一種咪唑‑4‑乙酸的生物合成方法與流程

2023-05-31 18:29:31 3

本發明涉及生物化學工程領域，尤其涉及一種咪唑-4-乙酸的生物合成方法。

背景技術：

咪唑-4-乙酸(imidazole-4-aceticacid,iaa)是一種重要的咪唑衍生物。它是中樞神經系統內主要抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，gaba)的構象限制性類似物，具有安眠、降壓和抗氧化等藥理作用。與此同時，咪唑-4-乙酸也被用來合成蛋白酶抑制劑、孕尿翳受體抗結劑、以及抗癌化合物等。此外，iaa還可以通過其自身的羧基基團、咪唑基團與過渡態金屬形成配位化合物。最近，iaa也被用來製備咪唑修飾的殼聚糖納米顆粒，而這種顆粒被認為是良好的sirna藥物載體。

目前，商業化的iaa都是通過化學合成法製備獲得；例如：α-羥基-β-咪唑基-4丙酸氧化法(knoop,beitraegezurchemischenphysiologieandpathologie,1907,10,119；pymanf.l.,anewsynthesisof4(or5-)-β-aminoethylglyoxaline,oneoftheactiveprinciplesofergot.journalofthechemistrysocietytransactions,1911,99:668)和4-腈甲基咪唑水解法(pymanf.l.,anewsynthesisof4(or5-)-β-aminoethylglyoxaline,oneoftheactiveprinciplesofergot.journalofthechemistrysocietytransactions,1911,99:668)等。但是，上述化學合成法的反應條件苛刻、原料成本高、產物複雜且環境汙染大。

因此，開發高效、低成本且環境友好的iaa製備方法具有重要的現實意義。

技術實現要素：

本發明針對上述現有技術中的不足，提供一種咪唑-4-乙酸的生物合成方法，該方法反應條件溫和、無需使用有機溶劑和有毒試劑且底物轉化率高。

本發明提供了一種咪唑-4-乙酸的生物合成方法，包括以下步驟：

(1)以l-組氨酸為底物，在膜聯l-胺基酸脫氨酶的催化下，進行脫氨反應，得到含有中間產物3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的反應液；

(2)向所述反應液中加入過氧化氫溶液，進行反應，反應結束後，得到咪唑-4-乙酸。

上述生物合成過程如式(1)所示：

在於自然界中，胺基酸脫氨酶主要以分泌型形式存在，而來源於proteus,providencia,morganellas等細菌的胺基酸脫氨酶則是與細胞膜進行偶聯。與分泌型l-胺基酸脫氨酶相比，膜聯l-胺基酸脫氨酶具有易於異源表達，不產生對細胞和酶有毒產物的特點，更適於工作催化的應用。

作為優選，所述膜聯l-胺基酸脫氨酶的胺基酸序列的登陸號為baa90864。該膜聯l-胺基酸脫氨酶來源於普通變形桿菌iam12003(proteusvulgarisiam12003)，其序列登陸號為baa90864，該特定序列的酶對於側鏈集團較大的胺基酸如組氨酸、酪氨酸和異亮氨酸等具有較好的催化活力。該基因序列可以通過pcr擴增得到或者化學合成得到。

進一步地，所述脫氨反應中的催化劑為表達膜聯l-胺基酸脫氨酶的工程菌。膜聯胺基酸脫氨酶必須與細胞膜偶聯才能發揮其完整催化效力，如果離開細胞膜游離表達便會喪失部分功能。

本發明通過常規的基因工程技術先合成普通變形桿菌iam12003(proteusvulgarisiam12003)的l-胺基酸脫氨酶的基因序列，再將合成的基因連入表達載體，構建重組表達載體，將重組表達載體轉入宿主細胞中，得到所述工程菌。

進一步地，所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌；其中，所述大腸桿菌可以為大腸桿菌(e.coli)bl21、大腸桿菌(e.coli)blr、大腸桿菌(e.coli)origami、大腸桿菌(e.coli)、bl21plyss、大腸桿菌(e.coli)novablue或大腸桿菌(e.coli)rosetta。

更進一步地，所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌rosstta(de3)。通過對比轉化有pet28-laad的不同大腸桿菌如bl21(de3)，origami(de3)等的催化活力，發現以大腸桿菌rosstta(de3)為宿主的重組工程菌表達活性較高。所述表達載體可以為pet-28a、pet-29、pet-30、pet-32、prset等。更優選，所述表達載體為pet28a。

進一步地，以細胞乾重計，反應液中所述工程菌的密度為0.1～1.5g/l，底物濃度為10～150mm；進一步地，所述底物濃度為50～100mm。

作為優選，所述脫氨反應的ph值為6.0～11.0；更優選，所述ph值為8.0。

作為優選，所述脫氨反應的溫度為10～60℃；更優選，所述溫度為30～45℃。

進一步地，步驟(2)中，所述過氧化氫在反應液的終濃度為0.1～2％，反應時間為1～60min。更優選，所述過氧化氫在反應液的終濃度為1％，反應時間為10min。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明提供了一種新的咪唑-4-乙酸的生物合成方法，該方法通過膜聯l-胺基酸脫氨酶和過氧化氫的連續作用，將組氨酸轉化為咪唑-4-乙酸。本發明方法步驟簡單，反應條件溫和，原料來源廣泛、生物催化劑易於製備、設備要求低，底物轉化率高，且不需要使用有機溶劑和有毒試劑，相對於現有的化學法具有高效、成本低和環境友好的特點。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限制本發明的範圍。

實施例1膜聯l-胺基酸脫氨酶工程菌的構建

根據普通變形桿菌iam12003膜聯l-胺基酸脫氨酶的基因序列(其序列登陸號為baa90864)，進行全基因合成，通過bamhi和xhoi的酶切位點，將合成基因(laad)連入pet20(b)+中，轉化大腸桿菌dh5α菌株，篩選陽性克隆，得到重組質粒pet20b-laad。此外，通過ncoi和bamhi的酶切位點，將laad基因連入pet28a(+)中，轉化大腸桿菌dh5α菌株，篩選陽性克隆，得到重組質粒pet28a-laad。

將兩種重組質粒轉化rosstta(de3)，其中rosstta(de3)/pet20b-laad表達的laad帶有pelb信號肽，採用保守分泌途徑(conservedsecretorypathway)進行細胞周質表達，而rosstta(de3)/pet28a-laad採用自身帶有的雙精氨酸轉運信號肽(twin-argininetranslocationpathway)進行細胞周質表達。發現兩種重組菌的催化活力相當，但rosstta(de3)/pet28a-laad的可以獲得更高的生物量。將重組質粒pet28a-laad用常規方法轉化入其它大腸桿菌表達系統如大腸桿菌bl21(de3)、bl21(de3)plyss等。其中以大腸桿菌rosstta(de3)為宿主的重組工程菌表達活性較高。

實施例2利用膜聯l-胺基酸脫氨酶工程菌合成咪唑-4-乙酸

具體步驟如下：

(1)從活化的lb固體培養基上挑取工程菌(e.colirosstta(de3)/pet28a-laad，單克隆菌體接入含卡那黴素(50μg·ml-1)的lb液體培養基中，37℃，200r/min振蕩培養過夜，獲得種子液。

(2)將種子液按體積分數2％接種量接種到含有卡那黴素(50μg·ml-1)的lb培養基，置於37℃，200r/min培養至od6000.6時，加入iptg，使iptg終濃度為0.5μm，30℃，150r/min誘導培養6h。

(3)離心收集工程菌菌體，棄上清，用0.2mm磷酸緩衝液(ph7.5)清洗菌體。將清洗後的工程菌加入到含50mml-組氨酸的磷酸緩衝液(0.2mm，ph7.5)中，溶液中菌體的密度為0.5g/l(細胞乾重)。將反應液置於37℃，200r/min的條件下培養15h，待l-組氨酸完全轉化，獲得含有3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的溶液。

(4)向製備的3-(4-咪唑)-2-氧丙酸溶液中加入終濃度為1％的h2o2，反應10min，得到含量為22.3mm的咪唑-4-乙酸溶液，組氨酸到咪唑-4-乙酸的轉化率達46％。

實施例3利用膜聯l-胺基酸脫氨酶工程菌合成咪唑-4-乙酸

將實例2步驟(3)中反應液的l-組氨酸濃度調整為100mm，其它條件不變。37℃，200r/min的條件下培養37h，獲得含有3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的溶液。向該溶液中加入1％的h2o2，反應10min，得到含量為35.6mm的咪唑-4-乙酸溶液，組氨酸到咪唑-4-乙酸的轉化率達37％。