高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒與豬瘟病毒同時定量檢測試劑盒的製作方法
2023-06-25 09:36:31
本發明涉及試劑盒檢測技術領域，具體的說涉及一種能同時檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病病毒和豬瘟病毒雙重微滴數字RT-P CR絕對定量檢測試劑盒。
背景技術：
豬瘟是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性熱性傳染病，該傳染性高，致病性強，豬是本病唯一的自然宿主，感染的病豬主要表現為特徵性病理變化，內臟出血，梗塞和壞死，死亡率很高，給養豬業造成重大的經濟損失。病豬是最主要的傳染源，易感豬與病豬的直接接觸是病毒傳播的主要方式。在我國，豬瘟流行呈現典型豬瘟和非典型豬瘟共存、持續感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒症候群共存等形式；在國外，比利時、德國、荷蘭最近爆發豬瘟也說明豬瘟流行形式發生了改變。豬瘟新的流行形式給全世界養豬業提出了新的挑戰。CSFV與牛病毒性腹瀉病毒(bovi ne viral diarrhea virus，BVDV)和羊邊界病毒(Border Disease Virus，BDV)同屬黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(pestivirus)。豬瘟病毒基因組為單股正鏈RNA長約12.3KB，含有一個大的開放閱讀框架。病毒粒子呈球形，直徑40-50nm，二十面體對稱，其芯髓直徑29-30nm，有囊膜。
豬繁殖與呼吸症候群病是由豬繁殖與呼吸症候群病病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，在大多數國家中呈流行性感染。豬發病後臨床表現差異極大，是該病的顯著特徵之一。臨床症狀主要是繁殖障礙，包括懷孕後期流產、早產和死胎，育成豬的呼吸道症狀。發病母豬體溫升高，厭食，部分患豬的背側、雙耳的耳尖及邊緣呈紅藍色。發病公豬性慾減退，生產性能下降。發病仔豬出生時死亡或產出後個體小。患豬死亡後的主要病理變化是:眼球腫脹突出，頭、臀部皮下水腫，胸腔、心包積水，心室擴張，心肌變化萎縮，腎臟皮質部點狀出血，肺臟間質性肺炎病變。1991年病原首次鑑定，病毒是單鏈RNA病毒，屬於動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，但是病毒的來源並未確定。1985年美國豬群豬繁殖與呼吸症候群病毒血清抗體的存在說明該病毒在發病之前就已經存在。2006年我國南方部分省份出現養豬場(戶)暴發豬「高熱病」疫情，發病豬以「高熱」、「高發病率」和「高死亡率」為主要特徵，給我國的養豬業造成了較大的經濟損失。中國動物疫病預防控制中心田克恭等研究發現，豬「高熱病」的主要致病病原為Nsp2缺失30個胺基酸的豬繁殖與呼吸症候群病毒變異引起，後將其命名為「高致病性豬繁殖與呼吸症候群病」(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，其致病性大大增加，仔豬發病率可達100％、死亡率可達50％以上，母豬流產率可達30％以上，育肥豬也可發病死亡。
常規的豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸症候群病病毒的實驗室檢驗方法是根據免疫反應原理，利用ELISA及雙夾心ELISA法進行檢測。目前，國內外已對豬瘟的結構蛋白基因進行了詳盡的研究，國外有學者分別對CSFVAlfort株和BreSCia株基因進行了全序列測定，並通過免疫學方法證明囊膜糖蛋白El是CSFV誘導保護性中和抗體的重要抗
原，而國內則對於石門株(Shimen)的基因序列進行了測定。通過RT-PCR技術將編碼相應結構蛋白的mRNA反轉錄成cDNA，轉入載體進行表達，並將表達產物進行純化、定量以及作為抗原包板做ELISA進行感染檢測。另外豬瘟兔化弱毒EZ蛋白A/D區的高效表達和蛋白純化後亦可以作為包被抗原進行ELISA測定，但是由於不能區分自然感染的和免疫接種。PRRSV可以從各種臨床樣品中分離到，包括血清、血漿、外周血單核細胞、骨髓、扁桃體、肺臟、淋巴結、胸腺、脾臟、心、腦、肝、翠丸、附翠、輸精管、尿道球腺、陰莖組織、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盤、唾液、尿液、糞便以及精液中。一般來說，肺臟深處積液以及血清都是病毒分離最理想的材料。送檢材料通常應包括新鮮採集的肺、扁桃體以及淋巴結。但是只有當特定滴度的標準病毒在新巨噬細胞生長良好，方可使用。冰凍切片免疫螢光抗體試驗(I FA)以及免疫組化試驗(IHC)可以檢測組織中的PRRSV抗原。冰凍切片直接FA試驗成本較低並且快速，這兩種方法的特異性很高，但相對來說敏感性不夠。樣品的質量對FA結果影響非常大，要求組織應該新鮮。IHC可以檢測甲醛固定的組織，比FA的敏感性要高，但更費時而且成本更高。通過組織病理學切片，結合IHC以及FA試驗的結果可以對PRRSV感染做出準確的診斷。另外，針對上述兩種病毒可以用RT-PCR技術進行檢測。通常是用異硫氰酸肌一酚一仿一步抽提法提取病料細胞總RNA並進行反轉錄，再以此產物為模板對可疑的豬瘟或者豬繁殖與呼吸症候群病病料進行了PCR擴增。如果擴增出相應的片段則說明病毒的存在，敏感性要高於螢光抗體染色法、酶標單克隆抗體染色法和電鏡負染法，可以作為一種有效的診斷方法。概括來說豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸症候群病病毒的檢測方法主要包括免疫學檢測方法和核酸檢測方法兩大類。免疫學方法主要是檢測血清中是否存豬瘟和豬繁殖與呼吸症候群病病毒的特異性抗體，具體是用ELISA的方法進行檢測，然而這種方法必須是建立在已經發生病毒感染並產生抗體的基礎上，而且鑑於上述病毒的高度變異性以及與其他病毒血清學的交叉性，其特異性難以保證，容易出現假陽性和假陰性。病毒分離和培養法比較敏感，但是這種方法操作繁瑣，不宜在所有檢測實驗特別是一些基層實驗室推廣。用普通PCR的方法進行豬瘟或者豬繁殖與呼吸症候群病病毒核酸，雖然靈敏度有所提高，但是容易產生非特異性擴增，甚至會因為操作的原因出現假陽性，而且普通PCR擴增法其結果的判斷需要對產物進行凝膠電泳分析，操作方法不夠簡化。
為了對疾病的治療和疫情在早期就有效控制,建立快速、敏感、準確的豬瘟與豬繁殖與呼吸症候群病病毒檢測方法是十分必要的。近年螢光PCR技術在病毒等微生物檢測領域得到廣泛的應用,它利用PC R技術對DNA的高效擴增並結合探針技術的高特異性和敏感性,克服了常規血清學和普通PCR方法的不足,但是螢光PCR技術的檢測下限仍很高，不能檢測出微量的病毒，所以提出了數字PCR的概念。
數位化PCR的概念早在1999年就由Bert Vogelstein採用並發表相關文獻，其初衷是為了能夠從臨床樣品(如尿液、淋巴液、血漿、糞便等)大量的正常體細胞中檢測出微量的突變細胞，但由於當時能用於稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不能非常好地體現數字PCR的核心理念——「無限稀釋」(terminal dilution，有些文獻上也稱partiti on)。
如今，數字PCR技術的浪潮已經來臨，Bio-Rad公司的QX200系統核心的微滴化技術能夠將一份樣品分成20,000個納升級的微滴，本質上將傳統定量PCR的一個反應變成20,000個反應，大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度，是對「無限稀釋」這一概念的完美演繹。
由於擴增前的微滴化處理步驟，使得該技術能夠以絕對定量的方式直接「數」出靶分子的個數，因此特別適用於依靠傳統定量PCR方法不能很好達到分辨效果的應用領域：拷貝數變異、微量核酸的檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序文庫定量與結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等，對遺傳病、癌症、傳染病的研究提供了一種全新的技術思路與手段。需要指出的是，定量PCR檢測靈敏度的極限一般在1％，而QX200數位化PCR的檢測靈敏度可達0.001％，在這個意義上實現所謂的痕量檢測。故QX200系統應用於出入境檢驗檢疫領域，如在轉基因作物檢測、包括各種病毒在內的危險性有害微生物的檢測等方面同樣提供了創新的技術方法和完美的解決方案。是一種很有應用價值的診斷方法。豬瘟和高致病性豬繁殖與呼吸症候群病是嚴重危害豬的病毒性疾病，常以單獨或混合感染的方式感染豬，發病率和死亡率都較高。目前還沒有能夠同時對高致病性豬繁殖與呼吸症候群病病毒和豬瘟病毒進行同時數字PCR檢測的相關試劑和檢測試劑盒。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、可實現精確定量的微滴數字RT-PCR檢測方法和微滴數字R T-PCR測試劑盒，用於同時對高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒進行快速精確檢測。
本發明的第一個技術目的是提供用於同時檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒的特異性引物和探針組合，包括用於特異性擴增高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列為：
HP-PRRSV-F2：AGTGGGTCGGCACCAGTTC；
HP-PRRSV-R2：CGCAGACAAATCCAGAGGCT；
HP-PRRSV-P2：FAM-AACTGTGACAACAACGCTGACGCA-B HQ1；
以及用於特異性擴增豬瘟病毒的1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列為：
CSFV-F1：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC；
CSFV-R1：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG；
CSFV-P1：HEX–ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BH Q1。
探針的兩端添加有螢光染料，如FAM、HEX、BHQ1等。
本發明提供了上述的特異性引物和探針組合在製備高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒同時檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。
本發明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒。所述試劑盒優選為雙重微滴數字RT-PCR絕對定量檢測試劑盒。
本發明的另一技術目的在於提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確度的、操作簡單的同時檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒的檢測試劑盒，包含上述特異性引物和探針組合。
還包含檢測試劑；所述檢測試劑包括無RNA酶的蒸餾水，一步法RT-ddPCR探針法預混液，探針法RT-ddPCR微滴發生油，質控液，陰性對照和陽性對照。
所述一步法RT-ddPCR探針法預混液中優選的引物和探針用量是：引物探針濃度均為10μM，引物單體系加1.8μL，反應終濃度為900nM，探針單體系加0.5μL，反應終濃度為250nM。
所述陽性對照為含有高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒基因組RNA的提取液，陰性對照為無RNA酶蒸餾水。
本發明的試劑盒其工作原理是採用微滴式數位化RT-PCR(RT-dd PCR)，所述試劑盒的工作程序為：
(1)配製RT-ddPCR反應液；RT-ddPCR反應液20μl配方為：一步法ddPCR探針法預混液18μl，待測樣品RNA模板為2μl；
(2)製備微滴，然後將微滴轉入PCR板，於PCR儀中進行擴增；
(3)將完成PCR擴增的PCR板放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數據，顯示檢測結果。
在本發明的一個優選實施例中，製備微滴的方法是採用Bio-Rad公司的QX200系統中的微滴發生器，按照說明書操作進行微滴製備即可。
其中，步驟(2)中PCR的擴增程序為48℃反轉錄20min；95℃預變性10min；94℃變性10sec，56℃退火60sec，共40個循環；98℃10min，升降溫速度都設為2.5℃/sec，結束反應。
本發明提供的試劑盒在豬疫病檢測和預防中的應用也屬於本發明的保護範圍。
本發明試劑盒檢測結果的判定方法為：(1)陽性對照：100±5c opies/μl；(2)陰性對照：<1copies/μl；待測樣本結果判定：(1)陽性：標本檢測結果≥1copies/μl。(2)陰性：標本檢測結果<1copies/μl。
本發明摸索了引物和探針的濃度，找到了最適RT-ddPCR的引物和探針的工作濃度。摸索了RT-ddPCR反應過程中最適的升降溫速度，以提高RT-ddPCR的擴增效率，使本發明方法能夠與BIO-RAD公司的QX200系統相結合。
本發明試劑盒具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、可直接定量，無需標準曲線、操作簡便、適合現場檢測等優點，可以在疫情預爆發前便於在早期內確定疫病，做好預防，從源頭控制疫情。具體表現在：
(1)高特異性：本發明根據高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒基因組序列設計了特異性引物和特異探針，其特異性極高，且非常穩定，保證了反應的順利進行，進一步確保高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒檢出的特異性；
(2)高靈敏度：檢測濃度低至1/1,000,000的靶分子；能夠直接定量待測樣本中的拷貝數；
(3)低模板：由於檢測的靈敏度很高，可以檢測出低豐度的目的基因，所以可以降低模板用量，稀釋模板濃度，對於一些珍貴，稀少的樣本可以有更多的研究。
(4)可直接定量，無需標準曲線：與傳統的PRRSV檢測方法相比，該試劑盒可直接定量，無需標準曲線，操作簡便、準確無誤，更加適合現場檢測，有效預防豬疫病的大規模爆發。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1引物及探針的設計與合成
1、引物、探針設計
根據Genbank已發表的豬繁殖與呼吸症候群美洲型變異株病毒H P-PRRSV的基因組序列，豬瘟病毒CSFV的基因組系列，用primer pr emier 5.0軟體設計螢光定量專用的HP-PRRSV和CSFV的引物探針，設計完成後送合成英濰捷基公司合成。
2、進行適用於ddPCR的特異性引物和探針的篩選。
選擇用軟體設計出的其中幾對備選引物進行篩選，備選引物如下，見表1：
表1
2.1引物的篩選
(1)HP-PRRSV的引物隨機配為四對：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2；CSFV的引物隨機配為四對：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2。
(2)然後兩種病毒分別用染料法做螢光定量PCR，PCR體系配方：2X one-step SYBR Green Supermix 10μL，上遊引物，下遊引物分別為1μL，RNase Free dH2O 3μL，陽性模板5μL。PCR的擴增程序為50℃反轉錄10min；95℃預變性10min；94℃變性30sec，60℃退火60sec，共40個循環；60℃-95℃每5秒升高0.5℃溶解曲線，結束反應。
(3)結果分析，HP-PRRSV的引物選擇沒有非特異性擴增的引物對F2R2，CSFV的引物選擇沒有非特異性擴增的引物對F1R1。
3、探針的篩選
(1)引物探針的組合為：
1、HP-PRRSV-F2R2P1+CSFV-F1R1P1；
2、HP-PRRSV-F2R2P1+CSFV-F1R1P2；
3、HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P1；
4、HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P2。
(2)然後在ddPCR平臺上，ddPCR體系配方：2X One-step RT-ddPCR Supermix 10μL，上遊引物，下遊引物分別為1μL，探針分別0.5μL，RNAse Free dH2O 3μL，陽性模板2μL，總體積20μL(引物和探針的濃度均為10μM)。然後生成微滴。
(3)上PCR儀擴增，PCR的擴增程序為50℃反轉錄10min；95℃預變性10min；94℃變性30sec，退火60℃sec，共40個循環；98℃10min結束反應。上微滴數字PCR檢測儀檢測。
(4)分析結果：根據實驗結果選擇HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P1引物探針組合。
實施例2在ddPCR平臺上檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒和豬瘟病毒的PCR方法退火溫度的優化。
1、選擇引物探針的組合為：HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P1，提取豬繁殖與呼吸症候群美洲型變異株病毒和豬瘟病毒RNA為模板。
2、然後在ddPCR平臺上，ddPCR體系配方：2X One-step RT-dd PCR Supermix 10μL，上遊引物，下遊引物分別為1μL，探針0.5μL，RNase Free dH2O 3μL，陽性模板2μL，總體積20μL(引物和探針的濃度均為10μM)。做8個復孔，然後生成微滴，轉移到96孔板內，封鋁膜。
3、上PCR儀擴增，為50℃反轉錄10min；95℃預變性10min；94℃變性30sec，50～60℃(儀器自動分布8個溫度梯度)退火60sec，共40個循環；98℃10min，升降溫速度都設2.5℃/sec，結束反應。上微滴數字PCR檢測儀檢測。
4、分析結果：在56℃的退火溫度時擴增效率最好，病毒拷貝數最多，所以選擇56℃的退火溫度。
實施例3引物、探針濃度的優化實驗
設計引物探針濃度均為10μM,組合為：HP-PRRSV–F2R2P2+CSF V-F1R1P1，提取豬繁殖與呼吸症候群美洲型變異株病毒和豬瘟病毒RNA為模板。配數字PCR反應液。
第一組：5X one-step ddPCR mix：5μL，Reverse transcriptas e(逆轉錄酶，RE)：2μL，DTT：1μL，上下遊引物各1.3μL(終濃度650nM)，探針0.3μL(終濃度150nM)，無RNA酶的蒸餾水：4.2μL，RNA模板：2μL，總體積20μL。
第二組：5X one-step ddPCR mix：5μL，RE：2μL，DTT：1μL，上下遊引物各1.8μL(終濃度900nM)，探針0.5μL(終濃度250nM)，無RNA酶的蒸餾水：1.8μL，RNA模板：2μL，總體積20μL。陰性對照是用第二組的體系配置，因為第二組引物探針的濃度是BIO-RAD廠家推薦濃度。
第三組：5X one-step ddPCR mix：5μL，RE：2μL，DTT：1μL，上下遊引物各2.1μL(終濃度1050nM)，探針0.7μL(終濃度350nM)，無RNA酶的蒸餾水：0.2μL，RNA模板：2μL，總體積20μL。
3、生成微滴後，轉移到96孔板內，封鋁膜，上PCR儀擴增，為48℃反轉錄20min；95℃預變性10min；94℃變性10sec，56℃退火60sec，共40個循環；98℃10min，升降溫速度都設2.5℃/sec，結束反應。上微滴數字PCR檢測儀檢測。
4、分析結果：第二組擴增效率好，得到的病毒拷貝數多，所以選擇第二組，引物單體系加1.8μL，終濃度900nM，探針單體系加0.5μL，終濃度為250nM。
實施例5病毒RNA提取
1樣品採集：病死或撲殺豬，取肺、扁桃體和腦組織：待檢活豬，用注射器取血5mL。2～8℃保存，送實驗室檢測。(要求送檢病料新鮮，嚴禁反覆凍融病料。)
2樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1g，用手術剪剪碎混勻後取0.05g於研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水繼續研磨，待勻漿後轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL於1.5mL滅菌離心管中。
2.2全血樣品處理：待血凝後取血清100μL，置1.5mL滅菌離心管中。
2.3陽性對照處理：取陽性對照100μL，置1.5mL滅菌離心管中。
2.4陰性對照處理：取陰性對照100μL，置1.5mL滅菌離心管中。
3病毒RNA的提取
3.1取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5min。
3.2將液體吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液體時儘量不要吸到懸浮雜質，以免離心時堵塞吸附柱)，13000rmp離心30s。
3.3棄去收集管中液體，加入600μL洗液，13000rmp離心30s。
3.4重複步驟3.3。
3.5棄去收集管中液體，13000rmp空柱離心2min，以除去殘留的洗滌液。
3.6將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入洗脫液50μL，室溫靜置1min，13000rmp離心30s，離心管中液體即為模板R NA。
實施例6檢測豬繁殖與呼吸症候群美洲型變異株病毒和豬瘟病毒雙重ddPCR方法的建立
1、製備ddPCR反應液，5X one-step ddPCR mix：5μL，RE：2μL，DTT：1μL，上下遊引物各1.8μL(終濃度900nM)，探針0.5μL(終濃度250nM)，無RNA酶的蒸餾水：1.8μL，模板RNA：2μL，總體積20μL。空白對照：以RNase Free dH2O代替模板，同樣條件下擴增。
2、取微滴發生卡置於卡託中固定，將20μL反應液加入到微滴發生卡中間一排的8個孔內，不足8個樣品時用20μL 1×control buffer補足，建議使用8通道20μL排槍和20μL槍頭(不能用200μL槍頭)，加樣時槍頭接近孔一側底部，與側壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分後慢慢提升槍頭位置再打出餘下液體，不要將槍按至超過第一檔位置以免引入氣泡。
3、在微滴發生卡最底下一排8個孔中各加入70μL微滴生成油，同樣不能有空著的孔。
4、蓋上膠墊，注意兩邊的小孔都要鉤牢。
5、將以上卡託輕輕地平穩放置於微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態，一般2分鐘之內完成。
6、微滴生成於微滴發生卡最上面一排孔內，建議使用8通道排槍和200μL槍頭小心緩慢吸取，調整吸取體積為40μL，將卡託放平，槍頭以與孔壁呈30～45°角放入，輕觸孔底，約5秒吸取40μL，再同樣緩慢地打入96孔板相應位置孔內(約5秒)，槍頭貼近孔壁接近孔底，注意封上蓋以防油揮發，每次棄去已使用過的微滴發生卡和膠墊。
7、轉移油滴進入96孔板內完成後，用預熱好的PX1熱封儀對其進行封膜(膜亮面朝上，暗面向下)，推薦的運行程序為：180℃，10s，一般無需顛倒方向二次封膜；
8、封好膜之後應該在30分鐘內進行PCR反應，或者放於4℃冰箱4小時之內進行PCR，可在任意一臺96孔PCR儀上完成。反應條件：為48℃反轉錄20min；95℃預變性10min；94℃變性10sec，56℃退火60sec，共40個循環；98℃10min，升降溫速度都設2.5℃/S，結束反應。
9、將之前完成PCR的96孔板放入pLate hoLder中組裝好，注意板斜角方位，組裝好之後輕輕地平穩放入微滴讀取儀中。
10、打開QuantaSoft軟體，建議每次實驗之前做一次系統清洗，若一周以上未使用建議先做一次填充油路再做系統清洗。之後對96孔板中樣品信息進行設置，主要是提供實驗名稱、實驗類型以及探針信息等，完成後即可運行儀器，結束後結果會被自動分析，人工核實後保存結果。
實施例7特異性檢驗
用製備的試劑盒分別檢測，PRRSV美洲型經典株，豬圓環病毒2型，豬傳染性胃腸炎病毒，豬流行性腹瀉病毒，口蹄疫病毒，結果全為0copies/μL；檢測高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒感染的組織樣本，FAM通道結果為129copies/μL；檢測豬瘟病毒感染的組織樣本，HEX通道結果為89copies/μL。
實施例8敏感性實驗
將0.8ng/μL的高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的合成質粒和0.75ng/μL豬瘟病毒的合成質粒，分別10倍稀釋，稀釋7個梯度，在依次混合，編號H C1、H C2、H C3、H C4、H C5、H C6、H C7用已建立的高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒微滴數字RT-PCR絕對定量方法在QX200的平臺上做數字PCR實驗。
結果：FAM通道檢測出1.8copies/μL的高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒，上樣的樣本濃度為0.8*10-4ng/μL，HEX通道檢測出1.3copies/μL的豬瘟病毒，上樣的樣本濃度為0.0.75*10-4ng/μL。
以上檢測結果證明了本發明的試劑盒特異性好、靈敏度高、可直接定量，檢測方便快捷、結果準確可靠。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
序列表
北京市動物疫病預防控制中心
高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒與豬瘟病毒同時定量檢測試劑盒
P1610230
12
PatentIn version 3.5
1
19
DNA
人工序列
1
cccactgatg acacctttg 19
2
19
DNA
人工序列
2
aacagaggct catcctggt 19
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25
DNA
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3
cgcgtagaac tgacaacaac gctga 25
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agtgggtcgg caccagttc 19
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人工序列
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人工序列
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人工序列
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20
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人工序列
10
ttcaatttgg ttcagggcct 20
11
23
DNA
人工序列
11
tactcaggac ttagaccacc cag 23
12
27
DNA
人工序列
12
tgcccatagt aggactagca aacggag 27