸而不同於以前鑑定的P.dispersa菌株。以P.dispersaSB1403對白紋病的生物控制P.dispersa隨病原體同時施用到受傷的甘蔗上時對甘蔗白紋病黃單胞菌的生物控制非常有效(表8)。甘蔗品種Q44對白紋病高度敏感，用甘蔗白紋病黃單胞菌接種後在新生葉中形成嚴重症狀。用於本實驗的接種物濃度在2周內導致50％的接種的葉片玖死亡，在存活的葉片中平均有14條特徵性白色束狀紋佔據植物。在用P.dispersaSB1403共同接種的植物中，沒有葉片死亡，且白色束狀紋的頻率減少98％，即使在接種物中使用超出10倍的甘蔗白紋病黃單胞菌細胞。生物控制劑P.dispersaSB1403侵入受傷的甘蔗葉片而不引起任何所見的症狀或對接種的甘蔗植物的生長產生任何明顯的有害影響。接種6個月後，其存在於明顯健康的甘蔗植物幼莖組織中的群體比以水接種的對照的相似生物高103倍。甘蔗白紋病黃單胞菌易於從顯示白色束狀紋的接種葉中再分離。接種6個月後，超過90％的單獨用甘蔗白紋病黃單胞菌接種的植物死亡。相反，與生物控制劑共同接種的植物未形成系統白紋病症狀且即使在允許病原菌生長但不允許生物控制劑生長的含氨苄青黴素的SP培養基中也不能再分離出病原體。由於在甘蔗的機械收穫期間甘蔗白紋病黃單胞菌非常有效地傳播(Taylor等，1988，甘蔗，1988(4)，11-14)，經過同時應用P.dispersaSB1403提供高水平的生物控制劑對於限制野外病原菌的傳播有用。例如，可經過滴到根部切割器上或通過噴嘴噴到新切斷的殘株上可施用生物控制劑。相似地方法可用於機械收割機，它典型地是已裝配了一個噴灑或滴水系統以便在栽種前將殺真菌劑施用到基段的切口末端上。提供抗解澱粉歐文氏桿菌引起的火燒病(Vanneste等，1992，細菌學雜誌，174，2785-2796)或Leptosphaeriamaculans引起的黑腿病(Chakraborty等，1994，應用微生物學通訊，18，74-76)的生物控制的草生歐文氏桿菌菌株(syn.Pantoeaspp；Gavini等，1989，國際分類細菌學雜誌，39，337-345)產生對抗這些病原菌的抗微生物物質。P.dispersaSB1403不產生任何可檢測的有效抗大腸桿菌或甘蔗白紋病黃單胞菌的抗生素。相反，P.dispersaSB1403產生保護該生物控制劑抵抗由該病原菌產生的albicidin抗生素的解毒酶。由於已知albicidin在甘蔗白紋病黃單胞菌的致病性中起作用，因此albicidin解毒可不僅有助於P.dispersa在與甘蔗白紋病黃單胞菌的競爭中在作為最初侵入位點的傷口處形成菌落，而且經過去除為病原體建立和甘蔗中系統白紋病的形成所必需的albicidin植物毒素而保護植物。實施例3進一步的研究證實albicidin解毒酶在甘蔗白紋病黃單胞菌中表達效率的實驗將含草生歐文氏桿菌SB1403的完整albD基因(包括啟動子，結構基因和終止子區)的806bpSphI-PvuII片段鈍端化並連接進自殺載體pJP5603的HindII位點。連接產物用於轉化大腸桿菌JM109(Npir)。限制性酶消化和瓊脂糖凝膠電泳鑑定重組克隆pJPAldSP，將它轉移進遷移菌株S17-1(Npir)，並遷移進抗氨苄青黴素的甘蔗白紋病黃單胞菌XA3中。在含50μg/ml卡那黴素和200μg/ml氨苄青黴素的SP瓊脂培養基上選擇接合後菌落並試驗albicidin生產和AlbD酶的合成。遺傳修飾的表達albD的甘蔗白紋病黃單胞菌不能在敏感甘蔗上誘導疾病，而親本甘蔗白紋病黃單胞菌菌株誘導嚴重的症狀。這進一步支持了albicidin在致病性中的重要性及albD基因用於提供疾病抗性。進一步證實各種甘蔗品系對白紋病抗性的實驗修飾albD基因以用於在植物中表達，經顆粒轟擊將它導入白紋病敏感的甘蔗栽培品種Q63。已再生出用albD和NPT-II基因共同轟擊的超過60個的品系，其中大約半數表達毒素抗性基因。用甘蔗白紋病黃單胞菌攻擊來自用albD共同轟擊的34個品系及20個對照品系的植物。在對對照引起嚴重症狀(90％的感染率，在接種葉上每株植物平均有13條白色束狀紋，且許多植物迅速死亡)的條件下Teb轉基因品系顯示出無疾病症狀。這證實了albD在轉基因甘蔗中作為白紋病抗性基因的有效性。用albicidin解毒酶進行的實驗AlbD酶似乎是一種水解酶，有2個證據支持這一預測。首先，在失活的albicidin中發現純化的AlbD酶與純化的albicidin在水中結合。由於不需要輔助因子且在這些條件下其它已知激活機制不能工作，所以失活的方式指向水解。其次，以HPLC分析的滅活反應顯示出albicidin丟失且伴隨著代表反應產物的兩個峰的產生。同樣，該結果也指向水解反應。表1細菌菌株和質粒表2從甘蔗白紋病黃單胞菌感染的甘蔗植株中分離的細菌表3來自甘蔗的albicidin抗性細菌和其可能的抗性機制表3重量百分比(活性組分)表7來自甘蔗的albicidin抗性細菌及可能的抗性機制表8由P.dispersaSB1403*對甘蔗白紋病的生物控制<圖表說明表1*在albD基因克隆和測序中構建的質粒在圖2中顯示。表3*反應混合物的終濃度為500μ/ml，各處理一式三份。表4*每個處理有10株植物。接種後從4片新生葉中記錄症狀。X.a＝甘蔗白紋病黃單胞菌XA3，E.h＝草生歐文氏桿菌SB1403。X.a和E.h之後的數字代表細菌細胞數的相對比例，10＝4×108C.F.U(菌落形成單位)。每株植物的接種體積為200μL。表5*每次處理有6株植物，接種後從4片新生葉中記錄症狀。括號中的數字代表接種中使用的細菌細胞數的相對比例，10＝4×108C.F.U。每株植物的接種體積為200μl。表7*在頂部組中的菌株為具有已知抗性機制的對照(Birch等，1990，Basnayake和Birch，1995)。在本實驗中從染病的甘蔗分離出以SB開始命名的菌株。結果是三次重複的平均值。表8*對白紋病高度敏感的甘蔗品種Q44接種14天後記錄症狀。結果為在每次處理的10株植物中4片接種葉的總數。+接種物由含有所示比例的病原菌和生物控制劑的200μl體積組成，其中10等於4×108菌落形成單位。圖1以草生歐文氏桿菌SB1403的無細胞提取物解毒albicidin的時間過程。將含100μg總蛋白的變性的(煮沸5分鐘)和非變性的無細胞提取物加入含300ngalbicidin的終體積為100μl的TEMM緩衝液中，並在28℃保溫。經煮沸3分鐘終止反應。在生物測定前將反應混合物離心(14000rpm)5分鐘。圖2pQZBl03和其衍生物的物理圖譜。在線型化質粒圖譜兩端以空心盒代表克隆載體pBluescriptIISK+。除pQZB103和pQZH301外，以ExoIII單向缺失產生所有其它質粒。顯示了在大腸桿菌DH5α中編碼的各質粒的albicidin抗性或敏感性。圖3albD基因的核苷酸序列和其基因產物的預期胺基酸序列。還顯示了用於擴增編碼區及消除假(ATG)起始密碼子的PCR引物。圖4albD基因產物(A)的胺基酸序列與脫硝產鹼桿菌albB基因(B)和K.oxytocaalbA基因(C)所編碼的albicidin結合蛋白N端的前16個胺基酸的最佳匹配，符號雙點，相同胺基酸；單點，在其側鏈上具有相似特徵的胺基酸。圖5用於定點誘變草生歐文氏桿菌SB1403中的albD基因的自殺質粒克隆pJPAldHS的構建。(A)分離albD基因的內部HincII-StuI片段(以陰影顯示的AldHS片段，326bp)，顯示了其與ATG起始密碼子和TAG終止密碼子間的相對距離。(B)pJPAldHS的圖譜。將AldHS片段連接到自殺載體pJP5603的HincII位點，以HincII和BamHI限制性酶雙重消化測定pJPAldHS中AldHS片段的取向。圖6以大腸桿菌DH5α[pQZE533]和大腸桿菌DH5α[pSB6]滅活albicidin。質粒pQZE533和pSB6分別含從草生歐文氏桿菌SB1403克隆的albD基因和來自脫硝產鹼桿菌的albB基因。圖7用於純化albD酶蛋白質的GST-albD基因融合質粒的構建。(A)使用一對來自含草生歐文氏桿菌SB1403的完整albD基因的質粒克隆pQZE533的寡核苷酸引物經PCR擴增790bp的albD結構基因片段。5』引物覆蓋了albD基因的ATG起始密碼子(下面劃線)區，且含有一個錯配核苷酸C(以*表示)代替原始核苷酸G。3』引物跨越TAG終止密碼子下遊38bp的區域。示出了寡核苷酸引物上的BamHI和PvuII限制性酶位點。(B)用BamHI和PvuII消化PCR擴增的albD結構基因片段並連接到以BamHI和SmaI線型化的GST基因融合載體PGEX-2T上。顯示了融合區的序列並顯示了位點特異性蛋白酶凝血酶的裂解-識別序列。(C)GST-albD基因融合構建體pGSTALD的圖譜。圖8溫度對AlbD酶活性的影響。純化的AlbD酶和albicidin在0.2M磷酸緩衝液，pH7.0中混合，終濃度為2ng/μlAlbD酶和15u/μlalbicidin；反應混合物在預先設定為不同溫度的水浴中保溫30分鐘。經過煮沸3分鐘終止反應。測定殘留於反應混合物中的albicidin。符號空心柱，albicidin+AlbD；條紋柱，僅有albicidin的空白對照。使用DE52色譜進一步純化用於本實驗的albicidin。圖9pH對AlbD酶活性的影響，用於酶測定的條件在圖8的說明中描述，只是albicidin溶液在不同pH的磷酸緩衝液中製備。符號實心柱，ablicidin+AlbD；空心柱，僅含albicidin的空白對照。圖10(A)顯示正確取向的albD結構基因部分在啟動子Ptac控制下的所得質粒克隆pTacAld的圖譜。(B)PCR擴增的albD基因的編碼序列融合到tac啟動子上用於在大腸桿菌中表達AlbD酶。跨越起始密碼子(下面劃線)和終止區(TAG終止密碼子下遊38bp)的一對PCT引物用於使用質粒克隆pQZE533作模板擴增albD結構基因部分。以BamHI和PvuII消化790bpPCR產物，以KlenowDNA聚合酶鈍端化，然後連接到細菌表達載體pKK223-3的SmaI位點。圖11(A)甘蔗表達載體pU3Z的圖譜。在材料和方法部分已描述了構建方法。(B)從質粒克隆pQZE533擴增albD的編碼序列。用BamHI和PvuII消化PCR產物並連接到BamHI和SmaI線型化載體pU3Z。(C)所得的構建體pU3Zald的圖譜。圖12從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系(19個品系，每個品系重複2-10株植物)和未用albD轟擊的對照品系(9個品系，每個品系重複2-6株植物)中疾病嚴重性的頻率分布。實驗A，用甘蔗白紋病黃單胞菌XA3接種。圖13從用albD共同轟擊的愈傷組織再生的甘蔗栽培品種Q63植物品系(34個品系，每個品系重複2-10株植物)和未用albD轟擊的對照品系(20個品系，每個品系重複2-6株植物)中疾病嚴重性的頻率分布。實驗B，用甘蔗白紋病黃單胞菌XA15接種。權利要求1.一種能不可逆失活albicidin的分離的albicidin解毒酶。2.如權利要求1所述的分離的albicidin解毒酶，其中所說的酶是一種水解酶。3.如權利要求1所述的分離的albicidin解毒酶，其中所說的酶由圖3A中所示的胺基酸序列編碼。4.如權利要求1所述的分離的albicidin解毒酶，其中所說的酶是一種AlbD多肽同源物。5.如權利要求4所述的分離的albicidin解毒酶，其中所說的同源物從細菌獲得。6.如權利要求5所述的分離的albicidin解毒酶，其中所說的同源物從歐文氏桿菌或Pantoea屬菌株獲得。7.如權利要求1-6中任一項所述的albicidin解毒酶，其中所說的酶是重組酶。8.一種大幅度降低或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法，所說的方法包含給植物或其莖施用albicidin解毒酶的步驟。9.如權利要求8所述的方法，其中albicidin解毒酶包含權利要求1-7中任一項所述的酶。10.如權利要求8所述的方法，其中施用步驟的特徵在於栽種前浸泡植物的莖或插枝。11.如權利要求8所述的方法，其中施用步驟的特徵在於浸潤植物或其莖。12.如權利要求8所述的方法，其中所說的植物或其莖屬於甘蔗品種。13.一種編碼albicidin解毒酶的分離的核苷酸序列。14.如權利要求13所述的分離的核苷酸序列，其中所說的序列包括圖3B所示的完整核苷酸序列。15.如權利要求13所述的分離的核苷酸序列，其中所說的序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。16.如權利要求13所述的分離的核苷酸序列，其中所說的序列是albD同源物。17.如權利要求16所述的分離的核苷酸序列，其中所說的同源物可從細菌獲得。18.如權利要求17所述的分離的核苷酸序列，其中所說的細菌是歐文氏桿菌屬或Pantoea屬菌株。19.一種生產抗albicidin和白紋病的轉基因植物的方法，包括將編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列引入植物、植物部分或植物細胞並使其表達，且生長該植物、植物部分或植物細胞以產生轉基因植物的步驟。20.如權利要求19所述的方法，其中導入核苷酸序列的步驟經過粒子轟擊實現。21.如權利要求19所述的方法，其中該核苷酸序列包含權利要求13-18中任一項的核苷酸序列。22.如權利要求19所述的方法，其中該核苷酸序列包含圖3B中所示的完整核苷酸序列。23.如權利要求19所述的方法，其中該DNA序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。24.如權利要求19所述的方法，其中所說的植物、植物部分或植物細胞是從甘蔗品種獲得。25.一種轉基因植物，其具有穩定地摻入所說的植物的細胞內的編碼lbicidin解毒酶的DNA序列。26.如權利要求25所述的轉基因植物，其中所述的穩定摻入到植物細胞中的DNA序列提供了對植物毒素albicidin和白紋病對植物的感染的至少部分抗性。27.如權利要求25所述的轉基因植物，其中該核苷酸序列包含權利要求13-18中任一項的核苷酸序列。28.如權利要求25所述的轉基因植物，其中該核苷酸序列包含圖3B所示的完整核苷酸序列。29.如權利要求25所述的轉基因植物，其中該核苷酸序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。30.如權利要求25所述的轉基因植物，其中所說的植物是甘蔗品種。31.一種能產生albicidin解毒酶、用於治療被白紋病感染的植物和/或降低植物被白紋病感染的可能性的細菌。32.如權利要求31所述的細菌，其中所說的細菌是草生歐文氏桿菌菌株。33.如權利要求31所述的細菌，其中所說的細菌是如在優選的實施方案中給出的草生歐文氏桿菌SB1403。34.一種大幅度降低或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法，所說的方法包含給植物或其莖施用細胞外產生albicidin解毒酶的細菌的步驟。35.如權利要求34所述的方法，其中該細菌包含P.dispersa的一個菌株。36.如權利要求34所述的方法，其中該細菌表達編碼albicidin解毒酶的核苷酸序列。37.如權利要求36所述的方法，其中該核苷酸序列包含權利要求13-18中任一項的核苷酸序列。38.如權利要求36所述的方法，其中該核苷酸序列包含圖3B所示的完整核苷酸序列。39.如權利要求36所述的方法，其中該核苷酸序列包含圖3B的核苷酸1到核苷酸704。40.如權利要求34所述的方法，其中施用步驟由噴酒或滴加實現。全文摘要一種大幅度降低或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包括給植物或其莖施用albicidin解毒酶的步驟。還提供了生產對albicidin和白紋病具有抗性的轉基因植物的方法,包括將編碼albicidin解毒酶的核酸序列導入植物、植物部分或植物細胞並表達該核酸序列,生長該植物、植物部分或植物細胞以產生轉基因植物的步驟。還進一步提供了大幅度減少或抑制植物或其莖中白紋病形成的方法,所說的方法包括給植物或其莖施用胞外生產albicidin解毒酶的細菌的步驟。還進一步提供了能不可逆滅活albicidin的分離的albicidin解毒酶及編碼albicidin解毒酶的分離的核酸序列。文檔編號C12N9/14GK1200144SQ96197666公開日1998年11月25日申請日期1996年9月6日優先權日1995年9月7日發明者羅伯特·博奇,張煉輝申請人:昆士蘭大學