表達新城疫病毒np基因的重組t4噬菌體的構建及其應用的製作方法

2023-05-31 14:41:26 1

專利名稱：表達新城疫病毒np基因的重組t4噬菌體的構建及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及表達雞新城疫病病毒核殼蛋白基因(NP)的重組T4噬菌體的構建和應用。本發明進一步涉及重組T4噬菌體在新城疫病疫苗和新城疫病病毒抗體檢測中的應用。
背景技術：
新城疫病病毒(NDV)屬於副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)Avulavirus屬的模式種，它是雞新城疫病的病原。該病毒的基因組，由NP、P、M、F、HN、L六個蛋白基因組成。其中的NP(又有縮寫為N的)基因，由於其在基因組的RNA複製時起非常重要的作用，一直是多年來許多研究工作注重的焦點。
自首次在大腸桿菌中表達NDV的蛋白基因以來，NDV所有的蛋白基因，先後在各種表達系統中進行了表達。特別是NDV特主要NP基因，已先後在大腸桿菌、酵母等表達系統中進行了表達。但還沒有用噬菌體表達NDV結構蛋白的報導。 噬菌體表面展示技術(phage display)是1980年代發展起來的一項新的生物技術(Smith, 1985)，它能將表達的外源多肽和蛋白質以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，並保持相對獨立的空間構象和生物活性。T4噬菌體屬於有尾噬菌體中A群A2亞群的典型成員，其基本形態結構是頭長徑約95nm，橫徑約為65nm。 T4噬菌體衣殼由3種必需衣殼蛋白組成，主要的衣殼蛋白gp23和2個次要衣殼蛋白gp24， gp20。其中分子量為45kDa的gp23在每個病毒顆粒中有960個拷貝，而其餘2個次要衣殼蛋白拷貝數較少，gp24有55個拷貝，而gp20隻有12個拷貝。此外，在衣殼的外表面包被著2種非必需外殼蛋白分子量為9kDa的SOC和分子量為40kDa的HOC, 二者相距7nm，以對稱的形式分布於噬菌體二十面體表面。SOC和HOC僅提供噬菌體額外的穩定能力，是在噬菌體衣殼裝配完成後才組裝到衣殼表面的，它們的缺失不影響T4噬菌體的繁殖和感染。將外源蛋白與T4噬菌體表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，從而可以獲得具有外源蛋白的重組T4噬菌體。採用這樣的方法，獲得了表達愛滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰質炎病毒VPl(Ren et al，1996)、腦膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白的重組T4噬菌體。

發明內容
本發明的目的在於獲得表達雞新城疫病病毒核殼蛋白基因(NP)的重組T4噬菌體，為新城疫病疫苗的研製和新城疫抗體的檢測提供一種新的抗原。
本發明提供的重組T4噬菌體是採用基因重組的方法獲得的。其構建方法是
(l)NP基因的PCR擴增，其操作步驟如下 將pGEP-NP重組質粒作為PCR擴增模板，PCR反應體系為10 X PCR緩衝液10 ii L，10 XEnhancement緩衝液10 ii L， dNTP (各2. 5m mol/L) 810 ii L，上、下遊引物各410ii L，pfxDNA聚合酶1 ii L，用去離子水補足100 ii L。 PCR反應條件為94°C 5min ;94°C 50s，56°C 50s，72°C 90s，30個循環後，72t: 10min。取3 y L PCR樣品於10g/L瓊脂糖凝膠中電泳觀察。其餘PCR產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收(小量)試劑盒(購自上海華舜生物技術工程有限公司)回收純化PCR產物。 (2)將新城疫病病毒NP基因的cDNA片段插入pET30a質粒中，構建重組整合質粒pET30a-NP，其操作步驟如下 用Hind III和Not I在37t:分別消化NP基因的PCR產物和質粒pET30a，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的NP的PCR產物和質粒pET30a。用連接產物轉化大腸桿菌DH^。經Amp'抗性篩選，獲得插入了NP基因的重組子。參考NDV國內標準強毒株序列(F幼E9)，合成了 l對引物。NP-upper:5' -TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG—3'，NP-lower :5' -ATGCGGCCGCTCAATACCCCCATGT CG-3'進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LB培養基中，37°C ， 2000r/m振搖培養16_20h，抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得重組整合質粒pET30a-NP。 (2)用重組整合質粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌體T4-Z1 (Ren et al， 1996)進行
同源重組，獲得表達VP2蛋白的重組T4噬菌體，其操作步驟如下 用整合質粒pET30a-NP轉化大腸桿菌DH5a ，獲得的大腸桿菌為E_NP ;在裝入500iiL SC培養液的器皿中加入liiL氨卞青黴素(Amp)，後加入10iiL
E-NP，在37。C培養至光密度值0D6。。大約為0. 5時，加入50 y L T4-Z1，在35°C 200r/m振搖
培養至有細菌碎片出現，獲得的產物為未鑑定的重組T4噬菌體； 在1個經過滅菌的器皿中加入培養超過12小時的大腸桿菌DH^600 y L，不加溶菌酶，將在2-l(TC儲存的SC頂層培養基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45t:左右的時候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5。的器皿中，將混合液混勻，立即倒在平皿上，當瓊脂完全冷凝時，在SC頂層培養基上分別點10 ii L未鑑定的重組T4噬菌體，待吸收完畢後，放在37t:培養16小時以上如果E-NP中的質粒與T4-Z1發生了重組，成功地將NP基因轉入T4噬菌體中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑； 再在平皿上鋪SC頂層培養基，用滅菌牙籤把生長出的噬菌斑在SC頂層培養基上點梅花斑，放在37t:培養12小時以上，生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩衝液中6小時；用引物NP-5' -TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG-3'，從陽性梅花斑浸泡液中擴增到特異性條帶，則說明表達NP蛋白的重組T4噬菌體已獲得。
SC培養液按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加雙蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高壓滅菌20min後4。C保存。 SC底層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50。C，加入滅菌的50mLlmol/LHCl和10mL25X檸檬酸鈉 2H20溶液，搖勻後倒平板，4t:保存。
SC頂層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高壓滅菌20min，4t:保存。用時加熱溶解，冷卻至5(TC，加入滅菌的50mL lmol/L HC1和10mL25X擰檬酸鈉 2H20溶液，搖勻後備用。
表達新城疫病毒NP基因的重組T4噬菌體的特徵為 (1)重組T4噬菌體具有序列表中NP的核苷酸序列。由1747個鹼基對組成，是NDV主要結構蛋白NP的編碼基因，序列1和T4噬菌體soc基因組成融合基因，該融合基因位於重組T4噬菌體溶菌酶基因(e)和den V基因之間，該序列採用PCR方法可以擴增出特異性
4條帶。 (2)本發明提供的重組T4噬菌體還包括具有NP等同基因的T4噬菌體。NP等同基因，是與NP基因的核昔酸序列或胺基酸殘基序列相比有一個或若干個核昔酸或胺基酸殘基的差別，包括鹼基或胺基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與NP基因序列中的連續200鹼基以上的區段有80%以上的同源性。 本發明提供的重組T4噬菌體的一個應用，是將所述的重組T4噬菌體作為抗原，應用於包括但不限於AGP (瓊脂擴散試驗)、ELISA (酶聯免疫吸附試驗)，檢測雞血清中的NDV特異性抗體。 有益效果本發明具有明顯的優點和效果。提供的重組T4噬菌體易於純化，展示在T4噬菌體表面的NP蛋白具有完整的空間構象。由於S0C位點在T4噬菌體頭部表面具有960個拷貝，所以與S0C融合表達的NP蛋白的拷貝數高。由於NP蛋白分布於T4噬菌體頭部表面，因而T4噬菌體本身充當了 NP蛋白的載體，當本發明作為疫苗的抗原、或者作為免疫檢測的抗原使用時，和其它的蛋白表達系統表達的NP蛋白相比，本發明所述的重組T4噬菌體具有明顯的優點。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步說明 實施例1 :表達NP蛋白的重組T4噬菌體的構建
1 、 NP基因的PCR擴增 將pGEP-NP重組質粒作為PCR擴增模板，PCR反應體系為10 X PCR緩衝液10 ii L，10 XEnhancement緩衝液10 ii L， dNTP (各2. 5m mol/L) 810 ii L，上、下遊引物各410ii L，pfxDNA聚合酶1 ii L，用去離子水補足100 ii L。 PCR反應條件為94°C 5min ;94°C 50s，56°C 50s，72°C 90s，30個循環後，72t: 10min。取3 y L PCR樣品於10g/L瓊脂糖凝膠中電泳觀察。其餘PCR產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收(小量)試劑盒(購自上海華舜生物技術工程有限公司)回收純化PCR產物。
2、整合質粒pET30a-NP的構建 採用pET30a質粒構建重組整合質粒pET30a-NP。用Hind III和Not I在37"分別消化NP基因的PCR產物和質粒pET30a，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的NP的PCR產物和質粒pET30a。用連接產物轉化大腸桿菌DH5a 。轉化方法為CaCl2法。經Amp'抗性篩選，獲得插入了NP基因的重組子。然後用1對引物進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LB培養基中，37t:，200r/m振搖培養16-20小時。採用試劑盒抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得重組整合質粒pET30a-NP。
2、表達NP蛋白的重組T4噬菌體的獲得 用重組整合質粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌體T4-Zl(Ren et al，1996)進行同源重組，獲得表達NP蛋白的重組T4噬菌體。先用整合質粒pET30a-NP轉化大腸桿菌DH5a，獲得的大腸桿菌為E-NP。然後進行以下操作。 在裝入500iiL SC培養液的器皿中加入liiL氨卞青黴素(Amp)，後加入10iiLE-NP，在37。C培養至光密度值0D6。。大約為0. 5時，加入50 y L T4-Z1，在35°C 200r/m振搖培養至有細菌碎片出現，獲得的產物為未鑑定的重組T4噬菌體；
在1個經過滅菌的器皿中加入培養超過12小時的大腸桿菌DH^600 y L，不加溶菌 酶，將在2-l(TC儲存的SC頂層培養基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45t:左右的時候 取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5。的器皿中，將混合液混勻，立即倒在平皿上，當瓊脂完全冷凝 時，在SC頂層培養基上分別點10 i！ L未鑑定的重組T4噬菌體，待吸收完畢後，放在37t:培 養16小時以上如果E-NP中的質粒與T4-Z1發生了重組，成功地將NP基因轉入T4噬菌體 中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長出噬菌斑； 再在平皿上鋪SC頂層培養基，用滅菌牙籤把生長出的噬菌斑在SC頂層培養基上 點梅花斑，放在37t:培養12小時以上，生長良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡 在磷酸緩衝液中6小時；用引物NP-5' -TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG-3'，從陽性梅花斑浸泡 液中擴增到特異性條帶，則說明表達NP蛋白的重組T4噬菌體已獲得。
SC培養液按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone和5g NaCl，加雙蒸水 定容至1000mL， 151pf/in2高壓滅菌20min後4。C保存。 SC底層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone， 5g NaCl和12g 瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50。C，加入滅菌的50mL lmol/LHCl和10mL25X檸檬酸鈉 2H20溶液，搖勻後倒平板，4t:保存。
SC頂層培養基按下列方法配製每1000mL中含有10g Tryptone， 5g NaCl和7g 瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL， 151pf/in2高壓滅菌20min，4t:保存。用時加熱溶解，冷卻至 5(TC，加入滅菌的50mL lmol/L HC1和10mL25X擰檬酸鈉 2H20溶液，搖勻後備用。
實施例2 :用重組T4噬菌體作為抗原檢測雞血清中ND抗體 以重組T4噬菌體為包被抗原，建立檢測ND抗體的ELISA方法。將重組T4噬菌體 稀釋為1X107ml，每孔加入100iiL稀釋的重組T4噬菌體，4t:放置12小時以上。用清洗緩 衝液(PBS，pH7. 2，含0.05%吐溫20)洗3次後，每孔加入100M1 5%的脫脂奶粉/PBS) 37°C 放置2h。用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100i!L 1 : 100稀釋的ND陽性血清，37t:反 應lh。再用清洗緩衝液洗3次後，每孔加入100i! L適當稀釋的辣根過氧化酶標記的鼠抗 雞IgG抗體，37t:反應lh。每孔加入反應底物100 ii L，室溫觀察顏色變化。在10-30min時 達到顯色高峰。每孔加入100iiL終止液(lmol/L !^04)，終止顯色反應，在酶標儀上讀取 0045。值。該方法具有良好的特異性。用該方法檢測雞新城疫(ND)特異性血清、雞腦脊髓炎 (AE)特異性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)特異性血清、雞傳染性喉氣管炎(ILT)特異性血 清、禽流感(AI)特異性血清，無交叉反應性。對採自現場的92份ND陽性血清的檢測結果 與IDEXX公司的ND ELISA試劑盒檢測結果的相關性為95% 。
權利要求
含有新城疫病病毒核殼蛋白基因(NP)的重組T4噬菌體的構建方法，其特徵在採用基因重組的方法獲得的，其方法是用Hind III和Not I在37℃分別消化NP基因的PCR產物和質粒pET30a，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的NP基因的PCR產物和質粒pET30a，用連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經Amp′抗性篩選，獲得插入了NP基因的重組子，然後用1對通用引物進行PCR篩選；對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL。LB培養基中，37℃，200r/m振搖培養16-20小時，抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得含有新城疫病病毒核殼蛋白基因(NP)的重組整合質粒pET30a-NP；用重組整合質粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌體T4-Z1進行同源重組，獲得表達NP蛋白的重組T4噬菌體。
2. 含有新城疫病毒NP的重組T4噬菌體，其特徵在於(1) 重組T4噬菌體具有序列表中NP的核苷酸序列，由1747個鹼基對組成，是NDV主要結構蛋白NP的編碼基因，序列1和T4噬菌體soc基因組成融合基因，該融合基因位於重組T4噬菌體溶菌酶基因(e)和den V基因之間，該序列採用PCR方法可以擴增出特異性條帶。(2) 本發明提供的重組T4噬菌體還包括具有NP等同基因的T4噬菌體。NP等同基因，是與NP基因的核昔酸序列或胺基酸殘基序列相比有一個或若干個核昔酸或胺基酸殘基的差別，包括鹼基或胺基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與NP基因序列中的連續200鹼基以上的區段有80%以上的同源性。
3. 含有新城疫病病毒NP蛋白的重組T4噬菌體的應用，是將所述的重組T4噬菌體作為抗原，應用於包括但不限於AGP、ELISA，檢測雞血清中的ND特異性抗體。
全文摘要
本發明提供了一個表達雞新城疫病毒核殼蛋白基因(NP)的重組T4噬菌體，該重組T4噬菌體具有新城疫病毒核殼蛋白基因(NP)的核苷酸序列和NP蛋白的胺基酸殘基序列。NDVF48E9國內標準強毒株及質粒pET30a均由哈爾濱獸醫研究所禽傳染病研究室保存。NDV F48E9國內標準強毒株NP基因的重組質粒pGFP-NP由哈爾濱獸醫研究所禽傳染病研究室構建。本發明還涉及重組T4噬菌體具有檢測雞血清中ND抗體的用途。
文檔編號C12N15/63GK101760467SQ20081015433
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者李旭東, 王小娥, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司