用於測定高半胱氨酸的方法

2023-06-22 19:55:31 2

專利名稱：:用於測定高半胱氨酸的方法
技術領域：
：本發明一般涉及高半胱氨酸檢測領域。特別是，本發明提供一種測定樣品中高半胱氨酸(Hcy)的存在或濃度的方法，其中在通過Hcy轉化酶催化的Hcy轉化反應中將高半胱氨酸與Hcy共底物反應以形成Hcy轉化產物和Hcy共底物轉化產物，和評估Hcy共底物轉化產物以確定樣品中Hcy的存在和/或濃度。本發明還提供了基於相同原理測定高半胱氨酸的試劑盒。發明背景體液如血漿或血清中的高半胱氨酸的總濃度是疾病的重要標誌。例如，高半胱氨酸定量可以是心血管病重要的風險指標，可以是鈷胺素和葉酸缺乏的靈敏標誌，並且可以用於診斷稱為高胱氨酸尿症的代謝的先天缺陷。高半胱氨酸定量也已經報導有效用於評估孕婦中的出生缺陷和老年人的認知損傷。參見Frantzen，等，EnzymeConversionImmunoassayforDeterminingTotalHomocysteineinPlasmaorSerum,ClinicalChemistry44:2,311-316(1998)。高半胱氨酸(Hcy)是在S-腺苷甲硫氨酸-依賴性甲基轉移反應過程中由甲硫氨酸形成的含硫醇的胺基酸。胞內Hcy被再甲基化為甲硫氨酸，或者在一系列反應中不可逆地代謝形成半胱氨酸。胞內Hcy被輸出到胞外流體如血液和尿中，並且大多以氧化的形式循環，主要與血菜蛋白質結合(Refsum，等，Annu.Rev.Medicine,49:31_62(1998))。血菜和尿中的Hcy的數量反映了Hcy生產和利用之間的平衡。該平衡可被各種臨床狀態所擾亂，所述臨床狀態其特徵在於參與Hcy轉硫作用和再甲基化的酶(例如，胱硫醚β-合酶和N5』1(1_亞甲基四氫葉酸還原酶)的遺傳病或參與Hcy代謝的維生素類(例如維生素B6,B12和葉酸)的飲食缺乏(Baual，等，ClevelandClinicJournalofMedicine,64543-549(1997))另外，血漿Hcy水平還可能被一些用於治療癌症或關節炎的藥物如抗葉酸藥物(例如甲氨蝶呤)所擾亂(Foody，等，ClinicianReviews,8203-210(1998))—些高半胱氨酸血症病例是由編碼參與Hcy代謝的酶的基因的純合缺陷所導致。在這些病例中，參與Hcy再甲基化或轉硫作用的酶的缺陷導致血液和尿中Hcy高達50倍的升高。這種病症的典型形式，先天性高半胱氨酸血症(Hcyemia)，是由編碼胱硫醚β-合酶(CBS)的基因的純合缺陷所導致。這些個體在早年患有血栓栓塞併發症，其導致中風，心肌梗死，腎血管性高血壓，間歇性跛行，腸繫膜局部缺血，和肺栓塞。這些患者還可能顯示智力遲鈍和其它類似於晶狀體異位和骨骼畸形的異常(PerryΤ.，HomocysteineSelectedaspectsinNyhamW.L.ed.Heritabledisordersofaminoacidmetabolism.NewYork,3JohnWiley&Sons，pp.419-451(1974))。還已知孕婦中升高的Hcy水平與具有神經管閉合的兒童出生缺陷有關(Scott，等，〃Theetiologyofneuraltubedefects"inGraham,I.,Refsum,H.,Rosenberg,I.H.,andUrelandP.M.ed."Homocysteinemetabolismfrombasicsciencetoclinicalmedicine"KluwerAcademicPublishers,Boston,pp.133-136(1995))。因此，Hcy測定的診斷應用已經在這些臨床病症中很好地證明。已經顯示即使是輕微或適度升高的Hcy水平也增加了冠狀動脈、腦動脈和外周動脈的動脈粥樣硬化和心血管病的風險(Boushey，等，JAMA，2H=1049-1057(1995))。在患有腦血管病、外周血管病和心血管病的患者中，高半胱氨酸血症的發病率據顯示分別為42%，28%，和30%(Moghadasian，等，Arch.Intern.Med.,1572299~2307(1997))027項臨床研究的meta-分析計算表明，Hcy水平每增加5μΜ,男人和女人的冠狀動脈病的風險分別增加60%和80%，其相當於血漿膽固醇增加ZOmg/dr1(0.Smmol/dr1)，提示Hcy作為風險因子在一般人群中與膽固醇一樣強大。這些臨床研究的結果得出結論，即高半胱氨酸過高血症是心血管疾病的一個新出現的獨立的風險因子，並且可以解釋所有不具有任何確立的心血管風險因子(例如高血壓，高膽固醇血症，吸菸，糖尿病，顯著肥胖和身體不活動)的心血管患者中的一半。輕度高半胱氨酸血症主要是由酶缺陷的雜合性造成的。亞甲基四氫葉酸還原酶的基因的一種常見多態性似乎影響高半胱氨酸水平對葉酸缺乏的敏感性(Boers，等，J.Inher.Metab.Dis.,20301-306(1997))此外，血漿高半胱氨酸水平還在以下患者中顯著升高心臟和腎臟移植患者(Ueland，等，J.Lab.Clin.Med.，114:473_501(1989))，阿爾茨海默氏病患者(Jacobsen，等，Clin.Chem.,M=2238-2239(1998)),以及非胰島素依賴型糖尿病患者(Ducloux，等，N印hrol.Dial.Transplantl，叢2890-2893(1998))。將升高的高半胱氨酸與心血管病聯繫在一起的證據的積累已經促使開始雙盲、隨機和安慰劑對照的多中心臨床試驗以證明降低血漿Hcy在預防或阻止血管病的進展中的功效(Diaz-Arrastia,等，Arch.Neurol.,551407-1408(1998))。血漿高半胱氨酸水平的測定應當是一項常規的臨床實踐。作為心血管病的風險因子，已經在臨床設置中推薦測定總血漿Hcy水平(還原型，氧化型和結合蛋白的)(Hornberger，等，AmericanJ.ofPublicHealth,8861-67(1998))自從1982年，已經描述了幾種測定總血漿Hcy的方法(Mansoor，等，Anal.BioChem.，200218-229(1992)；Steir,等，Arch.Intern.Med.，迴1301-1306(1998)；Ueland,等，Clin.Chem.，巡1764-177901993)；禾ΠUeland,等，「Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease"inFrancis,R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease,Hemostasis,andEndothelialFunction.NewYork,MarcelDokker,pp.183-236(1992)；還參見Ueland,等，"Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease"inFrancis,R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease,Hemostasis,andEndothelialFunction.NewYork,MarcelDokker,pp.183-236(1992))。血漿或血清中總Hcy的測定由於70%的血漿Hcy是蛋白結合的和20_30%作為游離的對稱或大多不對稱的混合二硫化物而存在的事實而變得複雜。游離的還原型Hcy僅痕量存在(Stehouwer，等，KidneyInternational,55308-314(1999))大多數方法需要複雜的色譜技術如HPLC，毛細管氣相色譜法，或質譜分析(GC/4MS)以直接或間接(例如通過SAH水解酶將Hcy酶促轉化為SAH(S-腺苷高半胱氨酸)，接著HPLC或TLC分離)測量Hey。也已經使用在TLC分離前通過SAH水解酶將Hcy放射酶促轉化為放射性標記SAH。在這些測定中，色譜分離是這些方法中共同的關鍵步驟，而色譜分離通常是耗時並且實行起來繁重。更具體地，這些方法要求高度專業化和複雜的儀器和訓練有素的分析專家。這些儀器的使用通常沒在常規臨床實驗室實踐中廣泛接受。還已知針對Hcy的免疫測定，其使用針對SAH的單克隆抗體(Araki，等，J.Chromatog.,42243-52(1987))0這些測定是基於Hcy向SAH的轉化，然後通過單克隆抗體檢測SAH。已經開發了針對清蛋白結合的Hcy的單克隆抗體以用於測定清蛋白結合的Hcy(Stabler,等，J.Clin.Invest.,81:466_474(1988))，清蛋白結合的Hcy是總血漿Hcy的主要級分。還可以獲得其它免疫學工具(參見例如U.S.專利號.5，631，127，5，827，645，5，958，717，6，063，581和5，885，767)。儘管免疫測定避免了耗時的色譜分離步驟並且適合自動化，但是單克隆抗體的生產是昂貴的和有點無法預測的，並且通常需要第二或甚至第三抗體來檢測。最近，已經報導了高半胱氨酸測定的酶促方法(Matsuyama，等，ClinicalChemistry,￡72155-2156(2001)；Tan等，ClinicalChemistry,491029-1030(2003)；U.S.專利號5，885，767，5，998，191，6，046，017，6，174，696，6，436，658和6，664，073B1)，所有這些描述的高半胱氨酸測定基於通過高半胱氨酸轉化酶生成的高半胱氨酸轉化產物的評估。在美國專利號6，686，172和美國專利申請公開號2002/0119507中描述了用於檢測樣品中的高半胱氨酸的其它方法。需要一種有效而準確的測定方法，其能夠在不需要高度熟練的技術人員或複雜分析化學儀器的情況下實行。本發明解決了本領域中的上述和其它相關問題。發明概述一方面，本發明涉及一種關於樣品中高半胱氨酸的測定方法。按照該測定方法，在Hcy轉化反應中將含有或懷疑含有高半胱氨酸(Hcy)的樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸以形成Hcy轉化產物和Hcy共底物轉化產物；和評估Hcy共底物轉化產物以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。在本發明的一些實施方案中，在沒有色譜分離的情況下評估Hcy共底物轉化產物。在一些實施方案中，Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，Hcy轉化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶，所述Hcy轉化產物是甲硫氨酸(Met)並且所述Hcy共底物轉化產物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，評估SAH以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。可以以任何適當形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應生產SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產SAM。SAH可以轉化為Hcy和腺苷(Ado)，評估Ado以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。在一些實施方案中，SAH與SAH水解酶接觸以由SAM生成Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶循環至所述Hcy轉化反應中以形成基於Hcy共底物的酶循環反應體系，評估所述Ado以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。5[0021]可以通過本領域已知的任何適當方法如免疫學方法或酶促方法來評估Ado。可以直接或間接評估Ado。例如，可以通過腺苷轉化酶評估腺苷轉化的共底物或反應產物來間接評估Ado。在一些實施方案中，腺苷轉化酶是腺苷激酶，反應產物是腺苷5'-—磷酸。在其它實施方案中，腺苷轉化酶是腺苷脫氨酶並且反應產物是銨和肌苷。在一方面，本發明涉及一種測定樣品中的高半胱氨酸(Hcy)的方法，該方法包含a)在Hcy轉化反應中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸以形成Hcy轉化產物和Hcy共底物轉化產物，其中所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶，所述Hcy轉化產物是甲硫氨酸(Met)並且所述Hcy共底物轉化產物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，和b)評估所述SAH以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量，其中在沒有色譜分離的情況下評估所述SAH。可以以任何適當形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應生產SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產SAM。可以通過本領域已知的任何適當方法如免疫學方法或酶促方法來評估SAH。例如，可以通過評估SAH和突變型SAH結合酶之間的結合來評估SAH，所述突變型SAH結合酶如對Hcy、SAH或腺苷具有結合親和力但具有減弱的催化活性的突變型SAH水解酶。在一個實施例中，SAH的評估不包括生成H2O2的酶促反應和H2O2的檢測。在另一個實施例中，可以通過使用與SAH特異性結合的抗體來評估SAH。抗體可以是單克隆的或多克隆的。抗體還可以與載體基質結合。可以使用任何適當的免疫測定形式，例如夾層和競爭性測定形式。本發明的方法可以用於測定任何樣品中的高半胱氨酸，所述樣品包括但不限於體液或生物組織。所述體液可以選自由下列各項組成的組尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，和羊膜液。在一些實施方案中，所述體液是血液。在一些實施方案中，所述血液樣品被進一步分成血漿或血清級分。在一些實施方案中，在所述樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸之前或同時，將樣品中氧化的或偶聯的Hcy轉化為還原型Hcy。在一些實施方案中，將樣品進行適當量的二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)_膦鹽酸鹽(TCEP)或其它還原劑的處理，以在樣品中生成游離的高半胱氨酸。本發明的方法可以另外包含以下步驟去除在將樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸之前或同時用於將氧化的或偶聯的Hcy轉化為還原型Hcy的還原劑。例如，通過加入N-乙基馬來醯亞胺或其它硫(thio)-反應化合物可以去除還原劑。本發明還有另一方面涉及用於確定樣品中高半胱氨酸的存在或濃度的試劑盒，該試劑盒包含a)Hcy轉化酶；b)Hcy共底物；和c)用於評估Hcy共底物轉化產物的試劑。在一些實施方案中，所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶，所述Hcy共底物轉化產物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，並且用於評估Hcy共底物轉化產物的試劑是用於評估SAH的試劑。在一些實施方案中，試劑盒另外包含一種試劑，例如SAH水解酶，以由SAM生成Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶循環至所述Hcy轉化反6應中以形成基於Hcy共底物的酶循環反應體系。本發明還提供一種測定樣品中Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S_腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；c)SAH水解酶；和d)用於評估腺苷(Ado)的試劑。用於評估Ado的試劑可以是不同於SAH水解酶的腺苷轉化酶，如腺苷激酶和腺苷脫氨酶。本發明還提供了一種測定樣品中Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶；b)S_腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；和c)用於評估SAH的試劑，其中所述試劑盒不包含用於生成H2O2的酶或試劑和用於檢測H2O2的試劑。在一些實施方案中，本發明的試劑盒另外包含還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或TCEP。本發明的試劑盒可以是任何適當的包裝並且還可以包括實施本文所述方法的使用說明。試劑盒可以任選地包括另外的組分如緩衝劑。本文所述的測定可以用於任何適當的目的，例如預後，診斷，藥物篩選或治療監視目的。測定可以容易地自動化。另外，測定可以適用於護理系統點(pointofcaresystem)和家庭檢測試劑盒。例如，可以調整護理系統的血液檢測點以使用本文提供的方法測量高半胱氨酸水平。家庭檢測試劑盒還可以適用於與本文提供的方法使用。附圖簡述圖1舉例說明了例舉性的高半胱氨酸的測定方法。Hcy:L_高半胱氨酸；SAM:S_腺苷甲硫氨酸；HMTase=SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶；和SAHase=S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶。圖2描繪了在實施例1中所述的實驗中獲得的血清高半胱氨酸劑量反應曲線。圖3描繪了例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定與在CobasMira分析儀上進行的Catch高半胱氨酸測定之間的比較。圖4描繪了例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定與在BeckmanSynchronCX-7分析儀上進行的Catch高半胱氨酸測定之間的比較。發明詳述為了公開內容清楚且並非為了限制，將本發明的詳細描述分成以下幾個分部。A.定義除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。本文所引的所有專利、申請、公開的申請和其它出版物通過參考完整地結合於此。如果本部分闡明的定義與通過參考結合於此的所述專利、申請、公開的申請和其它出版物中闡明的定義相反或否則不一致，本部分闡明的定義優先於通過參考結合於此的定義。如本文所用，「一種(a)，，或「一種(an)，，是指「至少一個」或「一個或多個」。如本文所用，「高半胱氨酸(Hcy)」是指具有下列分子式的化合物HSCH2CH2CH(NH2)COOH0在生物學上，Hcy是通過將甲硫氨酸脫甲基化生成的並且是由甲硫氨酸生物合成半胱氨酸中的中間體。術語「Hey」包含游離的Hcy(還原型)和偶聯的Hcy(氧化型)。Hcy可以與蛋白質、肽、其本身或其它硫醇類通過二硫鍵偶聯。7[0050]如本文所用，「高半胱氨酸(Hcy)轉化反應"是指其中化合物與Hcy分子反應的反應，期間化學基團(例如甲基)從化合物轉移到Hcy分子上而形成反應產物。與Hcy分子反應且提供化學基團的化合物被稱為「高半胱氨酸(Hcy)共底物」。催化反應的酶被稱為「高半胱氨酸(Hcy)轉化酶」。含有整個或部分原始Hcy分子的反應產物被稱為「高半胱氨酸(Hcy)轉化產物」。不含有來自於原始Hcy分子的任何元件的反應產物被稱為「Hey共底物轉化產物」。如本文所用，「SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶」是指催化由高半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)形成甲硫氨酸和S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的酶。意欲包含具有保守的胺基酸替代的SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶，所述保守的胺基酸替代不實質上改變其活性。如本文所用，「SAH水解酶」是指遍在的真核生物酶，其也在一些原核生物中發現，催化SAH向腺苷(Ado)和Hcy的水解。SAH水解酶還催化由Ado和Hcy形成SAH。SAH水解酶的輔酶是NAD+/NADH。SAH水解酶可以具有幾種催化活性。在水解方向上，第一步包括通過酶結合的NAD+(E-NAD+)將SAH的3『-羥基基團氧化(3『-氧化活性)，接著通過L-Hcy的β-消除以提供3'-酮基-4'，5'如本文所用，術語「評估」意欲包括在獲得樣品中存在的分析物(例如高半胱氨酸或Ado)的量或濃度的絕對值和另外在獲得指示樣品中分析物水平的指標、比率、百分比、直觀的或其它值的意義上的定量和定性測定。評估可以是直接或間接的並且實際檢測的化學物質當然不需要是分析物本身，而可以例如是其衍生物或一些另外的物質。如本文所用，「腺苷脫氨酶」是指催化腺苷脫氨基形成肌苷的酶。意欲包括具有保守胺基酸替代的腺苷脫氨酶，所述保守的胺基酸替代不實質上改變其活性。如本文所用，「腺苷激酶」是指催化由腺苷和ATP形成腺苷5』-一磷酸和ADP的酶。意欲包括具有保守胺基酸替代的腺苷激酶，所述保守的胺基酸替代不實質上改變其活性。如本文所用，「血清」是指在去除血纖蛋白凝塊和血細胞以後獲得的血液的流體部分，其區別於循環血中的血漿。如本文所用，「血漿」是指血液的流體、非細胞部分，其區別於在凝固後獲得的血清。如本文所用，「通過重組方法生產」是指使用重組核酸方法的生產方法，該方法依賴於公知的分子生物學方法以表達由克隆的核酸編碼的蛋白質。如本文所用，「流體」是指可以流動的任何組合物。流體因此包含半固體、膏狀物、溶液、水性混合物、凝膠、洗液、乳膏形式的組合物和其它這些組合物。如本文所用，「樣品」是指可以含有分析物的任何事物，期望針對該分析物進行分析測定。樣品可以是生物樣品，如生物流體或生物組織。生物流體的實例包括尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，羊膜液等。生物組織是細胞的聚集體，通常是特定種類的細胞和它們的胞間物質一起，形成人、動物、植物、細菌、真菌或病毒結構的一種結構物質，包括結締組織，上皮組織，肌肉組織和神經組織。生物組織的實例還8包括器官，腫瘤，淋巴結，動脈和單個細胞。如本文所用，「疾病或病症」是指生物體中由例如感染或遺傳缺陷所導致的病理狀況，其特徵在於可識別的症狀。如本文所用，「抗體」不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(如Fab,Fab',F(ab')2，Fv)，單鏈(ScFv),diabody，由抗體片段形成的多特異性抗體，其突變體，包含抗體部分的融合蛋白，和包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的其它任何改進構型。抗體包括任何種類的抗體，如IgG，IgA，或IgM(或其亞類)，抗體不需要是任何具體類別。B.測定高半胱氨酸的方法本發明提供測定樣品中的高半胱氨酸(Hcy)的方法，該方法包含a)在Hcy轉化反應中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸以形成Hcy轉化產物和Hcy共底物轉化產物；和b)評估所述Hcy共底物轉化產物以確定所述樣品中所述Hcy的存在、不存在和/或數量。在一些實施方案中，在沒有色譜分離的情況下評估Hcy共底物轉化產物。在一些實施方案中，Hcy轉化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶。當將SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶用作Hcy轉化酶時，Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，Hcy轉化產物是甲硫氨酸(Met)，Hcy共底物轉化產物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)，且評估SAH以確定所述樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。可以使用將甲基基團從SAM轉移至Hcy的任何S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶。例如，可以使用Shapiro和StanleyK(MethodsEnzymo1.17Pt.B,SulfurAminoacids,pp.400—405(1971))禾口ShapiroSK(Biochim.Biophys.Acta.29405-9(1958))所述的S-腺苷甲硫氨酸L_高半胱氨酸S-甲基轉移酶。還可以使用由具有下列GenBank登記號AF297394的核酸編碼的高半胱氨酸S-甲基轉移酶(EC2.1.1.10)和具有下列GenBank登記號的胺基酸序列AAG10301，CAA16035,NP_856132,NP_302039,CAD97346，T51939，T51941和CAC30428。優選地，可以使用來源於大腸桿菌的SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶(Thanbichler等，J.Bacteriol.,181(2)662~5(1999))或來源於酵母菌的SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶(Shapiro等，J.Biol.Chem.,239(5)1551-6(1964)和Thomas等，JBiol.Chem.,275(52)40718-24(2000))可以以任何適當形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應生產SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產SAM。可以使用本領域已知的任何方法評估SAH。例如，可以使用與SAH特異性結合的抗體來評估SAH。抗體可以是單克隆的或多克隆的。與SAH特異結合的抗體的實例在美國專利號5，631，127和6，063，581中描述。使用本領域已知的方法也可以生產對SAH特異性的抗體，所述方法例如在美國專利5，631，127和6，063，581中描述的方法。使用SAH特異性的抗體，可以將任何免疫學測定用於檢測SAH，例如在溶液中或在固體載體上的競爭性或夾層測定，沉澱/聚集測定。在一些實施方案中，通過將與SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶反應的樣品在SAM的存在下，與SAH特異性抗體和與不同於SAH的抗體的可檢測的半抗原接觸來評估SAH，其中測定SAH的存在或數量是通過確定或者與所述抗體結合或者未與所述抗體結合的所述可檢測的半抗原的存在或數量來間接進行9的。在一些實施方案中，所述抗體與載體基質結合。還可以使用突變型SAH水解酶評估SAH，該突變型SAH水解酶具有對SAH的結合親和力但是具有減弱的催化活性。這些突變型SAH水解酶和使用突變型SAH水解酶的測定方法在美國專利號6，376，210和W003/060478中描述。SAH還可以如下評估通過SAH水解酶將SAH轉化為腺苷和Hcy，並且評估生成的腺苷。在一些實施方案中，SAH與SAH水解酶接觸以由SAM生成Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶循環至所述Hcy轉化反應中以形成基於Hcy共底物的酶循環反應體系，評估所述Ado以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。在一些實施方案中，本發明提供一種用於測定樣品中的高半胱氨酸的方法，該方法包含a)如果存在於樣品中，使用甲基供體(例如S-腺苷甲硫氨酸(SAM))和SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶將高半胱氨酸甲基化，以形成甲硫氨酸和S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)；b)從所述形成的SAH中釋放腺苷(Ado)並使用酶S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶生成高半胱氨酸；和c)評估所述釋放的Ado以確定所述樣品中高半胱氨酸的存在和/或數量。該方法可以另外包括測量Ado隨時間的釋放量。優選地，循環步驟a)和b)以釋放所述Ado，其釋放速率可以與樣品中的高半胱氨酸的濃度相關聯。還優選地，Ado的釋放速率與標準的高半胱氨酸的濃度值相關聯。可以使用任何適當的甲基供體和甲基轉移酶。例如，甲基供體可以是SAM並且甲基酶可以是SAM-依賴性高半胱氨酸甲基轉移酶。優選地，所述甲基供體SAM是以至少約5μM的濃度提供。Ado形成的速率可以使用任何適當的方法測量。例如，Ado形成的速率可以用酶法測量。優選地，Ado形成的速率是使用以下酶測量的Ado脫氨酶，穀氨酸脫氫酶，嘌呤核苷磷酸化酶，黃嘌呤氧化酶，過氧化物酶，腺苷激酶，或這些酶的任何兩項或多項的組合。這些測定方法在本文中進一步描述。可以以任何適當形式使用SAM。例如，將SAM直接加入樣品。在另一實施例中，通過另外的反應生產SAM，例如通過SAM合酶由ATP和Met生產SAM。可以使用任何SAH水解酶。例如，可以使用含有GenBank登記號為M61831-61832的核苷酸序列的核酸分子以獲得編碼SAH水解酶的核酸(參見Coulter-Karis和Hershfield,Ann.Hum.Genet.,53(2)169-175(1989))。還優選地，含有核苷酸序列或編碼在美國專利號5，854，023中描述的胺基酸的核酸分子可以用於獲得SAH水解酶。可以使用各種還原劑(例如DTT，TCEP，半胱氨酸，巰基乙醇，二硫赤蘚糖醇，硼氫化鈉等)，然而DTT是特別適當的，例如濃度為約5mM。DTT本身應當貯存在低pH下，因此測定試劑盒可以便利地包括低PH(例如約3)、但是具有低緩衝能力的DTT溶液和分開的SAH-水解酶溶液，其在基本上中性pH下可以部分或完全無活性並且優選是緩衝過的。當這些溶液合併時，酶在中性PH下被再活化。如果需要該合併可以在試驗樣品的存在下進行，或者試驗樣品在其後不久加入。以上提及的其它還原劑可以類似地用於SAH-水解酶的穩定化/活化。TCEP可以貯存在中性pH下，這允許酶與還原劑包括在相同試劑中。Ado可以通過本領域已知的任何適當方法評估，所述方法如免疫學方法或酶促方法。可以使用通常依賴於光度計(例如比色、分光光度計或螢光)檢測的方法和免疫學方法，因為這些可以特別容易地適用於臨床實驗室使用。還可以使用基於酶促反應或與單-或多-克隆抗體的反應的方法，因為這些方法簡單和快速並且實行起來相對便宜。例如，通過監視與酶的反應可以評估Ado，該酶將其直接或間接轉化為可以用光度計(例如分10光光度計法)檢測的產物。適當的酶當然應當不與高半胱氨酸轉化酶的其它底物(特別是高半胱氨酸)反應，該適當的酶包括腺苷脫氨酶(其將腺苷轉化為肌苷)和腺苷激酶(其將腺苷和ATP轉化為ADP和磷酸化腺苷)。這些酶可以另外與用於將形成的產物轉化為另外的可檢測的產物的其它酶組合。因此，用於本發明測定的例舉性的Ado檢測方案包括腺苷一FPIA檢測+螢光標記的腺苷(1)腺苷一肌苷+NH3(2)α-酮戊二酸+NH3+NAD(P)H—L-穀氨酸+NAD(P)+(2a)肌苷一次黃嘌呤(2bl)次黃嘌呤+O2—黃嘌呤+H2O2(2b2)黃嘌呤+O2—尿酸+H2O2(2b3)2H202+4-AA(氨基安替比林)+T00S(N-乙基-N_(2_羥基_3_磺基丙基)_間-甲苯胺)—醌染料+4H20(2b4)腺苷+ATP—腺苷-5'-P+ADP(3)磷酸烯醇丙酮酸+ADP+H+—丙酮酸+ATP(3a)丙酮酸+NADH—乳酸+NAD+(3b)在方案(1)中，進行免疫測定，可以檢測螢光標記的腺苷。在方案(2)中，通過腺苷脫氨酶催化反應，腺苷脫氨酶反應生成的氨可以容易地使用已知方法例如比色技術檢測。因此，例如在樣品中生成的氨可以反應形成有色產物，其形成可以通過分光光度計法檢測。在方案(2a)中，通過L-穀氨酸脫氫酶催化反應，可以在340nm下用分光光度計法檢測NAD(P)+。在方案(2bl)中，通過嘌呤核苷磷酸化酶催化。在方案(2b2)和(263)中，通過黃嘌呤氧化酶催化反應。在方案(2b4)中，通過過氧化物酶催化反應。肌苷和尿酸具有不同的UV吸收性質，因此可以用分光光度計法通過動態測量監視。然而，尿酸或肌苷的UV檢測的使用具有某些限制，因為該方法的靈敏性是相當差的並且其需要UV-光源和UV-透明的樣品容器。因此可以更便利地依賴於550nm處的醌染料的比色檢測。備選地，在方案(2b)中；黃嘌呤氧化酶反應使得其本身使用螢光團或生色團例如氧化還原指示劑檢測，該檢測通過評估還原/氧化電勢或通過測量O2消耗，或者更具體地測量H2O2形成，例如通過使用電子傳感器進行。許多氧化_還原指示劑可以用於該目的，在文獻中描述了各種各樣的方法用於測定溶液中的H2O2和02。實際上，在臨床測定中經常檢測H202。例如過氧化氫也可以使用peroxioxalate和吖啶鐺酯的非酶促化學發光反應來評估，後者在中性PH下在水溶液中。在方案(3)中，通過腺苷激酶催化反應。在方案(3a)中，通過丙酮酸激酶催化反應。在方案(3b)中，通過乳酸脫氫酶催化反應。在方案(3b)中中生成的NAD(P)+可以通過分光光度計法在340nm下檢測。任何腺苷脫氨酶可以用於方案(2)。例如，可以使用來源於牛脾的腺苷脫氨酶(Sigma-Aldrich目錄號A5168，6648和5043)，來源於小牛腸黏膜的腺苷脫氨酶(Sigma-Aldrich目錄號01898，A9876和A1030)或來源於人紅細胞的人腺苷脫氨酶(Sigma-Aldrich目錄號BCR647)。在另一實施例中，可以使用由核酸編碼的腺苷脫氨酶，該核酸的GenBank登記號是U76422(人類，還參見Lai，等，Mol.Cell.Biol.,17(5)2413-24(1997))。可以將任何嘌呤核苷磷酸化酶用於方案(2b)。例如，可以使用由具有下列GenBank登記號的核酸編碼的嘌呤核苷磷酸化酶U88529(大腸桿菌)；U24438(大腸桿菌，還參見Cornell和Riscoe，Biochim.Biophys.Acta,1396(1):8_14(1998))；U83703(H.pylori)；和M30469(大腸桿菌)。可以將任何黃嘌呤氧化酶用於方案(2b)。例如，可以使用由具有下列GenBank登記號的核酸編碼的黃嘌呤氧化酶AF080548(苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti))；和U39487(人類，還參見Saksela和Raivio，Biochem.J.,315(1):235_9(1996))。可以將任何腺苷激酶用於方案(3)。例如，可以使用由具有下列GenBank登記號的核酸編碼的腺苷激酶NM_006721(Homosapiens)；NM_001532(Homosapiens)；NM_001123(Homosapiens)；NM_021129(Homosapiens)；禾口BC003568(Homosapiens)。還可以使用在美國專利號5,861,294，McNally等，Biochem.Biophys.Res.Commun.231645-650(1997)，和Singh等，Eur.J.Biochem.241:564_571(1996)中公開的腺苷激酶。可以將任何穀氨酸脫氫酶用於方案(2a)。例如，可以使用在Perez-deIaMora等，Anal.Biochem.,180(2)248~52(1989)和Gore，Int.Τ.Biochem.,13(8)879~86(1981)中公開的穀氨酸(glutamate)脫氫酶(或穀氨酸(glutamicacid)脫氫酶)。可以將任何丙酮酸激酶用於方案(3a)。例如，可以使用來源於豬的丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich目錄號K4388)，來源於嗜熱脂肪芽孢桿菌(Baci1lusstearothermophilus)(Sigma-Aldrich目錄號P1903)，來源於雞肌肉的丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich目錄號P5788)和來源於兔肌肉的丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich目錄號83330)。可以將任何乳酸脫氫酶用於方案(3b)。例如，可以使用來源於人的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號BCR404)，來源於德氏乳桿菌乳亞種(Lactobacillusleichmanii)的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號61306)，來源於乳酸桿菌屬(Lactobacillussp)的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號59023)和來源於兔肌肉的乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich目錄號61311)。本文所述的方法可以用於評估任何樣品，例如體液或生物組織。例舉性的體液包括尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，和羊膜液。優選地，測定的體液是血液。血樣可以直接測定或者在測定前處理。例如，血樣可以進一步分成血漿或血清級分。在所述樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸之前或同時，將樣品中氧化的或偶聯的Hcy轉化為還原型Hcy。在血漿或尿中，顯著部分的存在的高半胱氨酸可能通過二硫鍵與循環蛋白如清蛋白結合，高半胱氨酸還可以以其它二硫化物衍生物的形式存在(通常為高半胱氨酸一半胱氨酸偶聯物)。為了獲得對樣品中存在的總高半胱氨酸的評估，因此可以理想的用還原劑處理樣品以裂解二硫鍵和釋放游離的高半胱氨酸。可以使用任何適當的還原劑。二硫化物容易和特別地被硫醇類還原(例如三_正丁基膦(TBP)，二硫蘇糖醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇(DTE)，2-巰基-乙醇，半胱氨酸-巰基乙12酸鹽(酯)，巰基乙酸，三(2_羧乙基)膦，游離金屬，穀胱甘肽和類似的化合物)。可以使用氫硼化物(例如氫硼化鈉)或汞齊(例如鈉汞齊)，或者可以使用更專用的試劑如膦或硫代磷酸酯實現直接化學還原。二硫化物還原在MethodsofEnzymology143=243-256(1987)中由Jocelyn綜述，其中列舉了各種各樣的適當的還原劑。還原劑還可以是三(2_羧乙基)-膦鹽酸鹽(TCEP)。優選地，以高達約30mM的濃度提供二硫蘇糖醇或TCEP。本發明的方法可以另外包含去除在將樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸之前或同時用於將氧化的或偶聯的Hcy轉化為還原型Hcy的還原劑的步驟。例如，通過加入N-乙基馬來醯亞胺或其它硫_反應化合物可以去除還原劑。C.測定高半胱氨酸的試劑盒在另一方面，本發明涉及用於測定樣品中Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)HCy轉化酶；b)Hcy共底物；和c)用於評估Hcy共底物轉化產物的試劑。在一些實施方案中，所述Hcy共底物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉化酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶，所述Hcy共底物轉化產物是S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)。在一些實施方案中，用於評估Hcy共底物轉化產物SAH的試劑是與SAH特異性結合的抗體。在另一方面，本發明涉及一種測定樣品中的Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；c)SAH水解酶；和d)用於評估腺苷(Ado)的試劑。在還有另一方面，本發明涉及一種測定樣品中的Hcy的試劑盒，該試劑盒包含a)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶；b)S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或ATP，Met和SAM合酶；和c)用於評估SAH的試劑，其中所述試劑盒不包含用於生成H2O2的酶或試劑和用於檢測H2O2的試劑。在一些實施方案中，用於評估Ado的試劑包含不同於SAH水解酶的腺苷轉化酶。在一些實施方案中，腺苷轉化酶是腺苷激酶。在其它實施方案中，腺苷轉化酶是腺苷脫氨酶。本文所述的試劑盒可以另外包含還原劑，例如二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)_膦鹽酸鹽(TCEP)。本發明的試劑盒可以是任何適當包裝。例如，本文所討論的涉及診斷系統的包裝是通常用於診斷系統的那些。這些包裝包括玻璃和塑料，如聚乙烯，聚丙烯和聚碳酸酯，瓶子和小瓶，塑料和塑料_箔層壓的包膜等。這些包裝還可以包括適用於自動分析儀使用的容器。包裝典型地包括用於進行本文所述測定的使用說明。D.實施例包括下列實施例僅僅是用於舉例說明的目的而不是意欲限制本發明的範圍。實施例1.GLDH-NADH偶聯以檢測通過使用純化的SAM的酶促循環生成的NH4+在本研究中，使用下列偶聯的酶促循環反應SAM+E^cy^SAH+甲硫氨酸(1)SAH—腺苷+Hcy^(2)腺苷一肌苷+NH4+(3)NH4++α-酮戊二酸+NAD⑵H—穀氨酸+NAD(P)(4)13[0123]在方案(1)中，通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶催化反應。在方案(2)中，通過SAH水解酶催化反應。在方案(3)中，通過腺苷脫氨酶催化反應。在方案(4)中，通過L-穀氨酸脫氫酶催化反應。通過分光光度計法在340nm下檢測NAD(P)+。用於本研究的試劑的更詳細的描述在下表1和2中列出。0124]表1.試劑1的組成0125]0126]0127]0128]0129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]0142]0143]0144]0145]0146]在本研究中，將180μ1的試劑1與20μ1待測的物在37°C溫育5分鐘。然後向混合物中加入六十(60)41試劑2，並且在371溫育另外5分鐘。在加入試劑2以後測量在340nm下的吸光度的變化2-5分鐘。一個例舉性的檢測結果在圖2中顯示。實施例2.GLDH-NADH偶聯以檢測使用SAM的酶促循環生成的NH4+,SAM同時通過SAM合酶由ATP和甲硫氨酸轉化在本研究中，使用下列偶聯的酶促循環反應腺苷一肌苷+NH4+(4)[0151]NH4++α-酮戊二酸+NAD(P)H—穀氨酸+NAD(P)(5)在方案(1)中，通過SAM合酶催化反應。在方案(2)中，通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶催化反應。在方案(3)中，通過SAH水解酶催化反應。在方案(4)中，通過腺苷脫氨酶催化反應。在方案(5)中，通過L-穀氨酸脫氫酶催化反應。通過分光光度計法在340nm下檢測NAD(P)+。用於本研究的試劑的更詳細的描述在下列表3和4中闡明。表3.試劑3的組成[0154]表4.試劑4的組成[在該研究中，將270μ1試劑與20μ1待測血清或血漿樣品混合，將混合物在37°C下溫育5分鐘。然後向該混合物中加入九十(90)μ1試劑2，在37°C下溫育另外5分鐘。在加入試劑2後測量在340nm下吸光度的變化2_5分鐘。實施例3.腺苷激酶-丙酮酸激酶_乳酸脫氫酶-NADH偶聯以檢測通過酶促循環生成的腺苷在該研究中，使用下列偶聯的酶促循環反應腺苷+ATP—ADP+AMP(3)ADP+PEP—丙酮酸+ATP(4)丙酮酸+NADH—乳酸+NAD(5)在方案(1)中，通過SAM-依賴性高半胱氨酸S-甲基轉移酶催化反應。在方案(2)中，通過SAH水解酶催化反應。在方案(3)中，通過腺苷激酶催化反應。在方案(4)中，通過丙酮酸激酶催化反應。在方案(5)中，通過乳酸脫氫酶催化反應。通過分光光度計法在340nm下檢測NAD(P)+。用於本研究的試劑的更詳細的描述在下列表5和6中闡明。表5.試劑5的組成表6.試劑6的組成在該研究中，將180μ1試劑與20μ1待測血清或血漿樣品混合，將混合物在37°C下溫育5分鐘。然後向該混合物中加入六十(60)μ1試劑2，在37°C下溫育另外5分鐘。在加入試劑2後測量在340nm下吸光度的變化2_5分鐘。實施例4.例舉性Diazyme高半胱氨酸酶促測定與Catch高半胱氨酸測定之間的比較在CobasMira分析儀和BeckmanSynchronCX-7分析儀上，為了證明準確性，用單個的血清樣品檢測例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定與Catch高半胱氨酸測定比較。按照實施例1所示步驟進行例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定。Catch高半胱氨酸測定在美國專利號6，174，696和6，436，658中描述。用於本研究的個體患者血清樣品來自檢定的商購來源，ProMedDx,LLC。血清樣品通過IRB檢定，即用於收集樣品的方案和知情同意書經IRB批准。為了確保高半胱氨酸濃度分布在可報導的動態範圍內，用高半胱氨酸貯液將用於研究的一些高半胱氨酸血清樣品強化(spike)至目標濃度。在一個測試中，在CobasMira分析儀上比較例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定與Catch高半胱氨酸測定。檢測總共47個血清樣品。獲得的高半胱氨酸值的比較結果在下表7中顯示。表7.在CobasMira分析儀上Diazyme和Catch高半胱氨酸測定的比較使用Diazyme高半胱氨酸酶促測定獲得的高半胱氨酸濃度也針對使用Catch高半胱氨酸測定獲得的高半胱氨酸濃度作圖。如圖3所示，斜率為1.029，兩種方法之間的相關係數是0.97，並且y截距是1.47。在另一測試中，在BeckmanSynchronCX-7分析儀上比較例舉性的Diazyme高半胱氨酸酶促測定和Catch高半胱氨酸測定。檢測總共15個血清樣品。高半胱氨酸值的比較結果在下表8中顯示。表8.在BeckmanSynchronCX-7分析儀上Diazyme和Catch高半胱氨酸測定的比較使用Diazyme高半胱氨酸酶促測定獲得的高半胱氨酸濃度也針對使用Catch高半胱氨酸測定獲得的高半胱氨酸濃度作圖。如圖4所示，斜率為1.07，兩種方法之間的相關係數是0.99，並且y截距是-1.14。包括上述實施例僅僅是為了舉例說明的目的，而不是意欲限制本發明的範圍。可以有對上述那些的許多變化。由於對上述實施例的改進和變化對於本領域技術人員是顯而易見的，意欲本發明僅受後附權利要求的範圍所限制。權利要求一種測定樣品中的高半胱氨酸(Hcy)的方法，該方法包含a)在Hcy轉化反應中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸以形成Hcy轉化產物和Hcy共底物轉化產物，其中所述Hcy共底物是S腺苷甲硫氨酸(SAM)，所述Hcy轉化酶是S腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性高半胱氨酸S甲基轉移酶，所述Hcy轉化產物是甲硫氨酸(Met)並且所述Hcy共底物轉化產物是S腺苷L高半胱氨酸(SAH)；b)將步驟(a)中產生的所述SAH與SAH水解酶接觸以產生Hcy和腺苷(Ado)，所述Hcy通過SAM依賴性高半胱氨酸S甲基轉移酶循環至所述Hcy轉化反應中以形成基於Hcy共底物的酶循環反應體系，評估所述Ado以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。2.權利要求1的方法，其中通過將所述Ado與腺苷轉化酶而非SAH水解酶接觸來評估Ado。3.權利要求2的方法，其中通過評估所述腺苷轉化酶的腺苷轉化的共底物或反應產物來間接進行所述Ado的評估。4.權利要求3的方法，其中所述腺苷轉化酶是腺苷激酶。5.權利要求3的方法，其中所述腺苷轉化酶是腺苷脫氨酶。6.權利要求1的方法，其中所述樣品是體液或生物組織。7.權利要求6的方法，其中所述體液選自由下列各項組成的組尿，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，痰液，腦脊髓液，淚液，粘液，和羊膜液。8.權利要求6的方法，其中所述體液是血液。9.權利要求8的方法，其中所述血液被進一步分成血漿或血清級分。10.權利要求1的方法，其中在所述樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸之前或同時，將樣品中氧化的或偶聯的Hcy轉化為還原型Hey。11.權利要求1的方法，其中在沒有色譜分離的情況下評估所述Ado。12.權利要求1的方法，其中將所述SAM加入所述樣品中。13.權利要求1的方法，其中通過SAM合酶由ATP和Met生成所述SAM。14.權利要求1的方法，其中在沒有色譜分離的情況下測定樣品中的高半胱氨酸。專利摘要本發明一般涉及高半胱氨酸檢測領域。特別是，本發明提供一種測定樣品中高半胱氨酸的存在或濃度的方法，該方法包含在Hcy轉化反應中將含有或懷疑含有Hcy的樣品與Hcy共底物和Hcy轉化酶接觸以形成Hcy轉化產物和Hcy共底物轉化產物；和評估Hcy共底物轉化產物以確定樣品中Hcy的存在、不存在和/或數量。本發明還提供了基於相同原理測定高半胱氨酸的試劑盒。文檔編號C12Q1/48GKCN101900735SQ201010134298公開日2010年12月1日申請日期2004年7月9日發明者A·達塔,竇超,袁崇生申請人:通用原子公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan