一種游離rna提取方法及試劑盒的製作方法
2023-06-22 10:17:31 1
專利名稱：一種游離rna提取方法及試劑盒的製作方法
一種游離RNA提取方法及試劑盒技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種從生物樣本中提取游離RNA的方法和一種游離RNA提取試劑盒。
背景技術：
游離RNA是指存在於血清、血漿、肺泡灌洗液、尿液、胸腹水等體液中的細胞外游離RNA，循環RNA是特指血清或血漿中游離RNA。傳統產前診斷需要依賴於有創性操作獲取胎兒組織(如羊膜腔穿刺和絨毛取樣等)，均對胎兒有潛在的風險。1997年，Lo等首次發現，妊娠婦女血漿和血清中存在胎兒 DNA。這位無創診斷提供了一種有效的途徑。但血漿中母體來源的DNA佔總DNA的比例非常高，一定程度上提高了檢測胎兒DNA的難度。目前，游離DNA在臨床上主要用於對父源性 DNA檢測，如SRY基因型鑑定胎兒性別、檢測RhD血型及其它父源性遺傳性疾病檢測。產前診斷最常見的是21三體等非整倍體疾病檢測，它要求對染色體拷貝數量進行精確定量，這對於游離DNA來說是個挑戰。2000年，Poo等發現妊娠婦女血漿存在游離的胎兒RNA。同游離DNA相比，游離RNA的優勢在於前者主要依靠Y染色體相關基因檢測判斷，不適應於女性胎兒的檢測，而游離RNA能擴大其檢測範圍；同時，游離DNA在母體血漿中含量低，而游離RNA能夠排除母體背景幹擾，檢測更適用於產前診斷。研究發現，一些腫瘤患者腫瘤組織中腫瘤相關基因表達與體液中游離腫瘤相關性基因RNA表達密切相關，游離RNA作為腫瘤標誌物鑑別良惡性病變具有較好的特異性和敏感性。具有轉移潛能的腫瘤細胞在術前或術時脫離原發灶，以非常少的數量轉移到淋巴結、 骨髓、血液或遠處器官中，普通的檢測手段不能發現，腫瘤的微轉移是腫瘤復發和轉移的重要起始步驟，及時診斷微轉移有助於對臨床治療方案選擇和預後的判斷，游離RNA是腫瘤微轉移、監測療效、預後判斷的有效標誌物。游離RNA作為一個新興的研究領域，許多方法和技術尚處於探索階段。它作為一種非侵入性的早期檢測手段，能在許多領域廣泛地應用，目前的研究中已顯示出了良好的發展前景。本發明擬提供一種從血清、血漿等無細胞體液中提取游離RNA的方法及提取試劑盒，可以應用於生物醫學領域。本發明的提取方法是按照以下步驟完成的1)化學法釋放核酸；2)酚氯仿抽提； 3) RNA在特定條件下吸附於二氧化矽表面；4)洗滌去除雜質；5)洗脫得到RNA。本發明提供的游離RNA提取方法，其特徵在於1)釋放核酸所用裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)釋放核酸所用裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是 Triton X-100、Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提中所用的酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為PH小於7. O的飽和酚； 4) RNA吸附介質可以是玻璃粉、玻璃纖維及其它表面包覆有SiO2的材料；5)洗滌時所用洗滌液中含有5% -100%的乙醇；6)洗滌時所用洗滌液中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。7)洗脫時所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。本發明提供的提取試劑盒，包括以下幾種組份裂解液、酚氯仿抽提液、洗滌液1、 洗滌液2、洗脫液、矽膠柱、使用說明書。本發明提供的提取試劑盒，其特徵在於1)裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是Triton X_100、 Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為pH小於 7. 0的飽和酚；4)洗滌液1中含有5% -100%的乙醇和異丙醇中的一種或兩種；5)洗滌液1中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。6)洗滌液2中含有5% -100%的乙醇；7)洗脫時所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。本發明所提供的游離RNA提取方法及試劑盒具有簡便、快速、得率高、產物純度高、便宜等優勢，適用於從血清、血漿等無細胞體液中快速分離RNA，所得RNA可以直接應用於聚合酶鏈式反應等分子生物學實驗。
具體實施方式儘管本發明的內容是結合本實例進行說明，但是不能認為是對本發明專利的限制，本發明的範圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的範圍內對本發明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣屬本發明的保護範圍。實施例1試劑成分裂解液2.4M GuSCN, IOOmM Tris (pH 7. 5) ,0. 5% Triton X-100酚氯仿抽提液苯酚氯仿等體積混勻。洗滌液1 1. 75M GuSCN, 25mM Tris (pH 7. 5)，15% 乙醇洗滌液2 :25mM Tris (pH 7. 5)，70% 乙醇洗脫液DEPC處理水實施例2游離RNA提取方法1)取300yL新鮮分離的血漿或血清，加入等量裂解液，振蕩混勻。2)冰上放置 5min。3)加入等體積酚氯仿抽提液，蓋上蓋子，劇烈振蕩30 60s。4) 12000g 離心 lOmin。5)轉移上層水相至新的離心管中，加入1. 25倍體積的無水乙醇，渦旋混勻。6)將步驟5的混合液加到矽膠柱中，IOOOOg離心30s。7)棄去濾過液，將矽膠柱放回到原來的收集管中。
8)加入500 μ L洗滌液1，IOOOOg離心30s，棄去濾過液，將矽膠柱放回到原來的收
集管中。9)加入600 μ L洗滌液2，IOOOOg離心30s，棄去濾過液，將矽膠柱放回到原來的收
集管中。10)重複步驟9 一次。11) IOOOOg離心lmin，以除盡殘留的醇類。12)將矽膠柱放置在一個新的1. 5mL離心管中，加50 100 μ L預熱(95°C )的洗脫液到矽膠柱的濾膜中央。13) IOOOOg 離心 lmin，，收集濾液(純化的 RNA)，_20°C或 _80°C保存。實施例3效果比較1)分別用Ambion的mirVana PARIS Kit和本發明所述的游離RNA提取試劑盒提取同一份血漿樣本，操作步驟分別參照Mirvana PARIS Kit說明書及實施例2中所述方法；2)產物用100 μ L洗脫液洗脫，對所得產物進行OD值檢測，比對其純度和濃度；3)每個樣品取5 μ L進行實時PCR檢測；4)逆轉錄採用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 進行逆轉錄操作。表1逆轉錄體系
權利要求
1.一種從無細胞體液中提取RNA的方法，該提取方法是按照以下步驟完成的1)化學法釋放核酸；2)酚氯仿抽提；3) RNA在特定條件下吸附於二氧化矽表面；4)洗滌去除雜質； 5)洗脫得到RNA。
2.如權利1所述提取RNA的方法，其特徵在於1)釋放核酸所用裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)釋放核酸所用裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是Triton X-100, Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提中所用的酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為PH小於7. 0的飽和酚；4)RNA吸附介質可以是玻璃粉、玻璃纖維及其它表面包覆有SiO2的材料；5)洗滌時所用洗滌液中含有5%-100%的乙醇；6)洗滌時所用洗滌液中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。7)洗脫時所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。
3.一種從無細胞體液中提取RNA的試劑盒，該包括以下幾種組份裂解液、酚氯仿抽提液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、矽膠柱、使用說明書。
4.如權利3所述提取RNA的試劑盒，其特徵在於1)裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是TritonX-100,Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為pH小於7.0 的飽和酚；4)洗滌液1中含有5%-100%的乙醇和異丙醇中的一種或兩種；5)洗滌液1中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。6)洗滌液2中含有5%-100%的乙醇；7)洗脫時所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。
全文摘要
本發明提供了一種從生物樣品中提取游離RNA的方法，其具體步驟包括用化學試劑將生物樣品中的核酸釋放出來；酚氯仿抽提出遊離RNA；抽提出的游離RNA在高鹽條件下與矽膠柱結合；洗滌去除雜質；低鹽條件下洗脫，得到高純度的游離RNA。本發明還提供了一種游離RNA提取試劑盒。
文檔編號C12N15/10GK102286462SQ201110177638
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日 公開號201110177638.9
發明者朱海, 李富榮, 李金峰, 林季敏, 湯順清, 齊暉 申請人:暨南大學, 深圳市易瑞生物技術有限公司