一種以大豆吉林35號胚尖為外植體的高效遺傳轉化方法

2023-06-22 21:34:31

專利名稱：一種以大豆吉林35號胚尖為外植體的高效遺傳轉化方法
技術領域：
本發明屬於植物轉基因技術領域，具體涉及以大豆胚尖為外植體，篩選高再生率且對農桿菌高度敏感的基因型，配合高效的侵染方式，提高了農桿菌的轉化效率。
背景技術：
大豆是重要的油料作物和飼料作物，利用轉基因技術提高大豆品質是當今育種的重要方向，雖然轉基因大豆已經在全球大規模種植，但其遺傳轉化仍是難點之一，因此，建立一個高效、穩定的再生體系是解決大豆遺傳轉化率低的基石。大豆組織培養的研究可追溯到20世紀60年代，直到80年代才取得飛躍性突破，通過大豆的原生質體、下胚軸、小真葉、幼胚、子葉節、胚尖等外植體相繼獲得了再生植株。目前，已經建立的大豆遺傳轉化體系仍存在組培操作技巧性強、植株再生率低、重複性差等問題，嚴重製約了利用分子生物學手段改良遺傳性狀。所以，建立一個簡便、高效、 穩定的再生體系是大豆遺傳轉化成功的基礎，也是眾多研究者需要解決的關鍵性問題。近些年發展起來的大豆胚尖再生體系因取材方便、再生周期短、操作簡便、褐化率低等優點，已經廣泛應用於大豆遺傳轉化技術中。但胚尖再生體系同樣存在一些致命的缺點，如基因型依賴性強、轉化率低等。因此，篩選適合胚尖再生體系的基因型，採取高效的侵染方式，並建立專屬於這個基因型的遺傳轉化體系，提高轉化效率，對大豆遺傳轉化的發展具有重大實踐意義。

發明內容
本發明的目的在於提供一種以大豆吉林35號胚尖為外植體的高效遺傳轉化方法。本發明採取的技術方案是，包括下列步驟
(1)選取種皮完整無病害的吉林35號大豆種子，自來水衝洗乾淨後用75%的酒精處理 50s，無菌水衝洗3 5遍，而後浸泡於無菌水中Mi並切取外植體胚尖；
(2)將外植體先進行超聲波處理6s，之後用真空泵輔助農桿菌侵染15min，並於侵染液中添加 0. 03% Silwet L-77 ；
(3)侵染後的胚尖外植體轉接到共培養基中，共培養基附加3.0mg . I^e-BA以誘導叢生芽和3.0 mg . L—1硝酸銀以抑制褐化和壞死；
(4)共培養3天後移接至叢生芽伸長培養基中，伸長培養基附加0.5mg . L—1 6-BA與 0.2 mg . Γ1 IBA，此階段添加篩選劑 Basta 0. 6 mg . Γ1 ；
(5)待再生植株長到4.7^5. 3cm時，接入生根培養基，生根培養基以蔗糖作為碳源，選用1/2 MSB並附加0.5 mg .廠1 IBA，待根長勢健壯後移栽至營養缽中；
(6)移栽後提取葉片DNA做PCR檢測，並採用bar基因試紙條進行蛋白檢測。本發明所使用的大豆品種，由吉林大學植物種質資源與利用研究室提供。此項發明以大豆胚尖為外植體，首先，對十個基因型吉林35、吉林47、平安8、東
3農42、美國扁莖、吉大豆1號、吉大豆2號、吉大113、合豐43和綏農10和5個6-BA，0,0. 2、 0.5、1.0、3.0和5.0 mg . L—1水平的誘芽率進行了雙因素試驗，然後對十個品種進行⑶S 基因的瞬時表達，測定螢光值，綜合上述兩個試驗結果，篩選出高再生率且對農桿菌敏感的品種吉林35。繼而，以吉林35號胚尖為受體材料，進行氯氣、升汞和酒精三種種子消毒方法比較，消毒後浸泡於無菌水中他，切取外植體胚尖直接進行農桿菌侵染，採用靜止、搖床、 真空泵三種侵染方式，lOmin、15min、20min三個侵染時間與超聲波處理組合，並於重懸液中添加0.03%和0.06% Silwet L-77。共培養期間採用3. O mg .廠1 6-BA誘導叢生芽，並於培養基加入不同濃度脯氨酸和硝酸銀(0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg . L—1)，以抑制褐化， 誘芽階段不添加任何激素和附加物質，叢生芽伸長培養基設置3種6-BA濃度(0. 0,0. 2和 0. 5 mg . 171)和3種仍六濃度(0.0、0.2和0.5 mg . Γ1)，生根培養基中設置1/2 MSB、1/4 MSB、蔗糖、葡萄糖和3種IBA濃度(0.2、0. 5和l.Omg . L—1)共12種組合。以合豐35、東農42為對照，採用常規遺傳轉化方法，而吉林35採用上述的遺傳轉化方法，移栽後提取葉片DNA做PCR檢測，並採用bar基因試紙條進行蛋白檢測，最後比較三者間轉化率。本發明的有益效果本項發明為大豆遺傳轉化技術提供了一種高效率的轉化方法。與常規的大豆胚尖遺傳轉化體系相比，本發明縮短了再生周期，採用了強有效的侵染方式，降低了共培養期間的褐化與壞死程度，提高了轉化率，建立了以吉林35號胚尖為外植體的高效遺傳轉化方法，對解決大豆遺傳轉化困難、再生率低等問題具有較大的實踐意義。下面結合具體實施方法對本發明作詳細說明。


圖1是不同基因型大豆胚尖的叢生芽誘芽率圖； 圖2是不同基因型大豆胚尖GUS活性檢測結果圖； 圖3是不同侵染方式GUS活性檢測圖4是不同濃度Silwet L-77對侵染的影響圖，圖中A:未侵染B:真空侵染20min C: 真空侵染15min D:重懸液中加入0.03% Silwet L-77真空侵染20min Ε:重懸液中加入 0. 03% Silwet L-77真空侵染15min F:重懸液中加入0.06% Silwet L-77真空侵染20min G:重懸液中加入0. 06% Silwet L-77真空侵染15min 圖5是脯氨酸和硝酸銀對褐化的影響圖； 圖6是6-BA和IBA對胚尖再生的影響圖7是無機鹽、糖類及IBA對生根的影響圖，A: 1/2 MSB+蔗糖+0.2mg . Γ1 IBA5B: 1/2 MSB+蔗糖+0. 5mg . L-1 IBA ；C: 1/2 MSB+蔗糖+l.Omg . L-1 IBA ；D:1/4 MSB+蔗糖+0. 2mg .L-1 IBA ；E:1/4 MSB+蔗糖+0. 5mg . L-1 IBA ；F: 1/4 MSB+蔗糖+1. Omg . L-1 IBA ;G: 1/2 MSB+ 葡萄糖 +0. 2mg . Γ1 IBA ；H: 1/2 MSB+ 葡萄糖 +0. 5mg . Γ1 IBA ；1:1/2 MSB+ 葡萄糖 +1. Omg . Γ1 IBA ;J: 1/4 MSB+葡萄糖+0. 2mg . L-1 IBA ；K; 1/4 MSB+葡萄糖+0. 5mg . Γ1 IBA ；L; 1/4 MSB+ 葡萄糖 +1. Omg . L-1 IBA ；
圖8是大豆吉林35胚尖遺傳轉化流程圖，Α:真空侵染B:共培養C:誘芽D:生根E: 移栽F:開花G:結莢；
圖9是再生植株的PCR檢測圖；M markerU 陰性對照、2 陽性對照、3_19部分檢測樣品DNA ；圖10是再生植株的蛋白檢測圖。
具體實施例方式(1)選取種皮完整無病害的吉林35號大豆種子，自來水衝洗乾淨後用75%的酒精處理50s，無菌水衝洗3 5遍，而後浸泡於無菌水中Mi並切取外植體胚尖；
(2)將外植體先進行超聲波處理6s，之後用真空泵輔助農桿菌侵染15min，並於侵染液中添加 0. 03% Silwet L-77 ；
(3)侵染後的胚尖外植體轉接到共培養基中，共培養基附加3.0mg . I^e-BA以誘導叢生芽和3.0 mg . L—1硝酸銀以抑制褐化和壞死；
(4)共培養3天後移接至叢生芽伸長培養基中，伸長培養基附加0.5mg . L—1 6-BA與 0.2 mg . Γ1 IBA，此階段添加篩選劑 Basta 0. 6 mg . Γ1 ；
(5)待再生植株長到4.7^5. 3cm時，接入生根培養基，生根培養基以蔗糖作為碳源，選用1/2 MSB並附加0.5 mg .廠1 IBA，待根長勢健壯後移栽至營養缽中；
(6)移栽後提取葉片DNA做PCR檢測，並採用bar基因試紙條進行蛋白檢測。本發明所使用的大豆品種，由吉林大學植物種質資源與利用研究室提供。下面結合具體實施例來進步一說明本發明。實施例1 不同基因型大豆胚尖的叢生芽誘芽率
以吉林35、吉林47、平安豆8、東農42、美國扁莖、吉大豆1號、吉大豆2號、吉大豆3號、 合豐43和綏農10為材料，在誘導培養基上分別加入不同濃度6-BA (0,0. 2,0. 5,1. 0,3. 0 和5.0 mg . Γ1)(購自北京鼎國)，光照誘導5 d，轉接MSB培養基上(MS大量、MS微量、MS 鐵鹽和B5有機)，每個處理30個外植體，3次重複。14d調查統計大豆各基因型胚尖不定芽誘導率，結果如圖1。從圖1可知，供試品種中吉大豆2號整體誘芽率最高，其次為吉林35。整體來看， 適宜的6-BA濃度主要集中在0. 2 3.0 mg . L—1之間。實施例2 不同基因型大豆胚尖⑶S活性檢測結果
上述十個品種的胚尖外植體分別浸入轉入PCAMBIA1301 (購自CAMBIA)質粒載體的農桿菌EHA105(購自Biovector)重懸液中，真空侵染15 min，洗去外植體上附著的菌液，將外植體轉接入共培養基中(1/2MS大量+MS微量+MS鐵鹽+B5有機+30 g/L蔗糖+0. 8g/L瓊月旨+100uMAS+5mg/L6-BA PH5. 4)，培養 3 d。選取未褐化胚尖外植體約IOOmg，加入液氮，研磨成粉末，將粉末裝入1. 5ml離心管，加入600ul⑶S提取緩衝液，充分混勻，4°C，12，000rpm，離心lOmin，取上清分裝於2個新離心管，4°C保存備用。上清液為GUS蛋白粗提液，其中一部分上清液用分光光度計測蛋白濃度，另一部分上清液加入⑶S反應底物4-MUG(購自長春德爾塔生物)，37V，反應10 min，加反應終止液(0.2 mmol/L Na2CO3)終止反應，在螢光分光光度計下，測定螢光值。計算GUS活性。⑶S螢光定量結果如圖2所示，侵染後吉林35⑶S活性最高，遠遠高于吉大豆2號及其它大豆品種，說明吉林35胚尖外植體對農桿菌敏感性最強，由於其在胚尖轉化體系中的誘芽率也相對較高，因此，吉林35可作為大豆胚尖遺傳轉化體系良好的受體材料。實施例3 不同消毒方法對胚尖出芽率的影響選取種皮完整無病斑、無蟲害、無黴菌的成熟吉林35號大豆種子，採用3種種子消毒方法。(1)氯氣消毒法大豆種子放於通風櫥內的密閉容器中，混合96 ml 5% Naclo和4 ml Hcl (均購自北京鼎國)，消毒6 10 h。(2)升汞消毒法自來水衝洗大豆種子，75%的酒精處理35 s，然後用0.1% Hgcl2消毒10 min，無菌水衝洗3 5遍。(3)酒精消毒法自來水衝洗大豆種子，75%的酒精處理50 s，無菌水衝洗3 5遍。每種消毒方法處理100粒種子，3次重複。結果如下表採用3種方法對吉林35成熟種子進行消毒，均未出現汙染現象，但出芽率明顯不同。酒精法消毒的發芽率高達98. 3%，效果優於另外兩種消毒方法。酒精消毒法對種子傷害較小，可以保證較高的出芽率，是一種簡便、易行、可靠的消毒方式。
消毒方法接種數汙染數出芽￠/%
P氣酒毒法100096 7
升錄消爨法.100087.3
_精爾禱法100098—3實施例4 不同侵染方式⑶S活性檢測
將攜帶PCAMBIA1301農桿菌EHA105對吉林35胚尖進行轉化，共設置靜止、搖床和真空泵三種侵染方式，10minU5min和20min三個時間處理，附加超聲波和無超聲波處理，共計 18種侵染組合。侵染後按照例2中的方法，測定蛋白濃度和螢光值，計算GUS活性。GUS螢光定量結果如圖3所示，真空侵染後GUS活性的整體平均值高於另外兩種侵染方式，且超聲波處理一般高於無超聲波處理。其中，以超聲波處理後真空侵染15min⑶S 活性最高。實施例5 不同濃度Silwet L-77對侵染的影響
將攜帶PCAMBIA1301農桿菌EHA105對吉林35號胚尖進行轉化，設置一個空白對照和6 種處理，分別為未侵染、真空侵染15min、真空侵染20min、重懸液中加入0. 03% Silwet L-77 (購自北京鼎國)真空侵染15min、重懸液中加入0. 03% Silwet L-77真空侵染20min、重懸液中加入0.06% Silwet L-77真空侵染15min和重懸液中加入0. 06% Silwet L-77真空侵染20min。感染後的胚尖外植體轉接至共培養培養基中，22°C，黑暗培養。參照Jefferson 等的方法，選擇共培養3 d未褐化的胚尖浸泡在X-Gluc (購自上海生工)染色液中，37°C保溫過夜，觀察染色情況。瞬時表達結果如圖4，六種處理間⑶S基因表達結果差異很大，以重懸液中加入 0. 03% Silwet L-77表現較為突出，在根尖分生組織區和頂端分生組織區同時表達，真空侵染20min表達效果最為明顯，整個外植體都被染為藍色。綜合實例4，以超聲波處理後真空侵染15min，且於重懸液中附加0. 03% Silwet L-77為最佳侵染方法。實施例6 脯氨酸和硝酸銀對褐化的影響
以吉林35號為材料，消毒獲得外植體，按照上述方法侵染後，倒掉菌液，用滅菌後的濾紙吸乾胚尖表面的菌液，然後將外植體平放於鋪有濾紙的共培養基中。共培養基和重懸液中分別加入不同濃度脯氨酸(0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg . L—1)和硝酸銀(0、1. 0、2. 0、 3.0、4.0和5.0 mg . L—1)，在22°C、黑暗條件下培養。每個處理45個外植體，3次重複，培養5 d，分別調查統計不同濃度附加物下胚尖褐化情況。結果表明(圖5)，隨著脯氨酸和硝酸銀濃度的增加褐化率逐漸降低達到最小值後又升高。脯氨酸和硝酸銀均在3. 0 mg . Γ1濃度下胚尖褐化率最低，分別為3. 70%和2. 96%， 表明脯氨酸和硝酸銀對褐化率有顯著抑制效果。實施例7 :6-BA和IBA對胚尖再生的影響
以吉林35號為試驗材料，消毒後浸泡於無菌水中，切去原葉及子葉獲得胚尖外植體。 按照實例4和5侵染後共培養3天，接入誘芽培養基中培養14天，而後轉接至叢生芽伸長培養基中。叢生芽伸長培養基設置3種6-BA濃度(0.0、0. 2和0. 5 mg . L-1)禾口 3種IBA 濃度(0.0、0. 2和0. 5 mg . L—1)，共9種組合，每個處理30個外植體，3次重複。20d調查統計叢生芽的生長狀況和再生率，應用軟體SPSS16. 0做叢生芽再生率的方差分析和顯著性檢驗。再生率(％ )=叢生芽高度大於3 cm外植體數目/出芽外植體數目X 100% 如圖6所示，6-BA濃度為0.0 mg . L-1時，隨著IBA濃度的增加再生率急劇下降；6-BA
濃度為0 .2 mg . L—1時，再生率下降趨勢在一定程度上減緩；6-BA濃度為0.5 mg . L—1時， 再生率先增加然後下降。總體趨勢表明，6-BA對再生率影響最大，單獨使用也可獲得較高的再生率，而IBA只有當其濃度低於6-BA濃度時，二者配合使用才能提高再生率，反之，則降低再生率。顯著性差異檢驗表明，不同激素濃度配比間再生率存在差異。0.5 mg . L—1 6_BA 與0.2 mg . Γ1 IBA配合使用和0.5 mg . L—1 6-BA單獨使用，再生率顯著高於其它組合，二者間無顯著差異，但二者配合使用時再生率最高。綜合考慮，0.5 mg . L—1 6-BA與0.2 mg
Γ1 IBA對吉林35叢生芽伸長作用效果最佳。實施例8 無機鹽、糖類及IBA對生根的影響
通過上述方法獲得再生植株，待其長到5 cm左右時，接入生根培養基。生根培養基中分別設置1/2 MSBU/4 MSB、蔗糖、葡萄糖和3種IBA濃度(0.2、0. 5和l.Omg . L-1)共12 種組合。每種組合30個外植體，3次重複，培養3周後調查每種組合生根狀況。由圖7可知，蔗糖比葡萄糖能更好地促進生根，而葡萄糖則易產生愈傷且生長較慢，選用蔗糖作為碳源物質情況下，1/2 MSB較1/4 MSB培養基中的根更粗壯且數量多(A與 D)，但是隨著IBA濃度增加，這種趨勢逐漸消失(C與F)。以蔗糖作為碳源，1/2 MSB配合高濃度的IBA做為生根培養基較為合適。實施例9 合豐35、東農42和吉林35三個品種間轉化率的比較
以合豐35、東農42兩個品種為對照，採用衛志明等的胚尖遺傳轉化方法，而吉林35採用本發明中的遺傳轉化方法，具體流程如圖8，待再生植株移栽成活後，用CTAB法提取葉片總DNA，檢測目的基因的PCR擴增產物，約為IlOObp (如圖9)。取一小塊葉片於1. 5ml離心管中，用小棒研磨30s左右，加入500ul蛋白提取液， 繼續研磨30s，將含有吸水墊一端的bar基因試紙條插入離心管中，IOmin後觀察結果，如圖 10，只有一條帶的為陰性植株，含有兩條帶的為陽性植株。
分別統計合豐35、東農42和吉林35侵染後的外植體數目、移栽成活的再生植株數目、PCR和試紙條檢測同為陽性的植株數，計算最終轉化率。結果如下表，從表中數目可知，吉林35的轉化率最高，所取得的較高的轉化率主要歸功於採用的高效遺傳轉化方法即各種影響因子的絕佳組合，轉化結果充分的驗證了吉林35胚尖遺傳轉化方法的高效性。
權利要求
1. 一種以大豆吉林35號胚尖為外植體的高效遺傳轉化方法，其特徵在於包括下列步驟(1)選取種皮完整無病害的吉林35號大豆種子，自來水衝洗乾淨後用75%的酒精處理 50s，無菌水衝洗3 5遍，而後浸泡於無菌水中Mi並切取外植體胚尖；(2)將外植體先進行超聲波處理6s，之後用真空泵輔助農桿菌侵染15min，並於侵染液中添加 0. 03% Silwet L-77 ；(3)侵染後的胚尖外植體轉接到共培養基中，共培養基附加3.0mg . I^e-BA以誘導叢生芽和3.0 mg . L—1硝酸銀以抑制褐化和壞死；(4)共培養3天後移接至叢生芽伸長培養基中，伸長培養基附加0.5mg . L—1 6-BA與 0.2 mg . Γ1 IBA，此階段添加篩選劑 Basta 0. 6 mg . Γ1 ；(5)待再生植株長到4.7^5. 3cm時，接入生根培養基，生根培養基以蔗糖作為碳源，選用1/2 MSB並附加0.5 mg . Γ1 IBA，待根長勢健壯後移栽至營養缽中；(6)移栽後提取葉片DNA做PCR檢測，並採用bar基因試紙條進行蛋白檢測。
全文摘要
本發明涉及一種以大豆吉林35號胚尖為外植體的高效遺傳轉化方法，屬於植物轉基因技術領域。選取種皮完整無病害的吉林35號大豆種子，將外植體先進行超聲波處理，侵染後的胚尖外植體轉接到共培養基中，共培養、接入生根培養基，待根長勢健壯後移栽至營養缽中。本發明縮短了再生周期，採用了強有效的侵染方式，降低了共培養期間的褐化與壞死程度，提高了轉化率。
文檔編號C12N15/82GK102533848SQ20121001912
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者劉雅婧, 孫昕, 張鑫生, 李景文, 楊旭光, 王慶鈺, 王英, 程浩, 翟瑩, 趙健如, 閆帆, 陳虹地 申請人:吉林大學