用於保存器官、生物組織或者活細胞的培養基的製作方法
2023-06-22 01:39:56
專利名稱：用於保存器官、生物組織或者活細胞的培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及保存活細胞的技術領域。更精確地，本發明的目的是發明一種保存活器官、生物組織和細胞尤其是活的人角膜的新型培養基。
在器官移植領域，為了將器官移植給受體而從供體取下器官時，需要一種能夠維持器官生活力以便移植成功的保存培養基。實際上，此過程經常需要多種培養基。具體而言，以人角膜為例，一般使用的培養基包括
-一種將角膜從供體機構轉移至培養機構以及將角膜從培養機構轉移至移植機構的運輸培養基，
-一種保存培養基。通常在4℃或者31℃保存。該培養基必須保證在培養基保存期間即約4至5周內細胞的生活力得到最佳保存，並在質量(內皮測試)和無菌性(細菌學、血清學和病毒學測試)方面具最大安全性，以及
-一種去腫脹地培養基，該培養基在移植前約24小時使用，目的是減少角膜的厚度並且使角膜透明化。
目前使用的上述培養基大多數包含動物來源的成分胎牛血清白蛋白、諸如運鐵蛋白、胰島素等動物來源蛋白質。
由於這些培養基中動物來源成分的存在，所以難以保證它們在朊病毒病尤其是克-雅病上的醫學安全性。此外，這些培養基易受傳染性介質汙染，而且不具有能夠完全重複生產的組合物。
在本文中，本發明的目的在於提供一種保存活細胞生活力的新型保存培養基。
本發明的另一目的是提供一種依靠所含成分而降低造價的培養基。
根據本發明的保存培養基同樣必須在質量和無菌方面具有最大安全性。
此外，本發明具有能夠由完全合成的成分來製備的優勢，即可以通過重組以及化學合成製得，所以本發明無免疫原性，並且不被傳染性介質汙染。因此，根據本發明的保存培養基具有能夠成批次重複生產的精確組合物。
更精確地，本發明涉及一種包含液體營養基質的用於活器官、生物組織和細胞的保存培養基，其中所述培養基包含高分子量透明質酸和氯化鈉，並且不包含動物來源成分。
本發明的目的還有此類培養基在用作活器官、生物組織和細胞尤其是活的人角膜的保存、器官培養、細胞培養、運輸以及去腫脹中的用途。
活生物器官、細胞和組織的意思是指人或動物來源的成分，包括活成纖維細胞、內皮細胞、和/或上皮細胞。
本發明的保存培養基能夠作為輔助治療產品進行描述。
根據本發明的保存培養基包含旨在保護內皮細胞和周圍組織的粘彈性物質(VES)。具體而言，這些粘彈性物質是高分子量的透明質酸。
高分子量的透明質酸，即分子量大於或者等於1百萬道爾頓的透明質酸，可以是動物來源(尖銳溼疣提取物或者臍帶血液)、細菌來源(取自鏈球菌培養物)、或者植物來源。當然，由於根據本發明的保存培養基中沒有動物來源成分，所以該培養基包含植物來源的高分子量的透明質酸。具體而言，本發明的保存培養基用小麥的高分子量透明質酸製備，該小麥透明質酸以商品名為Cristalhyal的粉末形式或者以商品名為Vitalhyal的1％水溶液形式銷售，這兩種產品均來自Laboratoire Bomann(GroupeSoliance)，而且其分子量等於或者大於106道爾頓並且在20℃時Brookfield粘度是1500釐泊。
根據本發明的保存培養基還包含作為擬晶體的氯化鈉。氯化鈉的功能主要是防止透明質酸沉澱，也參與維持溶液的摩爾滲透壓濃度。
具體而言，根據本發明的保存培養基包含
-80-4000mg/l、優選100-200mg/l、優選100-160mg/l的高分子量透明質酸，和
-4500-9000mg/l、優選5500-9000mg/l、優選7000mg/l的氯化鈉。
有利地，根據本發明的培養基將包含普羅沙姆(poloxamer)188，具體而言，普羅沙姆188具有增加培養基粘度的功能。
普羅沙姆188，也被稱為Pluronic F68和LutrolF68，是分子量為7680-950g/mol的聚氧乙烯-聚氧丙烯多聚體序列，並且通式是
HO-(CH2-CH2-O)x-[CH2-CH(CH3)-O]y-(CH2-CH2-O)x-H
其中x近似等於79，y近似等於28。
當所述培養基旨在用於器官去腫脹以及活組織、細胞的運輸和保存以及特別是人角膜移植時，在根據本發明的培養基中存在普羅沙姆188是尤其有利的。根據本發明的培養基將包含優選地為200-75000mg/l、優選地為450-50000mg/l的普羅沙姆188。
目前市場上旨在用於角膜去腫脹的保存培養基包含葡聚糖。葡聚糖的功能是減少角膜的厚度，因而能夠用在根據本發明的培養基中使角膜去腫脹。然而，普羅沙姆188也能夠減少角膜的厚度，並且其細胞毒性更小，所以普羅沙姆188比葡聚糖更加優選。
根據本發明的保存培養基能夠包含的另一VES是甲基纖維素。甲基纖維素是植物來源，並且可以從棉花植絨或者木漿來源的纖維素纖維獲得。所得纖維素纖維用苛性鈉溶液處理以便與二氯甲烷發生醚化反應。置換反應程度在1.64至1.92之間，該值對應每個葡糖苷單位甲氧基化置換物的數量。具體而言，為了製備本發明的保存培養基，可以使用SEPPIC以商品名Metolose SM 400銷售的甲基纖維素，其Brookfield粘度為4000釐泊(20℃下，以2％的濃度溶於水)、分子量為86000道爾頓。根據本發明的培養基將包含優選地為210-5000mg/l、優選地為1900-2500mg/l、優選地為2205mg/l的甲基纖維素。
所用VES能夠使細胞通過保持水而發生水合作用，進而表現出對周圍細胞和組織的一定的粘著性或附著性，從而保證了對所述周圍細胞和組織抵抗化學腐蝕和空氣毒性效應的保護作用。
根據本發明的保存培養基同樣包含在活細胞保存領域更常用的其它成分。
具體而言，本保存培養基包含在器官和細胞培養物保存培養基中經典使用的液體化學營養基質。值得注意的參考文獻是「Le technoscope debiofutur」，第133期，1944年4月，3-16頁，其中給出的營養基質包含
-胺基酸，在細胞新陳代謝中起提供氮和碳的作用。一些細胞除了需要13種必需胺基酸外還需要特異的胺基酸(例如淋巴樣細胞需要絲氨酸)；
-糖，儘管當需要限制乳酸積累時可以用半乳糖代替葡糖糖，但廣泛使用的糖是葡萄糖；
-維生素，基本上是B族維生素，認為其中8種是必需的；
-離子，以平衡的鹽溶液形式提供，在維持膜電位和滲透壓上發揮重要作用，同時也是許多酶促反應的輔因子；
-痕量金屬，似乎發揮越來越重要的作用，尤其是在精確的培養基中進行培養時微量金屬的作用越來越重要。最重要的金屬是硒、鎘和鋰。
此類型的基質能夠用這些多種組成成分製備。也有一些液體和固體形式的商品化化學營養基質固體形式必須在水中重新配製。具體應用的有IMDM(伊思考夫改良杜爾貝可培養基(Iscove’s modified Dulbecco’smedium)，參考文獻Iscove，N.N.和Melchers(1978)J.of Exp.Med.147923-933)、來自Stainers，C.P.等人Nature New Biol.230，52(1971)的MEM Alpha、來自Click等人Cell.Immunol.3，264(1972)的Click RPMI、來自Parker，R.C.等人Special Publications，N.Y.Academy of Sciences，5，303，(1957)的CMRL1066培養基、來自Leibovitz，A.，Am.J.Hyg.78，173(1963)和Morton，H.J.，In vitro，6，89(1970)的Leibovitz L15培養基、來自Morgan，J.F等人Proc.Soc.Exp.Biol.Med.73，1(1950)的M199培養基和來自Barnes，D.和Sato，G.Anal.Biochem.102，255(1980)的DMEM/HAM F12培養基、包含多種維持細胞和組織生活力必需物質的液體營養基質、尤其是多種痕量元素、胺基酸、維生素、電解質、穩定pH值的緩衝液、pH指示劑(例如酚紅)以及葡萄糖或者半乳糖(L15)。痕量元素的意思是指除NaCl外的以微量或者略大量存在的所有金屬無機鹽。
因此根據本發明的保存培養基很方便地包含主要通過所用營養基質提供的胺基酸、痕量元素、維生素、電解質和穩定pH值的緩衝液。如果所用基質不包含足量的上述元素，那麼可以補充加入所述元素。
根據本發明的保存培養基方便且獨立地包含1-50mg/l硫酸軟骨素、0.1-25mg/l硫酸乙醯肝素、500-2000mg/l藻酸和1000-10000mg/l羥乙基澱粉。
當保存培養基用於人角膜移植時，該培養基將優選地包含在房水中存在的各種成分，如乳酸鈉、醋酸納、檸檬酸鈉、抗壞血酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、丙酮酸鈉和氯化鈣。
根據本發明的保存培養基以非常有利的方式獨立或者聯合包含
·0.01-350mg/l維生素，優選下列物質
-維生素E乙酸鹽
-維生素A乙酸鹽
-氫醌
-維生素C
-維生素B1-HCl
-維生素B2
-維生素B5
-吡哆醛HCl B6
-生物素B8
-葉酸B9
-維生素B12
-煙醯胺B3 PP
-乳清酸鉻B13
·0.01-650mg/l痕量元素，優選下列物質
-CaCl2，2H2O
-KCl
-CaH2PO4.2H2O
-NaH2PO4.H2O
-NaHCO3
-MgCO3.7H2O
-MgSO4.7H2O
-FeSO4.7H2O
-CuSO4.5H2O
-MnCO3.4H2O
-MnCl2.4H2O
-Na2SiO3.9H2O
-H2SeO3
-NH4VO3
-(NH4)6Mo7O24.4H2O
-SnCl2.2H2O
-ZnSO4.7H2O
-氧化鋅
-NiCl2.6H2O
·0.005-150mg/l核苷，優選下列物質
-腺苷
-胞苷
-脫氧腺苷
-脫氧胞苷
-脫氧鳥苷
-鳥苷
-尿苷
-胸苷
·800-4000mg/l胺基酸，
·500-9000mg/l單糖，優選葡萄糖和/或半乳糖，
·其它元素，總濃度0.001-75000mg/l，其中具體是
-醋酸納(3H2O)
-檸檬酸鈉
-乳酸鈉
-丙酮酸鈉
-葡萄糖酸亞鐵
-亞硒酸鈉
-普羅沙姆188
-油酸
-亞油酸
-亞麻酸
-棕櫚酸
-吐溫80。
根據本發明的保存培養基可以是液體或者半固體形式。其具有足夠支持細胞保護的粘度。有利地，根據本發明的保存培養基在20℃時的Brookfield粘度介於1和15釐泊(cps)之間，優選地在2.5和10cps之間。因此，由於粘度原因根據本發明的保存培養基是非注射的。
根據本發明的培養基的摩爾滲透壓濃度同樣重要，具體而言，該數值介於300-465mOsm±40之間。培養基的摩爾滲透壓濃度具體取決於NaCl的濃度。當根據本發明的培養基用於保存或者運輸時，其摩爾滲透壓濃度將有利地在300-360mOsm±40之間的範圍；當根據本發明的培養基旨在用於去腫脹時，其摩爾滲透壓濃度將有利地介於350-465mOsm±40之間。目前市場上的保存培養基的摩爾滲透壓濃度低於上述值。能夠提供用於運輸、保存和去腫脹的單一培養基是本發明的一個優點。
根據本發明的保存培養基通過混合多種成分進行製備。優選地，為了提高透明質酸在液體生物營養基質中的溶解度，將其先和氯化鈉混合，然後加入到已包含甲基纖維素的營養基質中。
根據本發明的保存培養基不包含動物來源的成分。的確，在一個方面，與迄今所用的大多數保存活器官、生物組織和活細胞的培養基相反，根據本發明的培養基既不包含胎牛血清白蛋白、乳鐵蛋白、運鐵蛋白、胰島素，也不包含其它動物來源的蛋白質。而且，所用的高分子量透明質酸和甲基纖維素在合成時不使用動物來源的原材料。因此這種保存培養基無疑符合法國公共健康法(French Public Health Code)第L.1263-1條款所定義的輔助治療產品的法規。無動物來源成分的保存培養基的使用使得提高所保存細胞的醫學安全性成為可能。
根據本發明的保存培養基能夠用於活器官、生物組織和細胞尤其是活的人角膜的保存、器官培養、細胞培養、冷凍、運輸以及去腫脹。具體而言，根據本發明的保存培養基能夠在介於-196℃和37℃的溫度範圍內使用。
根據本發明的保存培養基可以根據預期應用進行調整。
例如，如果根據本發明的培養基旨在用於外科手術前的去腫脹，那麼該培養基將有利地包含濃度為200-75000mg/l、優選450-50000mg/l的普羅沙姆188。
如果培養基旨在用於冷凍活細胞，那麼將用具有低溫防護作用的二甲基亞碸(DMSO)替換該培養基中的部分水。
下列實施例對本發明進行舉例說明，但不作任何限制。下列實施例使用了Laboratoire Bowman(Groupe Soliance)以商品名Cristalhyal銷售的粉末形式的透明質酸、SEPPIC以商品名Metolose SM 4000銷售的甲基纖維素和Sigma Aldrich銷售的NaCl。實施例1-3(保存培養基)具有74％體積的IMDM基質，實施例4-7(去腫脹培養基)則具有88％體積的IMDM基質。
摩爾滲透壓濃度用Fisher Bioblock Scientific銷售的滲透壓力計按照參照M85501進行測量(通過按鍵自動調零[蒸餾水]並校對標準[300mOsm/kg]；反應時間1分鐘)。
粘度用Fisher Bioblock Scientific銷售的粘度計按照參照M57571用低粘度適配器從1cps的參照M57510開始測量(同時顯示速度、選擇的流動相、以cps和百分數範圍表示的粘度以及溫度；與Brookfield兼容；流動相直接插入樣品中)。
實施例1實施例1培養基有利地用於運輸和保存。
高分子量透明質酸 100mg/l
甲基纖維素2205mg/l
NaCl 6985mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度394mOsm
粘度 5cps(Brookfield，20℃)
實施例2實施例2培養基有利地用於運輸和保存。
高分子量透明質酸 100mg/l
甲基纖維素2205mg/l
NaCl 5585mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度372mOsm
粘度 5cps(Brookfield，20℃)
實施例3實施例3培養基有利地用於運輸和保存。
高分子量透明質酸 160mg/l
普羅沙姆188 2205mg/l
NaCl 5585mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度305mOsm
粘度 1.5cps(Brookfield，20℃)
實施例4實施例4培養基有利地用於去腫脹。
高分子量透明質酸 100mg/l
甲基纖維素2205mg/l
葡聚糖50000mg/l
NaCl 6895mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度694mOsm
粘度 10cps(Brookfield，20℃)
實施例5實施例5培養基有利地用於去腫脹。
高分子量透明質酸 100mg/l
甲基纖維素2205mg/l
葡聚糖50000mg/l
NaCl 5585mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度585mOsm
粘度 10cps(Brookfield，20℃)
實施例6實施例6培養基有利地用於去腫脹。
高分子量透明質酸 160mg/l
葡聚糖50000mg/l
NaCl 5585mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度595mOsm
粘度 8.5cps(Brookfield，20℃)
實施例7實施例7培養基有利地用於去腫脹。
高分子量透明質酸 160mg/l
普羅沙姆188 50000mg/l
NaCl 5585mg/l
胺基酸1838mg/l
痕量元素 5390mg/l
葡萄糖4500mg/l
碳水化合物1167mg/l
核苷 10mg/l
維生素163mg/l
脂肪酸酯 46mg/l
緩衝液8982mg/l
pH7.3
摩爾滲透壓濃度376mOsm
粘度 5cps(Brookfield，20℃)
材料和方法
保存順序
科學用人角膜(捐贈給科學的器官)在供體死後24小時之內獲得。為了維持來自同一供體的兩個角膜的相似性，供體不能進行過眼內外科手術。進行角膜摘除之後，將此對角膜分別浸入50ml運輸培養基中。所用培養基或者是參照培養基(Inosol，Chauvin-Opsia/Baush和Lomb，Toulouse，法國)或者是根據本發明的培養基(實施例1-3)。立即將包含上述角膜的密封燒瓶置於31℃的乾燥箱中。在於器官培養基中保存的第二天，根據下文描述的過程測定內皮細胞密度(ECD)。然後將角膜重新浸沒於新的100ml燒瓶中的同種類型培養基中，並用縫合線使之懸浮以避免角膜與燒瓶壁及沉積在燒瓶底部的沉澱接觸。保存14天後，將角膜轉移至新的100ml燒瓶中。保存30天後(這是歐洲的最大推薦保存期限)，進行一次新的ECD測定，並且計算在前述保存期內細胞的損失率。然後將角膜浸沒於50ml「去腫脹」培養基中以減少角膜厚度。所用培養基或者是Exosol(Chauvin-Opsia/Baush和Lomb)，或者是根據本發明的對應50000mg/l葡聚糖或者50000mg/l普羅沙姆188的培養基(實施例4-7)。48小時後，同一對角膜的兩個角膜並排放置在8條逐漸變粗的黑線的背光方格網上進行照相。該照片作為角膜透明度的記錄。角膜厚度通過超聲測厚儀(TomeyAL-2000，Tokyo，日本)在頂點處測量得到。為了將細胞膜染色，與pH4.5的磷酸鹽緩衝液中的4％茜素紅(sigma)孵育，孵育45秒後進行第三次ECD測定。由於其具有細胞毒性，這種非致死性著色只能在保存結束時使用。
整個方法的實施是在不告知保存培養基性質的情況下進行的。
確保盲法分析的方法
將兩種保存和去腫脹培養基包裝在相同的容器中(125ml的Nalgene燒瓶)，並由既不參與保存也不參與ECD測定的人員進行數字標記。基於隨機化表格的計數系統根據不同燒瓶上的數字來鑑別培養基。
ECD測定方法
在用BSS(平衡的鹽溶液，Alcon，Kaysersberg，法國)衝洗角膜之後，用0.4％的臺盼藍(sigma)覆蓋內皮1分鐘，然後用0.9％的氯化鈉衝洗4分鐘。
隨後在與Gain P.等人在Br J Ophthalmol 2002，86，306-11頁和531-6頁描述的角膜內皮鑲嵌分析儀(endothelial mosaic analyzer)樣機連接的光學顯微鏡下放大10倍對該角膜內皮進行觀察。採集10個不同區域的內皮圖象，並存於計算機硬碟上以便將來分析。每次分析包括300個以上的細胞。
結果
供體特徵
供體是年齡在57-90歲之間的6名女性和10名男性，平均年齡74.4歲。從死亡到角膜摘除之間的延遲時間介於4.5-44小時，平均延遲時間為20小時。
結果
總損失百分數Opsia培養基30.5，根據本發明的實施例1和4的培養基17.3。
總損失百分數Opsia培養基30.2，根據本發明的實施例2和5的培養基17.2。
總損失百分數Opsia培養基38，而根據本發明的實施例3和6的培養基7.6。
總損失百分數Opsia培養基31.5，而根據本發明的實施例3和7的培養基20.8。
討論
總結本研究，發明者開發了一種無任何動物來源成分的精確培養基，該培養基能夠保證30天以上的內皮存活力顯著高於用角膜銀行所使用的參照培養基獲得的結果。這一點至關重要，因為獲得了平均數幾乎是16.9％的額外的內皮細胞增加量，其結果使得保存質量大大提高。該增加量使得受體擁有高於迄今可能的內皮保存率(endothelial reserve)。對受體而言，該保存率意味著對並發事件(外傷、免疫排斥、眼內手術)更強的抵抗力，也意味著移植體保持透明的時間的增加。
基於所得到的結果，普羅沙姆188的細胞毒性低於葡聚糖。
權利要求
1.包含液體營養基質的用於活器官、生物組織和細胞的保存培養基，其中所述培養基包含高分子量透明質酸和氯化鈉並且所述培養基不包含動物來源的成分。
2.根據權利要求1所述的保存培養基，其中所述培養基包含
-80-4000mg/l、優選地100-200mg/l、優選地100-160mg/l的高分子量透明質酸，和
-4500-9000mg/l、優選地5500-9000mg/l、優選地7000mg/l的氯化鈉。
3.根據權利要求1或2所述的保存培養基，其中所述培養基還包含普羅沙姆188。
4.根據權利要求3所述的保存培養基，其中所述培養基包含200-75000mg/l、優選地450-50000mg/l的普羅沙姆188。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的保存培養基，其中所述培養基還包含甲基纖維素。
6.根據權利要求5所述的保存培養基，其中所述培養基包含210-5000mg/l、優選地1900-2500mg/l並且優選地2205mg/l的甲基纖維素。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的保存培養基，其中所述培養基具有300-465mOsm±40mOsm的摩爾滲透壓濃度。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的保存培養基，其中所述培養基在20℃下具有1-15釐泊、優選地2.5-10釐泊的Brookfield粘度。
9.根據權利要求1-8中任意一項所述的保存培養基，其中所述培養基包含痕量元素、胺基酸、維生素和穩定pH的緩衝液。
10.根據權利要求1-9中任意一項所述的保存培養基，其中所述培養基不包含葡聚糖。
11.根據權利要求1-10中任意一項所述的保存培養基的用途，其用於保存活的人角膜。
12.根據權利要求1-10中任意一項所述的保存培養基的用途，其用於活器官、生物組織和細胞尤其是活的人角膜的器官培養。
13.根據權利要求1-10中任意一項所述的保存培養基的用途，其用於活器官、生物組織和細胞尤其是活的人角膜的運輸。
14.根據權利要求1-10中任意一項所述的保存培養基的用途，其用於活器官、生物組織和細胞尤其是活的人角膜的去腫脹。
全文摘要
本發明涉及保存器官、生物組織或者活細胞的培養基，其包含液體營養基質，並以包含高分子量透明質酸和氯化鈉且無動物來源成分為特徵。
文檔編號C12N5/08GK1816279SQ200480019120
公開日2006年8月9日 申請日期2004年3月23日 優先權日2003年7月4日
發明者D·利卡裡, E·貝爾託 申請人:斯塔姆阿爾法公司