一種EGCG的製備方法與流程

2023-06-22 13:23:01

本發明涉及一種egcg的製備方法，具體涉及一種適用於工業化生產高純度egcg的製備方法，屬於植物單體分離純化領域。

背景技術：

egcg(epigallocatechingallate)中文名表沒食子兒茶素沒食子酸酯，是綠茶茶多酚(teapolyphenols，tp)的主要組成成分和活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗突變等活性。egcg為白色無定形的結晶狀物質，易氧化聚合，一般呈現淡黃色至褐色；略帶茶香，有澀味；易溶於水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，微溶於油脂，不溶於苯和氯仿等有機溶劑；可與鐵離子生成綠黑色化合物。

在茶鮮葉中，水分含量約佔75％，乾物質為25％。在乾物質中糖類約佔茶葉乾物重的20～25％，主要是纖維素、果膠、澱粉等；蛋白質約佔20～30％，主要有谷蛋白、白蛋白等；脂肪及類脂物質在茶葉中約為8％。次級代謝產物中，茶多酚類佔20～35％，主要是兒茶素，佔總量70％以上，生物鹼佔3～5％，由咖啡鹼、茶葉鹼、可可鹼組成，胺基酸佔1～4％，芳香物質0.005～0.030％，以及茶皂素等。兒茶素類化合物主要包括兒茶素(c)、表兒茶素(ec)、沒食子兒茶素(egc)、兒茶素沒食子酸酯(ecg)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)等幾種物質，其中egcg佔兒茶素類化合物含量的50～60％。

egcg的分離純化是根據其與雜質的差異，結合工程實際來進行的。主要方法如有機溶劑提取法、金屬離子鹽沉澱法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法等。目前，工業化的egcg製備方法主要是有機溶劑提取法，其優點是萃取工藝成熟，容易實現產業化；缺點是需要使用大量的有機溶劑反覆除雜，工藝繁瑣複雜，產品可能存在有機溶劑的殘留，不夠安全環保。

目前，從綠茶中分離純化的egcg單體純度普遍為低於98％，較高純度egcg的製備也僅限於實驗室規模，且工藝方法複雜、成本高，因此，開發一種適於工業化生產高純度、低成本、綠色安全的egcg單體的製備方法具有較大的技術先進性和經濟社會效益。

技術實現要素：

本發明針對目前有機溶劑提取法製備egcg工藝複雜、生產過程中使用大量有機溶劑、不夠安全環保的問題，提供了一種適用於工業化生產高純度egcg的製備方法，生產過程中減少了大量有機溶劑的使用，綠色環保，並且提高了產品的純度。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種egcg的製備方法，包括以下步驟：

(1)綠茶粉碎，裝入提取罐，按照固液比1：8～10加入去離子水，溫度70～90℃，攪拌轉速50～60r/min，0.08～0.12mpa真空提取20～30min；

(2)將提取罐內1/4～1/2提取液抽出，按照抽出提取液的體積補入去離子水，按照步驟(1)重複提取1～2次；

(3)合併步驟(1)和(2)的提取液，冷卻至40～50℃，採用孔徑為0.2～0.8μm的無機陶瓷膜0.15～0.3mpa過濾，得濾液和濾渣；

(4)取步驟(3)濾液，導入真空濃縮機，40～60℃、0.09～0.12mpa真空濃縮60～90min，得濃縮提取液；

(5)採用大孔吸附樹脂對步驟(4)濃縮提取液進行兒茶素富集，上樣流速1～2bv/h，再依次使用10％、25％、40％、95％乙醇以1～2bv/h流速洗脫4～5個柱體積，根據薄層色譜跟蹤檢測結果，收集兒茶素混合物；

(6)採用真空濃縮機50～55℃、0.09～0.12mpa真空濃縮至無醇味，得富集後兒茶素濃縮物；

(7)將步驟(6)兒茶素濃縮物用純水溶解，採用反相色譜填料rp-c18為固定相，以1～2bv/h的流速上樣，採用純水為流動相，3～4bv/h流速洗脫3～4個柱體積，根據薄層色譜跟蹤檢測結果，收集egcg餾分；

(8)採用真空濃縮機溫度45～55℃、0.09～0.12mpa濃縮30～60min，再採用真空凍幹機進行冷凍乾燥，水分含量控制在6％以下，得egcg凍乾粉。

步驟(3)所述無機陶瓷膜為al2o3陶瓷膜。

步驟(5)所述大孔吸附樹脂為d101型，粒徑範圍為0.3～1.2mm。

步驟(7)所述反相色譜填料的粒度為20～60μm。

本發明取得的技術效果為：

(1)採用去離子水替代乙醇或者丙酮等有機溶劑對綠茶進行浸提，既保證了較高的提取率，又減少了大量有機溶劑的使用和回收，大大降低成本，更加適用於大規模egcg生產。

(2)採用真空減壓浸提工藝，egcg不縮聚、不氧化，不僅增加了穩定性，而且提高了提取率，終產物製備量達到公斤級。

(3)採用無機陶瓷膜對茶葉原料提取物在上柱之前進行錯流過濾，在一定操作壓差的作用下，膜穩定性更好、孔徑分布窄、機械強度高、不易被汙染堵孔，小於膜孔徑的物質通過膜孔進入滲透側成為濾液，而大於孔徑的物質則被膜截流而成為濃縮液，從而達到分離、濃縮的目的，可以去除懸浮顆粒、細菌、大分子多糖、蛋白質、膠質等物質，增強後續樹脂柱床對兒茶素的吸附和交換，減少堵柱現象發生，提高工作效率，相比傳統膜過濾方法更適於大規模生產。

(4)從茶多酚中分離純化egcg，egcg與ecg的分離一直是分離純化的難點，本發明直接使用純水作為洗脫劑，充分發揮反相填料對於物質極性大小差異的辨別能力，利用過載效應，大大提高了上樣量和分離效果，而且無需處理試劑，降低工藝成本，適合工業化生產。

(5)採用無機陶瓷膜-大孔吸附樹脂-反向c18柱層析聯用，提高egcg純度，純度高達99.5％以上。在整個製備工藝過程中只採用水和含水乙醇等溶劑，能做到無毒、安全、工藝簡單，而且陶瓷膜、樹脂和反向色譜柱填料可再生利用，降低生產成本，適於工業化生產高質量egcg。

附圖說明

圖1為對照品溶液hplc色譜圖，峰1為egcg。

圖2為供試品i溶液hplc色譜圖，峰1為egcg。

圖3為供試品ii溶液hplc色譜圖，峰1為egcg。

具體實施方法

下面結合實施例進一步詳細說明本發明技術方案。

實施例1工業級高純度egcg的製備

(1)採用粉碎機將綠茶粉碎，稱取100kg綠茶粉末，裝入1200l提取罐中，加入800l去離子水，升溫至70℃，攪拌轉速60r/min，0.08mpa真空提取30min。

(2)用抽濾管將提取罐內400l提取液抽出，向罐內補入400l離子水按照步驟(1)重複提取1次。

(3)合併步驟(1)和(2)的提取液，冷卻至40℃，採用孔徑為0.2μm的al2o3陶瓷膜過濾器0.3mpa過濾，得濾液和濾渣，棄掉濾渣。

(4)取步驟(3)濾液，導入真空濃縮機，60℃、0.12mpa真空濃縮60min，得濃縮提取液160l；取提取液樣品乾燥稱重，計算提取率為28.2％。

(5)稱取粒徑範圍為0.3～1.2mm的d101型大孔吸附樹脂(科海思北京科技有限公司)15kg，加入30l95％乙醇室溫下超聲溶脹60min；樹脂充分溶脹後溼法裝柱，柱高2m，柱直徑15cm，用去離子水平衡3個柱體積；取步驟(4)濃縮提取液，1bv/h流速上樣；帶樣品進入柱體後，依次用10％、25％、40％、95％乙醇以2bv/h流速洗脫4個柱體積；根據薄層色譜跟蹤檢測結果，收集兒茶素混合物50l。

(6)採用真空濃縮機50℃、0.09mpa真空濃縮至無醇味，得富集後兒茶素濃縮物1.35kg。

(7)將步驟(6)兒茶素濃縮物用3l純水溶解，採用粒度為20～40μm反相色譜填料rp-c18(sigma公司)為固定相，柱高1m，柱直徑8cm，1bv/h的流速上樣；再採用純水為流動相，4bv/h流速洗脫，洗脫3倍柱體積，根據薄層色譜跟蹤檢測結果，收集egcg餾分；

(8)採用真空濃縮機45℃、0.12mpa濃縮30min；採用真空冷凍乾燥機凍幹，水分含量控制在6％以下，得到egcg凍乾粉0.96kg；經hplc檢測分析(如圖2)，製備的egcg純度為99.6％。

實施例2工業級高純度egcg的製備

(1)採用粉碎機將綠茶粉碎，稱取100kg綠茶粉末，裝入1200l提取罐中，加入1000l去離子水，升溫至90℃，攪拌轉速50r/min，0.12mpa真空提取20min。

(2)用抽濾管將提取罐內250l提取液抽出，向罐內補入250l離子水按照步驟(1)重複提取2次。

(3)合併步驟(1)和(2)的提取液，冷卻至50℃，採用孔徑為0.8μm的al2o3陶瓷膜過濾器0.15mpa過濾，得濾液和濾渣，棄掉濾渣。

(4)取步驟(3)濾液，導入真空濃縮機，40℃、0.09mpa真空濃縮90min，得濃縮提取液120l；取提取液樣品乾燥稱重，計算提取率為29.6％。

(5)取粒徑範圍為0.3～1.2mm的d101型大孔吸附樹脂(科海思北京科技有限公司)15kg，加入30l95％乙醇室溫下超聲溶脹60min；樹脂充分溶脹後溼法裝柱，柱高2m，柱直徑15cm，用去離子水平衡3個柱體積；取步驟(4)濃縮提取液，2bv/h流速上樣；帶樣品進入柱體後，依次用10％、25％、40％、95％乙醇以1bv/h流速洗脫5個柱體積；根據薄層色譜跟蹤檢測結果，收集兒茶素混合物80l。

(6)採用真空濃縮機55℃、0.12mpa真空濃縮至無醇味，得富集後兒茶素濃縮物1.42kg。

(7)將步驟(6)兒茶素濃縮物用3l純水溶解，採用粒度為40～60μm反相色譜填料rp-c18(sigma公司)為固定相，柱高1m，柱直徑8cm，2bv/h的流速上樣；再採用純水為流動相，3bv/h流速洗脫，洗脫4倍柱體積，根據薄層色譜跟蹤檢測結果，收集egcg餾分；

(8)採用真空濃縮機55℃、0.09mpa濃縮60min；採用真空冷凍乾燥機凍幹，水分含量控制在6％以下，得到egcg凍乾粉1.05kg；經hplc檢測分析(如圖3)，製備的egcg純度為99.5％。

實施例3採用hplc法檢測egcg純度

(1)檢測條件

儀器型號：液相色譜儀agilent1260

色譜柱：agilentporoshell120sb-c18(4.6×100mm,2.7μm)

流動相：乙腈-0.1％甲酸水

流速：1.0ml/min

檢測波長：280nm

柱溫：30℃

進樣量：5μl

梯度洗脫條件：流動相a為乙腈，流動相b為0.1％甲酸水

(2)溶液的製備

對照品溶液的製備：取egcg對照品(中國藥品生物檢定所提供，純度≥98％)適量，精密稱定，加甲醇溶解並定量稀釋成濃度為2.3mg/ml的對照品儲備液。精密量取1ml，置10ml量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.23mg/ml的對照品溶液。

供試品i溶液的製備：取實施例1製備的egcg凍乾粉約143mg，精密稱定，置20ml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，甲醇定容，0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

供試品ii溶液的製備：取實施例2製備的egcg凍乾粉約23mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，甲醇定容，0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

(3)系統適用性試驗

按上述色譜條件分析，表沒食子兒茶素沒食子酸酯色譜峰對稱因子在0.95～1.15之間，與相鄰色譜峰的分離度大於1.5，色譜峰的理論塔板數大於60000。取對照品溶液，在上述色譜條件下連續進樣5次，計算表沒食子兒茶素沒食子酸酯峰面積的rsd％為0.7％，表明儀器精密度良好。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見附圖1、圖2和圖3。

(4)樣品測定

按上述溶液製備方法平行製備供試品、對照品溶液，在上述色譜條件下測定，每份供試品進樣2針，按外標法以峰面積計算egcg的含量。

計算公式：

式中：

供試品溶液中主成分的峰面積均值

對照品溶液中主成分的峰面積均值

v：供試品溶液的體積

d：供試品溶液的稀釋倍數

w：供試品的稱樣量

(5)測定結果

標準溶液濃度：0.23mg/ml

標準溶液峰面積平均值：1854.55

供試品測定結果：