生產嘌呤核苷酸的方法

2023-06-25 06:22:21

專利名稱：生產嘌呤核苷酸的方法
技術領域：
本發明涉及生產作為調味劑被大量需求的嘌呤核苷酸的方法，以及對所述方法有用的微生物。
5』-鳥苷酸(下文簡稱為GMP)和5』-肌苷酸(下文簡稱為IMP)是表現出強的增味活性的嘌呤核苷酸，其被廣泛用作化學調味成分。
已知一些生產上述增味核苷酸的方法例如，包括用核糖核酸酶P1水解提取自酵母細胞的RNA，然後分離和純化所需的5』核苷酸的方法[食品技術，18，287(1964)]；通過使用具有生產IMP之能力的微生物進行發酵以直接生產IMP的方法[農業和生物化學，46，2257(1982)]；包括通過化學磷酸化將如肌苷和鳥苷的核苷轉變為核苷酸的方法[日本化學會公報，42，3505(1969)]；包括使用巨大芽孢桿菌的突變體進行發酵以生產5-氨基-4-咪唑氨甲醯核苷(下文簡稱為AICAR)，然後通過化學合成由AICAR生產核苷酸的方法[生物技術與生物工程，9，329(1967)；有機化學雜誌，32，1825(1967)]；和包括在培養基中培養生產5』-黃苷酸(下文簡稱為XMP)的產氨棒狀桿菌突變體以形成和積累XMP，培養經自身-克隆使其XMP氨基酶(GMP合成酶)活性增強的大腸桿菌，然後使用經培養的大腸桿菌細胞作為酶源，通過酶反應由XMP生產GMP的方法[Biosci.Biotech.Biochem，61，840(1997)；日本公開未審專利申請233798/88]。
總的說來，迄今為止已開發的生產增味核苷酸的方法在原理上可分為三類[Shoichi Takao等(編)，Oyo Biseibutsugaku(應用微生物學)，Buneido Shuppan(1996)](1)酵母RNA被得自微生物的酶降解或被化學降解的方法(RNA降解法)，(2)通過在含有糖，氮源和磷酸源的培養基中培養微生物的突變體以直接生產核苷酸的方法(直接發酵法)，和(3)包括通過發酵生產核苷酸合成所用的中間體，並通過化學或酶學方法將所述中間體轉變為核苷酸的方法(該方法是發酵和化學合成或酶促轉變的聯合)。
在RNA降解法(上文方法(1))中，所產生的嘧啶核苷酸的量與增味的嘌呤核苷酸的量幾乎相同，因此，必需的純化步驟變得複雜。在直接發酵法(上文方法(2))中，由於核苷酸的膜透性低，難以培養能在細胞外形成和積累相當量的核苷酸的微生物，因此難以獲得在經濟上令人滿意的核苷酸生產能力。具體地說，迄今為止還沒有一種方法可以直接生產GMP。然而，已知XMP可例外地大量形成和積累[Shoichi Takao等(編)，Oyo Biseibutsugaku(應用微生物學)，BuneidoShuppan(1996)]。目前，在經濟上有利的生產增味核苷酸的方法是發酵和化學合成或酶促轉變的聯合(方法(3))，該方法可廣泛用於工業化生產核苷酸。
在此聯合方法中，改善整個生產能力的一個要點是增加發酵步驟(此方法的第一階段)中核苷酸合成所用中間體的產量。為此，培養了大量具有高的XMP，鳥苷或肌苷生產能力的微生物[農業和生物化學，42，399(1978)；農業和生物化學，43，1739(1979)；農業和生物化學，46，2347(1982)]。
已開發了多種將中間體化學或酶學轉變為核苷酸的方法(此方法的第二階段)。關於化學方法，在工業上使用的是位點特異性磷酸化反應(核苷至5』-核苷酸)[日本化學會公報，42，3505(1969)]。然而，化學磷酸化反應需要中間步驟以將作為磷酸基團受體的核苷純化至必需的程度，除了用於發酵步驟發酵罐外還需要使用化學反應容器。因此，作為替代方法，人們注意到使用氨基酶或磷酸化酶的酶法，並對其進行了研究。至於氨基化，使用XMP氨基酶的方法是已知的[ShoichiTakao等(編)，Oyo Biseibutsugaku(應用微生物學)，BuneidoShuppan(1996)]。
至於磷酸化，使用磷酸轉移酶，激酶和磷酸酶的方法是已知的。特別是已證明使用激酶或磷酸酶的反應是有效的方法。例如，已開發了一種通過使用大腸桿菌菌株生產5』-核苷酸的方法，該菌株攜有編碼大腸桿菌肌苷-鳥苷激酶的基因(WO91/08286)；還開發了一種通過使用產氨棒狀桿菌菌株生產5』-核苷酸的方法，該菌株攜有編碼乙醯微小桿菌肌苷-鳥苷激酶的基因(WO96/30501)；和另一種通過使用大腸桿菌菌株生產5』-核苷酸的方法，該菌株攜有通過將隨機突變引入摩氏摩根氏菌的磷酸酶基因而製備的基因[日本公開未審專利申請37785/97，日本公開未審專利申請201481/98]。
至於磷酸基團供體，已研究了多種化合物。例如，使用下列物質的方法是已知的P-硝基苯基磷酸(日本公開未審專利申請2985/64)，無機磷酸(日本公開未審專利申請1186/67，日本公開未審專利申請44350/74)，多聚磷酸(日本公開未審專利申請56390/78)，乙醯磷酸(日本公開未審專利申請82098/81)，ATP(日本公開未審專利申請230094/88)，多聚磷酸，苯基磷酸和氨甲醯磷酸(日本公開未審專利申請37785/97)和焦磷酸(日本公開未審專利申請37785/97，日本公開未審專利申請201481/98)。
然而，由於所用的底物是昂貴的或不穩定的，而且因產物反應的形成使得純化步驟變得複雜等，這些方法在工業上無利可圖。有關符合經濟需求的實用方法，已開發了使用ATP-再生系統的核苷酸生產系統。在此系統中，微生物在糖類代謝的過程中利用無機磷酸由AMP或ADP再生ATP。例如，已建議使用一種方法，其中可生產XMP的微生物所具有的通過代謝葡萄糖以生物合成ATP的活性被用作ATP再生系統。多篇文獻教導了使用便宜的葡萄糖和無機磷酸作為ATP再生底物而不是使用ATP生產GMP的方法，該方法中將上述ATP-再生系統與能由XMP和ATP形成GMP的微生物的XMP氨基酶活性相結合[Biosci.Biotech.Biochem，61，840(1997)]，類似的方法使用肌苷激酶作為酶以生產IMP(日本公開未審專利申請230094/88)。
用於生產GMP或IMP的方法中使用了兩種微生物，所述方法包括通過直接發酵生產XMP，鳥苷或肌苷的發酵步驟，和將發酵產物酶促轉變為GMP或IMP的反應步驟。
即，在作為該方法第一階段的發酵步驟中，將突變體培養物用作生產XMP-，鳥苷-或肌苷-的微生物(生產微生物)。在作為該方法第二階段的氨基化或磷酸化的反應步驟中，使用了攜有高表達基因的微生物(轉變微生物)，所述基因編碼的蛋白質具有XMP氨基酶活性或肌苷-鳥苷激酶活性。
通過第二階段所用的轉變微生物和第一階段所用的生產微生物的ATP再生活性，可再生第二階段反應所必需的ATP。
因此，第二階段的反應步驟是將XMP氨基酶活性或肌苷-鳥苷激酶活性與兩種微生物的ATP再生活性相結合的系統。
整個方法的概況將在下文描述。
首先，在大發酵罐中，在主要含有糖和氮源的培養基中培養生產微生物以形成和積累XMP，鳥苷或肌苷。另外，在小發酵罐中培養轉變微生物。當第一階段的發酵完成之後，將分開培養的轉變微生物加入大發酵罐中以在便宜的能量供體和磷酸基團供體的存在下進行磷酸化反應或氨基化反應。
相對於上述化學磷酸化方法而言，利用酶反應的上述方法是有利的。然而，該方法的效率仍不能令人十分滿意，因為培養轉變微生物必需小發酵罐，考慮到需加入轉變微生物，第一階段的發酵步驟所用的培養基必需減少，這會減少每批所得的所需核苷酸的量。
本發明的目的是開發一種能在一個發酵罐中有效生產嘌呤核苷酸的方法。
本發明人尋求開發更好的生產嘌呤核苷酸之方法的可能性，該方法通過將能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因導入能生產嘌呤核苷酸前體的發酵微生物中，並調節該基因在發酵步驟和反應步驟中的表達，可僅在一個發酵罐中使用一種微生物依次進行生產核苷酸前體的發酵過程和將所述前體轉變為核苷酸的反應。在尋求可能性的過程中進行了創造性的研究，結果完成了本發明。
本發明涉及下列(1)-(19)。(1)生產嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括在培養基中培養微生物，該微生物能生產嘌呤核苷酸前體，並攜有導入的DNA，所述DNA可誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶；使所述的嘌呤核苷酸前體在培養基中積累；誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前體形成嘌呤核苷酸並在培養基中積累；從培養基中回收所述的嘌呤核苷酸。(2)根據上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前體是5』-黃苷酸，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5』-黃苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。(3)根據上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。(4)根據上文(1)的方法，其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-肌苷酸。(5)根據上文(1)的方法，其中微生物屬於選自棒狀桿菌，大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。(6)根據上文(1)的方法，其中微生物是產氨棒狀桿菌。(7)根據上文(1)的方法，其特徵在於通過改變條件或通過將碳源由糖改變為非糖來誘導和表達能合成嘌呤核苷酸的酶，所述條件的改變選自溫度的升高，pH的升高和滲透壓的升高。(8)根據上文(7)的方法，其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。(9)可誘導和表達能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的DNA。(10)根據上文(9)的DNA，該DNA通過改變條件或通過將碳源由糖改變為非糖來誘導和表達能合成嘌呤核苷酸的酶，所述條件的改變選自溫度的升高，pH的升高和滲透壓的升高。(11)根據上文(10)的DNA，其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。(12)根據上文(9)或(10)的DNA，該DNA是pLAC857或pIGK2。(13)微生物，該微生物能生產嘌呤核苷酸前體，並攜有導入的DNA，所述DNA可誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶。(14)根據上文(13)的微生物，其中嘌呤核苷酸的前體是5』-黃苷酸，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5』-黃苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。(15)根據上文(13)的微生物，其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。(16)根據上文(13)的微生物，其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-肌苷酸。(17)根據上文(13)的微生物，其中微生物屬於選自棒狀桿菌，大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。(18)根據上文(13)的微生物，其中微生物是產氨棒狀桿菌。(19)根據上文(18)的微生物，其中微生物是產氨棒狀桿菌ATCC6872/pLAC857(FERM BP-6639)或產氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2(FERMBP-6638)。
附圖簡述


圖1顯示了質粒pLAC857的結構。
圖2顯示了質粒pGUA2的結構。
圖3顯示了質粒pIGK2的結構。
圖中所用的符號表示PLPL啟動子guaA大腸桿菌的XMP氨基酶基因C.glt ORI穀氨酸棒狀桿菌的複製起點Spcr壯觀黴素抗性基因cI857溫度敏感型阻抑蛋白基因TICL穀氨酸棒狀桿菌的異檸檬酸裂合酶基因的終止子igk大腸桿菌的肌苷-鳥苷激酶基因Kmr卡那黴素抗性基因Apr氨苄青黴素抗性基因大腸桿菌ORI大腸桿菌的複製起點本發明提供了這樣一種方法，其中在一個發酵罐中使用一種微生物依次進行通過直接發酵生產嘌呤核苷酸前體的發酵過程和將所述發酵步驟中生產的前體酶促轉變為嘌呤核苷酸的反應步驟。
已發現下列三個需求對所述方法的建立是至關重要的。
第一個需求是在通過直接發酵生產嘌呤核苷酸前體的發酵過程中，編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因的表達需要被抑制到某一水平以使發酵基本上不被幹擾。
如果所述酶的表達不被抑制，發酵過程中會通過所述酶的活性在細胞內形成和積累嘌呤核苷酸，而且，因下列原因使得發酵產量降低當GMP作為嘌呤核苷酸被積累時，誘導了嘌呤生物合成途徑中的關鍵酶的反饋抑制，從而停止生產XMP。當IMP被積累時，肌苷的生成形成無效循環，導致ATP的浪費。因此，細胞內形成和積累嘌呤核苷酸降低了發酵產量，這可導致經濟損失。
第二個需求是在由其前體合成嘌呤核苷酸的反應步驟中，能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的活性需要被充分誘導。
第三個需求是經發酵和誘導處理的生產微生物需要保留足夠的ATP再生活性和轉變反應所需的磷酸化或氨基化活性，這些活性需要在反應步驟中充分發揮作用以由其前體合成嘌呤核苷酸。
用於本發明的微生物可以是野生型菌株，突變體，融合的細胞系，轉導子或利用重組DNA技術得到的重組菌株，條件是該微生物能生產嘌呤核苷酸的前體並具有ATP再生活性。優選的微生物包括屬於棒狀桿菌，大腸桿菌和芽孢桿菌屬的微生物，它們可用於核酸發酵和胺基酸發酵。特別優選的是具有強的ATP再生活性的產氨棒狀桿菌。
嘌呤核苷酸的前體包括XMP，鳥苷，肌苷，腺苷等。
ATP再生活性指的是在微生物代謝糖以作為能量供體底物的方法中，使用無機磷酸由AMP或ADP再生ATP的活性。這一ATP再生系統是糖類代謝系統和能量代謝系統，如糖酵解途徑，TCA循環和電子轉運系統的一部分，幾乎所有微生物都具有此活性。
用於本發明的具體微生物的例子包括下列菌株及其衍生的突變體。
產氨棒狀桿菌ATCC 6872產氨棒狀桿菌ATCC 21295產氨棒狀桿菌ATCC 21477穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13032穀氨酸棒狀桿菌ATCC 14067穀氨酸棒狀桿菌ATCC 13869大腸桿菌ATCC 14948大腸桿菌ATCC 11303大腸桿菌ATCC 9637枯草芽孢桿菌ATCC 14618至於本發明中使用的能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶，可使用任何能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶，適當的例子包括XMP氨基酶，肌苷-鳥苷激酶，磷酸酶和腺苷酸激酶。
編碼上述酶的DNA的例子見下文。
編碼XMP氨基酶的基因包括那些得自大腸桿菌[核酸研究，13，1303(1985)]，枯草芽孢桿菌[核酸研究，18，6710(1990)]，產氨棒狀桿菌(基因庫編號g2765074)等基因。
編碼肌苷-鳥苷激酶的基因包括那些得自大腸桿菌(WO91/08286)，乙醯微小桿菌(WO96/30501)等的基因。
編碼磷酸酶的基因包括那些得自摩氏摩根氏菌(日本公開未審專利申請37785/97，日本公開未審專利申請201481/98)等的基因。
編碼腺苷酸激酶的基因包括那些得自釀酒酵母[生物化學雜誌，263，19468(1988)]的基因。
可通過已知方法得到編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因。
例如，對編碼XMP氨基酶的基因而言，可根據XMP氨基酶結構基因序列兩端的序列合成引物，使用製備的引物和大腸桿菌染色體DNA，枯草芽孢桿菌染色體DNA或產氨棒狀桿菌染色體DNA，通過聚合酶鏈反應(PCR)法可得到XMP氨基酶結構基因。
對編碼肌苷-鳥苷激酶的基因而言，可根據肌苷-鳥苷激酶結構基因序列兩端的序列合成引物，使用製備的引物和大腸桿菌染色體DNA或乙醯微小桿菌染色體DNA，通過PCR法可得到肌苷-鳥苷激酶結構基因。類似地，通過使用PCR法，可由摩氏摩根氏菌染色體DNA得到磷酸酶結構基因，可由釀酒酵母染色體DNA得到腺苷酸激酶的結構基因。
將由此獲得的編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因插入適當的誘導型表達載體中，以使基因處於能調控其誘導和表達的轉錄和翻譯信號的控制之下，籍此得到可調控所述基因之表達的重組質粒。
對誘導型表達載體沒有特別的限制，只要它能在所用的微生物中複製並滿足下列三個條件即可。
首先，需將編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因的表達抑制到某一水平，以使通過直接發酵生產嘌呤核苷酸前體的發酵步驟中的發酵基本上不被幹擾。
第二，在由其前體合成嘌呤核苷酸的反應步驟之前進行誘導處理以充分誘導能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的活性。
第三，所述誘導方法是在誘導處理之後能使生產微生物保留足夠的ATP再生活性和轉變活性的方法。
滿足上述三個條件的載體的例子包括pPAC31，其含有PL啟動子/cI857阻抑蛋白基因，在高溫下可被誘導(WO98/12343)；pBB1，其含有lac啟動子/lacIts阻抑蛋白基因，在高溫下可被誘導(基因，70，415(1988))；pRK248cIts，其含有PL啟動子/cI857阻抑蛋白基因，在高pH下可被誘導[基因，97，125(1991)]；pOSEX2，其含有proU表達-調控區，在高滲透壓下可被誘導[基因，151，137(1994)]；pTrc99A，其含有trc啟動子/lacIq阻抑蛋白基因，可被異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導[基因，69，301(1988)]；pAL9181，其含有araBAD啟動子/araC阻抑蛋白基因，可被L-阿拉伯糖誘導[應用微生物學與生物技術，37，205(1992)]，以及通過將碳源由糖變為非糖而誘導的載體。這些載體是為大腸桿菌構建的誘導型表達載體。
另外，也可以使用通過用突變技術或重組DNA技術修飾與上述誘導型表達載體中的表達調控相關的轉錄-翻譯信號區域得到的載體。
當這些已知的誘導型表達載體或經進一步改良的載體被用於非大腸桿菌的宿主細胞時，應在其中插入在宿主中起作用的複製起點。例如，當產氨棒狀桿菌被用作宿主時，可在所述載體中插入得自穀氨酸棒狀桿菌之質粒的複製起點，該複製起點可在產氨棒狀桿菌或類似菌株中起作用。
得自穀氨酸棒狀桿菌的質粒包括pCG1(日本公開未審專利申請134500/82)，pCG2(日本公開未審專利申請35197/83)，pCG4(日本公開未審專利申請183799/82)，pAM330(日本公開未審專利申請67699/83)和pAG1，pAG3，pAG14和pAG50(日本公開未審專利申請166890/87)。
在棒狀桿菌中起作用的優選載體包括可通過升溫被誘導的質粒載體，該載體是通過將高溫下可被誘導的大腸桿菌載體pPAC31攜有的PL啟動子/cI857基因與可在棒狀桿菌中自主複製的載體連接而製備的；和能被非糖碳源，如醋酸誘導的載體pCEX2(日本公開未審專利申請224259/91)。
另一方面，當與誘導型表達載體中的基因表達調控相關的轉錄-翻譯信號不在所用的微生物中起作用時，或當其起作用，但上述三個需求不能充分滿足時，必需通過突變技術或重組DNA技術改良所述轉錄-翻譯信號區域以使上述三個需求能被滿足，或必需研製適用於所述微生物的新的誘導和表達系統。在前一種情況下，可通過例如涉及所用微生物的已知轉錄-翻譯信號序列的定點誘變進行改良。在後一種情況下，可根據為大腸桿菌等構建的上述一般性誘導-表達系統的研製方法開發和構建新系統。
攜有可誘導的-表達系統的微生物的優選例子為產氨棒狀桿菌菌株，分別將溫度誘導型質粒載體和能通過加入便宜的醋酸調控表達的pCEX2用作基因誘導和表達系統可產生這些菌株，所述溫度誘導型質粒載體是通過將高溫下可被誘導的大腸桿菌載體pPAC31攜有的PL啟動子/cI857基因與可在棒狀桿菌中自主複製的載體連接而製備的。
在本發明中，編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的基因可存在於載體質粒中，或可摻入宿主微生物的染色體中，只要滿足上述三個需求即可。即，可使用攜有含基因之質粒的菌株或基因已摻入染色體中的菌株，只要所述基因的表達能被適當調控即可。
通過使用原生質體法，電脈衝法，氯化鈣法，和分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社(1989)(下文簡稱為分子克隆，第2版)所述的常規方法等，可將含有編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因的誘導型表達質粒導入生產嘌呤核苷酸前體的微生物中。
例如，當棒狀桿菌屬的細菌被用作宿主微生物時，特別有效的方法是原生質體法(日本公開未審專利申請183799/82)和電脈衝法(日本公開未審專利申請207791/90)。當大腸桿菌被用作宿主微生物時，也可使用氯化鈣法[分子生物學雜誌，53，159(1970)]等。
通過在含有碳源，氮源和無機物，以及必需的痕量有機營養物的普通培養基中，培養本發明所得的攜有編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的導入基因的轉化子以形成和積累嘌呤核苷酸前體，然後對所得培養物進行誘導處理，如加熱或加入醋酸即可誘導和表達能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶。
至於上述發酵步驟所用培養基中的碳源，可使用任何能被所述微生物同化的碳源。適當碳源的例子是糖類，如葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜，赤糖糊和澱粉水解物；醇類，如乙醇，甘油和山梨糖醇；有機酸，如丙酮酸和乳酸，和如甘氨酸，丙氨酸，穀氨酸和天冬氨酸的胺基酸。其優選濃度範圍為5-30％。
氮源的例子包括氨，多種無機和有機銨鹽，如氯化銨，硫酸銨，硝酸銨，碳酸銨，醋酸銨和磷酸銨，尿素，多種胺基酸，蛋白腖，NZ胺，肉汁浸膏，酵母膏，玉米浸出汁，酪蛋白水解物，魚粉及其消化物。
無機物的例子包括磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，磷酸鎂，氯化鈉，硫酸鐵，硫酸錳，硫酸鋅和碳酸鈣。
當所用微生物需要特別的營養成分，如胺基酸，核酸和維生素用於生長時，可在培養基中加入適當量的這些物質。
在需氧條件下進行培養，例如，在通氣條件下進行振蕩培養或旋動培養。最適溫度通常是26-37℃，培養期通常為1至5天。
在適用於所用載體的條件下進行誘變處理以表達編碼能由其前體合成嘌呤核苷酸之酶的基因；例如，優選在下列條件下處理下述載體。
pPAC31或pBB137-42℃通氣旋動培養1-24小時pRK248cItspH9下培養1-24小時pOSEX250-300 mmol/l NaCl存在下培養1-24小時pTrc99A0.1-0.5 mmol/l IPTG存在下培養1-24小時pAL9181加入0.2％L-阿拉伯糖培養1-24小時pCEX2加入0.1-2％醋酸銨或醋酸鈉培養1-24小時優選在反應步驟中加入表面活性劑以由其前體合成嘌呤核苷酸。
至於表面活性劑，優選可促進嘌呤核苷酸滲透穿過細胞膜的表面活性劑。適當的例子是陽離子表面活性劑，如聚氧化乙烯硬脂胺(如Nymeen S-215，NOF公司)，鯨蠟基三乙基溴化銨，Cation FB和CationF2-40E；陰離子表面活性劑，如硫酸油醯基鈉(sodium oleylamidesulfate)，Newrex TAB和Rapizole 80；和兼性表面活性劑，如聚氧乙烯山梨糖醇酐一硬脂酸(如Nonion ST221)。表面活性劑的常用濃度為0.1-50mg/ml，優選為1-20mg/ml。
於20-40℃，pH 6-8時，將由其前體合成嘌呤核苷酸之步驟中的反應進行1-48小時。
完成反應之後，可通過已知方法回收反應混合物中形成和積累的嘌呤核苷酸，所述方法如除去微生物細胞並通過濃縮結晶核苷酸，活性炭處理和離子交換樹脂法[Isao Endo等，Kagakukogakkai(TheSociety of Chemical Engineers，Japan)(編)Bioseparation ProcessBinran(生物分離方法手冊)，Kyoritsu Shuppan(1996)]。
下列實施例闡明了本發明的某些實施方案，這些實施例並不能限制本發明的範圍。除非特別說明，根據分子克隆，第2版所述的方法進行基因工程方法。實施例1構建生產XMP的產氨棒狀桿菌菌株並由該菌株生產GMP，所述菌株攜有處於PL啟動子控制之下的大腸桿菌XMP氨基酶基因(1)構建誘導型表達質粒pLAC857，該質粒能通過溫度的改變調節XMP氨基酶基因的表達通過下列兩個步驟由已知質粒pPLA66構建熱誘導型表達質粒pLAC857。pPLA66是高水平表達XMP氨基酶的質粒，通過將XMP氨基酶基因連接至PL啟動子與trpL SD序列的下遊即可構建該質粒[Biosci.Biotech.Biochem.，61，840(1997)]。
按下列方法將溫度敏感型阻抑蛋白基因cI857插入質粒pPLA66。
用EcoRI(5單位)和BglII(5單位)裂解質粒pPLA66(1μg)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離裂解的片斷，使用QIAEXII(QIAGEN有限公司)從凝膠中回收DNA片斷，該片斷含有PL啟動子和得自大腸桿菌的XMP氨基酶基因(guaA基因)區域。
用EcoRI(5單位)和BamHI(5單位)裂解攜有cI857基因的質粒pPAC31(WO98/12343)(1μg)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離裂解的片斷，從凝膠中回收DNA片斷，該片斷含有cI857基因，氨苄青黴素抗性基因和得自大腸桿菌的複製起點。
使用連接試劑盒(Takara Shuzo有限公司)將含有所述基因的DNA片斷和先前製備的含有guaA基因的DNA片斷相連接。
使用連接混合物轉化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo有限公司)，然後鋪於含有100μg/ml氨苄青黴素的L瓊脂培養基上，得到氨苄青黴素抗性轉化子。
通過鹼性細菌裂解法從所得轉化子中提取質粒DNA。
用多種限制性酶裂解質粒並分析之，從而證實得到質粒pLA857，其含有XMP氨基酶基因，cI857基因，氨苄青黴素抗性基因和在大腸桿菌中自主複製的質粒的複製起點，它們處於PL啟動子控制之下。
按下列方法將在棒狀桿菌中自主複製的質粒的複製起點插入質粒pLA857。
用PstI(5單位)裂解質粒pLA857(1μg)上存在的唯一的PstI-裂解位點，通過瓊脂糖凝膠電泳分離裂解的片斷，從凝膠中回收這些片斷，籍此得到pLA857的PstI-裂解片斷。
用PstI(5單位)裂解可在產氨棒狀桿菌中複製的質粒載體pCG116(日本公開未審專利申請265892/89)(1μg)，通過鹼性磷酸酶處理進行DNA去磷酸化以防止再結合之後，用苯酚提取並用乙醇沉澱，從而得到pCG116的PstI-裂解片斷。
使用上述連接試劑盒將所得的pLA857的PstI-裂解片斷與pCG116的PstI-裂解片斷相連接。
利用電脈衝法[應用微生物學與生物技術，30，283(1989)]將1μg通過連接處理得到的DNA轉化至產氨棒狀桿菌ATCC 6872中，然後鋪於含有100μg/ml壯觀黴素的A瓊脂培養基上
。
通過鹼性細菌裂解法從所得的壯觀黴素抗性轉化子中提取質粒DNA。
用多種限制性酶裂解質粒並分析之，從而證實所得轉化子攜有質粒pLAC857，其具有
圖1所示的所需結構。
根據布達佩斯條約，於1999年2月5日將攜有pLAC857的產氨棒狀桿菌ATCC 6872/pLAC857保藏於日本工業科學和技術研究院，國立生物科學和人類-技術研究所(National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-0046，其保藏號為FERM BP-6639。(2)測定通過將pLAC857導入菌株FERM BP-1261所製備菌株的XMP氨基酶活性通過鹼性細菌裂解法從產氨棒狀桿菌ATCC 6872/pLAC857(FERMBP-6639)中提取質粒pLAC857。
通過上述電脈衝法，使用所述質粒轉化XMP生產菌株產氨棒狀桿菌FERM BP-1261(日本專利2618383腺嘌呤-滲漏需求型和鳥嘌呤需求型)。
通過鹼性細菌裂解法從所得的壯觀黴素抗性轉化子中提取質粒DNA。
用多種限制性酶裂解質粒並分析之，從而證實所得轉化子攜有質粒pLAC857。
分別於30℃和37℃，在含有100μg/ml壯觀黴素的A培養基(從A瓊脂培養基中除去瓊脂的培養基)上將攜有pLAC857的XMP生產菌株FERM BP-1261振蕩培養24小時。
培養完成之後，通過離心從各個培養物中得到細胞。
用100mmol/l Tris-HCl(pH7.0)將所得細胞洗滌兩次並懸浮於10ml相同緩衝液中。
在所得懸浮液中加入10g玻璃珠(Shinmaru Enterprises有限公司，0.1-0.2φ)，接著在冰浴中使用勻漿器(Nippon Seiki有限公司)破碎10分鐘。
4℃下，將所得懸浮液離心(14000×g)10分鐘，回收上清液作為細胞提取物。
42℃下，在1.15ml含有先前已加熱至42℃的細胞提取物的反應混合物[160mmol/l Tris-HCl(pH8.6)，12mmol/l ATP Na2.3H2O，16mmol/l MgSO4.7H2O和40mmol/l(NH4)2SO4]中加入0.1ml 0.3M XMP起始反應。15分鐘之後，在反應混合物中加入3.9ml 3.5％高氯酸以終止反應。
以3000rpm離心反應混合物10分鐘，測定上清液於290nm下的光吸收。將1分鐘內形成1μmol GMP的活性定為1個單位(U)，計算每毫克蛋白質的比活。使用蛋白質檢測試劑盒(BioRad Laboratories)測定蛋白質的量。
結果示於表1。在30℃培養的細胞中未檢測到活性，而在37℃培養的細胞中檢測到活性。這些結果表明XMP氨基酶基因的表達處於攜有pLAC857之FERM BP-1261菌株的PL啟動子控制之下，通過改變溫度可以調節所述酶的活性。表1
(3)通過攜有pLAC857的XMP生產菌株FERM BP-1261生產GMP30℃下，在含有20μg/ml壯觀黴素的A瓊脂培養基上將攜有pLAC857的FERM BP-1261菌株培養2天。將所得細胞接種於含有60mlC種子培養基的250ml錐瓶中，所述種子培養基中含有20μg/ml壯觀黴素，其配方是5％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白腖，0.25％氯化鈉，0.3％尿素，150mg/l腺嘌呤和150mg/l鳥嘌呤(pH7.2)，接著於30℃振蕩培養24小時。
將所得的全部培養物接種於2升發酵罐中，其中含有0.94升D種子培養基[8.8％葡萄糖，1.7％肉膏，1.7％蛋白腖，0.167％KH2PO4，0.167％K2HPO4，0.167％MgSO4.7H2O，333mg/l腺嘌呤，350mg/l鳥嘌呤，33mg/l FeSO4.7H2O，17mg/l ZnSO4.7H2O，6.7mg/l MnSO4.4-6H2O，25mg/l β-丙氨酸，33mg/l L-半胱氨酸，167μg/l生物素，1.3mg/lCuSO4.5H2O和8.3mg/l硫胺素(pH7.2)]，接著，於30℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養24小時，培養過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
將所得培養物(120ml)接種於含0.88升F發酵培養基的2升發酵罐中，所述發酵培養基的配方是8％葡萄糖，1.67％正磷酸，1.29％KOH，1.2％ MgSO4.7H2O，123mg/l CaCl2.2H2O，24.6mg/l FeSO4.7H2O，12.3mg/l MnSO4.4-6H2O，12.3mg/l ZnSO4.7H2O，18.5mg/l β-丙氨酸，24.6mg/l L-半胱氨酸，6.2mg/l煙醯胺，24.6mg/l組氨酸，185μg/l生物素，2.5mg/l CuSO4.5H2O，203mg/l腺嘌呤和10mg/l鳥嘌呤(pH7.2)，接著，於28℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養44小時，培養過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
完成培養之後，按下列方法通過HPLC測定培養物上清液中積累的XMP和GMP的量。
HPLC分析的條件柱Asahipak GS-320H(Asahi Chemical Industry有限公司)洗脫液0.2M NaH2PO4(pH3.0)流速1mL/min檢測UV 254nm通過測定UV 254nm下的光吸收值並與標準值相比較以測定積累的XMP和GMP的量。
HPLC分析的結果是XMP形成和積累的量是27.2g/l，但未檢測到GMP。
為了誘導和表達XMP氨基酶基因，將培養肉湯加熱至40℃，在相同溫度下攪拌(600rpm)並通氣(1L/min)6小時，其間用5.5M氨水將pH維持在7.2。
在經上述熱誘導處理的XMP發酵肉湯中加入2.5％葡萄糖，10g/l植酸，4.4g/l MgSO4.7H2O，9.36g/l NaH2PO4，96.9mg/l腺嘌呤和10g/lNymeen S-215，於40℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)，使所得混合物反應24小時，反應過程中用5.5M氨水將pH維持在7.4。
完成反應之後，在上述HPLC分析條件下測定反應混合物上清液中積累的GMP的量。結果發現GMP形成和積累的量是20.8g/l。實施例2構建生產XMP的產氨棒狀桿菌菌株並由該菌株生產GMP，所述菌株攜有處於異檸檬酸裂合酶基因啟動子控制之下的產氨棒狀桿菌XMP氨基酶基因(1)通過PCR擴增和克隆XMP氨基酶基因按下列方法，根據核苷酸序列經PCR分離產氨棒狀桿菌的XMP氨基酶基因。
首先，合成SEQ ID NO1和2所示的寡核苷酸序列，所述序列位於XMP氨基酶基因的兩端，各具有限制性酶AflII和BamHI的裂解位點。根據製備原生質體的方法，通過用溶菌酶和無色肽酶(achromopeptidase)處理在甘氨酸存在下培養的細胞，製備產氨棒狀桿菌ATCC 6872的染色體DNA以用作模板(日本公開未審專利申請225776/94)。
在0.1ml含有各為200μM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，50mmol/l氯化鉀，1.5mmol/l氯化鎂和0.0001％明膠的10mmol/l Tris-HCl緩衝液(pH8.3)中加入所得的染色體DNA(0.1μg)，作為引物的上述寡核苷酸(各為0.25μM)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司，2.5個單位)，對所得混合物進行PCR。
通過將94℃ 90秒，50℃ 120秒和72℃ 120秒的反應循環重複10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 120秒的反應循環重複10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 180秒的反應循環重複20次；然後72℃反應360秒來進行PCR。
對所得的反應混合物進行瓊脂糖凝膠電泳，籍此回收約1.6kb的所需DNA片斷。
用限制性酶Af1II(5單位)和BamHI(5單位)裂解所述DNA片斷，通過瓊脂糖凝膠電泳分離並回收其末端分別經AflII和BamHI處理的約1.6kb的裂解片斷。(2)構建誘導型表達質粒pGUA2，該質粒能用碳源調節XMP氨基酶基因的表達按下列方法，使用誘導型表達載體pCEX2(日本公開未審專利申請224259/91)構建能用碳源調節XMP氨基酶基因表達的質粒。
pCEX2是含有穀氨酸棒狀桿菌異檸檬酸裂合酶基因的表達調節區域和轉錄終止信號序列的載體，糖的存在會抑制插入該質粒之多克隆位點的外源基因的表達，而非-糖類，如醋酸的存在會誘導這種表達。
用AflII(0.5單位)部分裂解pCEX2載體DNA(1μg)，然後用BamHI(5單位)裂解之。通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收7.6kb的DNA片斷，該片斷含有異檸檬酸裂合酶基因的表達調節區域和轉錄終止信號區域，壯觀黴素抗性基因和在穀氨酸棒狀桿菌中自主複製的質粒的複製起點。
將所述DNA片斷與上文實施例2(1)中所得XMP氨基酶基因的經PCR擴增的片斷相連接，得到經連接的DNA。
通過電脈衝法用所述經連接的DNA(1μg)轉化產氨棒狀桿菌ATCC6872，然後鋪於含有100μg/ml壯觀黴素的A瓊脂培養基上。
通過鹼性細菌裂解法從所得的壯觀黴素抗性轉化子中提取質粒DNA。
用多種限制性酶裂解質粒DNA並分析之，從而證實所得轉化子攜有質粒pGUA2，其具有圖2所示的所需結構。(3)測定通過將pGUA2導入菌株FERM BP-1261所製備菌株的XMP氨基酶活性通過鹼性細菌裂解法從攜有pGUA2的產氨棒狀桿菌ATCC 6872中提取質粒pGUA2。
通過電脈衝法，使用所述質粒轉化XMP生產菌株產氨棒狀桿菌FERMBP-1261(腺嘌呤-滲漏需求型和鳥嘌呤需求型)。
通過鹼性細菌裂解法從所得的壯觀黴素抗性轉化子中提取質粒DNA。
用多種限制性酶裂解質粒並分析之，從而證實所得轉化子攜有pGUA2。
於30℃，分別在兩種培養基中將攜有pGUA2的XMP生產菌株FERMBP-1261振蕩培養24小時，所述培養基是含有100μg/ml壯觀黴素的培養基和通過用醋酸銨替代所述培養基中的葡萄糖而製備的培養基。
按與實施例1(2)相同的方法，從所得培養物中得到細胞以製備細胞提取物。
根據實施例1(2)所述的方法測定各個提取物中的XMP氨基酶活性。
結果示於表2。
在使用葡萄糖作為碳源培養的細胞中僅檢測到極低水平的活性，而在使用2％醋酸銨作為碳源培養的細胞中檢測到高水平的活性。
這些結果表明XMP氨基酶基因的表達處於攜有pGUA2的FERMBP-1261中的異檸檬酸裂合酶基因啟動子的控制之下，改變碳源可調節所述酶的活性。表2
(4)通過將pGUA2導入XMP生產菌株FERM BP-1261所製備的菌株生產GMP在與實施例1(3)相同的培養條件下，使用攜有pGUA2的FERMBP-1261菌株進行XMP發酵。完成培養之後，按與實施例1(3)相同的方法測定培養物上清液中形成和積累的XMP和GMP的量。
結果發現XMP積累的量為18.4g/l，但未檢測到GMP。
發酵完成之後，為了誘導和表達XMP氨基酶基因，在發酵肉湯中加入醋酸銨至終濃度為2％，攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養10小時，培養過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
在醋酸銨存在下經上述誘導處理的培養物中加入2.5％葡萄糖，10g/l植酸，4.4g/l MgSO4.7H2O，9.36g/l NaH2PO4，96.9mg/l腺嘌呤和10g/l Nymeen S-215，於40℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)，使所得混合物反應24小時，培養過程中用5.5M氨水將pH維持在7.4。
完成反應之後，按與實施例1(3)所述相同的方法測定反應混合物上清液中積累的GMP的量。
發現反應混合物中形成和積累的GMP的量為14.4g/l。實施例3構建生產肌苷的產氨棒狀桿菌菌株並由該菌株生產IMP，所述菌株攜有處於異檸檬酸裂合酶基因啟動子控制之下的大腸桿菌肌苷-鳥苷激酶基因(1)通過PCR擴增和克隆肌苷-鳥苷激酶基因按下列方法，根據已知的核苷酸序列(WO91/08286)經PCR分離大腸桿菌的肌苷-鳥苷激酶基因。
合成SEQ ID NO3和4所示的寡核苷酸，所述序列位於肌苷-鳥苷激酶基因的兩端，各具有限制性酶AflII和BamHI的裂解位點。
大腸桿菌HM70/pBM2(WO91/08286)攜有的質粒pBM2被用作肌苷-鳥苷激酶基因的模板。
在0.1ml含有各為200μM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，50mmol/l氯化鉀，1.5mmol/l氯化鎂和0.0001％明膠的10mmol/l Tris-HCl緩衝液(pH8.3)中加入上述質粒DNA(0.1μg)，作為引物的上述寡核苷酸(各為0.25μM)和Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司，2.5個單位)，對所得混合物進行PCR。
通過將94℃ 90秒，50℃ 120秒和72℃ 120秒的反應循環重複10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 120秒的反應循環重複10次；94℃ 90秒，40℃ 120秒和72℃ 180秒的反應循環重複20次；然後72℃反應360秒來進行PCR。
將所得的PCR反應產物與克隆PCR產物的載體pT-Adv(Clontech有限公司)相連接。
使用1μg通過所述的連接處理得到的DNA轉化大腸桿菌DH5α，然後鋪於含有100μg/ml氨苄青黴素的L瓊脂培養基上。
通過鹼性細菌裂解法從所得的氨苄青黴素抗性轉化子中提取質粒pT-AI。
使用多種限制性酶分析質粒pT-AI的結構，從而證實此質粒含有肌苷-鳥苷激酶基因(1.3kb)，氨苄青黴素抗性基因，卡那黴素抗性基因和在大腸桿菌中自主複製的質粒的複製起點。(2)構建誘導型表達質粒pIGK2，該質粒能用碳源調節肌苷-鳥苷激酶基因的表達按下列方法，使用誘導型表達載體pCEX2(日本公開未審專利申請224259/91)構建能用碳源調節肌苷-鳥苷激酶基因表達的質粒。
用KpnI(5單位)裂解pCEX2載體DNA(1μg)，然後通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收7.6kb的DNA片斷，該片斷含有異檸檬酸裂合酶基因的表達調節區域和轉錄終止信號區域，壯觀黴素抗性基因和在穀氨酸棒狀桿菌中自主複製的質粒的複製起點。
用KpnI(5單位)裂解實施例3(1)所得的含有肌苷-鳥苷激酶基因的質粒pT-AI(1μg)，然後進行去磷酸化。
將經KpnI裂解的DNA片斷與上文中經KpnI裂解的pCEX2片斷相連接。
使用所得的連接混合物轉化大腸桿菌DH5α，然後鋪於含有100μg/ml氨苄青黴素的L瓊脂培養基上，得到氨苄青黴素抗性轉化子。
通過鹼性細菌裂解法從所得的轉化子中提取質粒。
用多種限制性酶裂解質粒並分析之，從而證實得到質粒pIGK2，其具有圖3所示的所需結構。
通過電脈衝法，使用此質粒(1μg)轉化產氨棒狀桿菌ATCC 6872，然後鋪於含有100μg/ml壯觀黴素的A瓊脂培養基上。
通過鹼性細菌裂解法從所得的壯觀黴素抗性轉化子中提取質粒DNA，經證實轉化子攜有pIGK2。
根據布達佩斯條約，於1999年2月5日將攜有pIGK2的產氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2保藏於日本工業科學和技術研究院，國立生物科學和人類-技術研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-0046，其保藏號為FERM BP-6638。(3)測定通過將pIGK2導入菌株FERM BP-2217所製備菌株的肌苷-鳥苷激酶活性通過鹼性細菌裂解法從產氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2(FERMBP-6638)中提取質粒pIGK2。
通過電脈衝法，使用所述質粒轉化肌苷生產菌株產氨棒狀桿菌FERM BP-2217(日本專利2578496腺嘌呤-滲漏需求型和鳥嘌呤需求型)。
通過鹼性細菌裂解法從所得的壯觀黴素抗性轉化子中提取質粒DNA。
用多種限制性酶裂解質粒並分析之，從而證實所得轉化子攜有pIGK2。
於30℃，分別在兩種培養基中將攜有pIGK2的肌苷生產菌株FERMBP-2217培養24小時，所述培養基是含有100μg/ml壯觀黴素的培養基和通過用醋酸銨替代所述培養基中的葡萄糖而製備的培養基。
根據實施例1(2)所述的方法，從所得培養物中得到細胞以製備細胞提取物。
按下列方法測定各個提取物中的肌苷-鳥苷激酶活性。
在0.1ml預先加熱至30℃的反應混合物[100mmol/l HEPES緩衝液(pH7.2)，10mmol/l MgSO4，50mmol/l Kcl，1mmol/l ATP和1mmol/l肌苷]中加入0.01ml細胞提取物，接著於30℃反應約30分鐘。
在反應過程中，間隔取樣反應混合物，用0.2M NaH2PO4(用H3PO4調節至pH2.6)將取出的樣品稀釋20倍以終止反應。
通過HPLC分析測定稀釋樣品中的肌苷和IMP的量。
HPLC分析的條件柱Asahipak GS-320H(Asahi Chemical Industry有限公司)
洗脫液0.2M NaH2PO4(pH2.6)流速1mL/min檢測UV 254nm通過測定UV 254nm下的光吸收值並與標準值相比較以測定積累的肌苷和IMP的量。將1分鐘內形成1μmol IMP的活性定為1個單位(U)，計算每毫克蛋白質的比活。使用蛋白質檢測試劑盒(BioRadLaboratories)測定蛋白質的量。
結果示於表3。在使用葡萄糖作為碳源培養的細胞中僅檢測到極低水平的活性，而在使用2％醋酸銨作為碳源培養的細胞中檢測到高水平的活性。這些結果表明肌苷-鳥苷激酶基因的表達處於攜有pIGK2的FERM BP-2217中的異檸檬酸裂合酶基因啟動子的控制之下，改變碳源可調節所述酶的活性。表3
>(4)通過攜有pIGK2的肌苷生產菌株FERM BP-2217生產IMP於30℃，在含有20μg/ml壯觀黴素的A瓊脂培養基中將攜有pIGK2的FERM BP-2217菌株培養2天。
完成培養之後，將所得細胞接種於含有60ml CI種子培養基的250ml錐瓶中，所述種子培養基中含有20μg/ml壯觀黴素，其配方是5％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白腖，0.25％氯化鈉，0.25％尿素，300mg/l腺嘌呤和100mg/l鳥嘌呤(pH7.2)，接著於30℃振蕩培養24小時。
將所得的全部培養物接種於2升發酵罐中，其中含有0.94升DI種子培養基[7％葡萄糖，1％肉膏，1％蛋白腖，0.1％KH2PO4，0.1％K2HPO4，0.1％MgSO4.7H2O，300mg/l腺嘌呤，300mg/l鳥嘌呤，10mg/lFeSO4.7H2O，10mg/l ZnSO4.7H2O，10mg/l MnSO4.4-6H2O，16mg/l β-丙氨酸，20mg/l L-半胱氨酸，30μg/l生物素，2mg/l CuSO4.5H2O和6mg/l硫胺素(pH7.2)]，接著，於30℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養24小時，培養過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
將所得培養物(120ml)接種於含0.88升FI發酵培養基的2升發酵罐中，所述發酵培養基的配方是8％葡萄糖，2.07％CSL，0.21％KH2PO4，0.21％K2HPO4，0.43％MgSO4.7H2O，105mg/l CaCl2.2H2O，10.4mg/lFeSO4.7H2O，20.7mg/l MnSO4.4-6H2O，5.2mg/l ZnSO4.7H2O，10.4mg/l泛酸鈣，20.7mg/l L-半胱氨酸，5.2mg/l煙酸，93.8μg/l生物素，0.51mg/l CuSO4.5H2O和313mg/l腺嘌呤(pH7.2)，接著，於28℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)培養44小時，培養過程中用5.5M氨水將pH維持在7.2。
培養完成之後，根據實施例3(3)中所述的方法測定培養物上清液中形成和積累的肌苷和IMP的量。
培養物上清液中形成和積累的肌苷的量為23.1g/l，未檢測到IMP。
培養完成之後，為了誘導和表達肌苷-鳥苷激酶基因，在所得培養物中加入醋酸銨至終濃度為2％，接著，攪拌(600rpm)並通氣(1L/min)培養10小時，其間用5.5M氨水將pH維持在7.2。
在所得培養物中加入2.5％葡萄糖，10g/l植酸，4.4g/l MgSO4.7H2O，9.36g/l NaH2PO4，96.9mg/l腺嘌呤和10g/l Nymeen S-215，於40℃攪拌(600rpm)通氣(1L/min)，使所得混合物反應24小時，其間用5.5M氨水將pH維持在7.4。
完成反應之後，根據實施例3(3)中所述的方法測定反應混合物上清液中形成和積累的IMP的量。
反應混合物中形成和積累的IMP的量為37.7g/l。
權利要求
1.生產嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括在培養基中培養微生物，該微生物能生產嘌呤核苷酸前體，並攜有導入的DNA，所述DNA可誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶；使所述嘌呤核苷酸前體在培養基中積累；誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶；由所述前體形成嘌呤核苷酸並在所述培養基中積累；從培養基中回收所述嘌呤核苷酸。
2.根據權利要求1的方法，其中嘌呤核苷酸的前體是5』-黃苷酸，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5』-黃苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。
3.根據權利要求1的方法，其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。
4.根據權利要求1的方法，其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-肌苷酸。
5.根據權利要求1的方法，其中微生物屬於選自棒狀桿菌，大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。
6.根據權利要求1的方法，其中微生物是產氨棒狀桿菌。
7.根據權利要求1的方法，其特徵在於通過改變條件或通過將碳源由糖改變為非糖來誘導和表達能合成嘌呤核苷酸的酶，所述條件的改變選自溫度的升高，pH的升高和滲透壓的升高。
8.根據權利要求7的方法，其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。
9.可誘導和表達能由其前體合成嘌呤核苷酸的酶的DNA。
10.根據權利要求9的DNA，該DNA通過改變條件或通過將碳源由糖改變為非糖來誘導和表達能合成嘌呤核苷酸的酶，所述條件的改變選自溫度的升高，pH的升高和滲透壓的升高。
11.根據權利要求10的DNA，其中非糖碳源是醋酸或醋酸鹽。
12.根據權利要求9或10的DNA，該DNA是pLAC857或pIGK2。
13.微生物，該微生物能生產嘌呤核苷酸前體，並攜有導入的DNA，所述DNA可誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶。
14.根據權利要求13的微生物，其中嘌呤核苷酸的前體是5』-黃苷酸，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是5』-黃苷酸氨基酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。
15.根據權利要求13的微生物，其中嘌呤核苷酸的前體是鳥苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-鳥苷酸。
16.根據權利要求13的微生物，其中嘌呤核苷酸的前體是肌苷，能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶是肌苷-鳥苷激酶或磷酸酶，嘌呤核苷酸是5』-肌苷酸。
17.根據權利要求13的微生物，其中微生物屬於選自棒狀桿菌，大腸桿菌和芽孢桿菌的屬。
18.根據權利要求13的微生物，其中微生物是產氨棒狀桿菌。
19.根據權利要求18的微生物，其中微生物是產氨棒狀桿菌ATCC6872/pLAC857(FERM BP-6639)或產氨棒狀桿菌ATCC 6872/pIGK2(FERM BP-6638)。
全文摘要
本發明提供了生產嘌呤核苷酸的方法,所述方法包括:在培養基中培養微生物,該微生物能生產嘌呤核苷酸前體,並攜有導入的DNA,所述DNA可誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;使所述嘌呤核苷酸前體在培養基中積累;誘導和表達能由所述前體合成嘌呤核苷酸的酶;由所述前體形成嘌呤核苷酸並在所述培養基中積累;從培養基中回收所述嘌呤核苷酸。本發明還提供了可用於所述方法的微生物。
文檔編號C12N9/16GK1267735SQ0010195
公開日2000年9月27日 申請日期2000年2月3日 優先權日1999年2月8日
發明者高野裕, 池田正人, 藤尾達郎 申請人:協和發酵工業株式會社