宿主微生物的製作方法

2023-06-25 15:23:21

專利名稱：宿主微生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於生產有用的蛋白質或多肽的宿主微生物，及重組微生物。
背景技術：
微生物已被應用在廣泛的有用物質的工業生產中。例如，利用微生物不僅可生產酒精飲料和食品，如味噌(發酵的大豆糊)和醬油(大豆調味汁)，還可生產胺基酸、有機酸、與核酸相關物質、抗生素、糖類、脂類、蛋白質，及很多其它類型物質。在廣泛領域中都可發現這些物質的用途，包括食品、藥物、日常必需品，如清潔劑和化妝品，以及多種可通過化學方法獲得產品的原料。
在通過利用微生物進行有用物質的工業生產中，一個重要問題是生產力的提高。因此，作為一種衡量方法，通過傳統遺傳技術，如突變技術已經進行了可生產物質的微生物的培養。特別地，歸功於微生物遺傳學和生物工藝學的進展，現在通過利用遺傳技術，如遺傳工程技術可以比以往更為有效地進行對這些可生產物質的微生物的培養，也發展了用於遺傳重組的宿主微生物。例如，發展了由公認安全並優秀的微生物菌株枯草桿菌(Bacillus subtilis)Marburg No.168改良而獲得的微生物菌株。
微生物含有各種不同的基因，所以它們可以使自己適應自然界裡的環境改變。因此，在應用幾類有限的生產培養基進行的蛋白質或類似物質的工業生產方面，微生物的物質生產力並不一定是高效的。
同樣，關於特定類型微生物，已經建立了其參與早期芽孢形成的基因單一缺失或失活的菌株。不過，這些菌株在生產力上並沒有足夠的改進。
因此，本發明的一個目標是提供一種宿主微生物，該微生物是通過從基因組中清除對蛋白質或多肽的生產無用或有害的基因，或使這些基因失活，從而增加蛋白質或多肽產量。本發明的另一個目標是提供一種重組微生物，該重組微生物是通過把編碼了蛋白質或多肽，並被連接到轉錄起始調節區域、翻譯起始調節區域、或分泌信號區域的區域下遊末端的基因整合到上述宿主微生物而獲得的。本發明還有一個目標是提供一種利用重組微生物生產蛋白質或多肽的方法。

發明內容
發明人在多種編碼於微生物基因組的基因中，廣泛尋找對有用蛋白質或多肽的生產無用或有害的基因，並且發現與未經缺失或失活作用的微生物所獲得生產力相比較，可通過如下方法提高目標蛋白質或多肽的生產力，即將參與芽孢形成的特定基因從基因組中缺失或使其失活，接著再把編碼了目標蛋白質或多肽，並連接到合適的轉錄起始調節區域、翻譯起始調節區域、或分泌信號區域的基因整合進微生物中。
相應地，本發明提供了一種已缺失或失活了參與芽孢形成中期到晚期的一個或幾個基因的微生物；也提供了一種通過將編碼了蛋白質或多肽，並連接到轉錄起始調節區域、翻譯起始調節區域、或分泌信號區域的區域下遊末端的基因整合進基因缺失或基因失活的微生物中，而獲得的重組微生物；以及一種利用重組微生物生產蛋白質或多肽的方法。
實施發明的最佳方式用於構建本發明微生物的母體微生物只要含有參與芽孢形成的基因就無需強加限制。優選的母體微生物是形成芽孢的微生物。母體微生物可以是野生型或突變型。特定實例包括屬於桿菌屬的細菌，如枯草桿菌，屬於梭狀芽孢桿菌屬的細菌，和酵母，屬於桿菌屬的細菌是優選的。在這些微生物中，枯草桿菌是尤其優選的，因為其完整的基因組信息已被闡明，也建立了遺傳工程和基因組工程技術，並且屬於枯草桿菌的細菌具有胞外分泌蛋白質的能力。
通過利用本發明微生物產生的目標蛋白質或多肽的實例包括在食品、藥物、化妝品、清潔劑、纖維處理、醫療檢測用藥物等方面有用的酶；及蛋白質和多肽，如生理學活性因子。
分散存在於基因組上的250個或更多的基因被確定參與了芽孢形成。在這些基因當中，本發明中待缺失或失活的目標基因優選的是促進芽孢形成的基因，這種基因的實例包括編碼了芽孢形成期特異性σ因子的基因，參與任何σ因子基因表達的基因，以及參與激活任何σ因子的基因。另外，通過任何σ因子轉錄，從而參與促進芽孢形成的基因也被包括在本發明的範疇內。已知芽孢形成早期(0-I期)的胞外酶，如蛋白酶和澱粉酶的產量與對數生長階段產生的量相比是增加的。因此，待缺失或失活的目標基因優選的是特定於芽孢形成中期到晚期表達，從而參與芽孢形成的一個或幾個基因。特定地，目標基因優選的是涉及芽孢形成II、III、IV或V期，更為優選的是II或III期，特別優選的是II期的一個或幾個基因。本發明發現這些基因不直接涉及目標蛋白質的生產，並且對工業生產應用的普通培養基中的微生物的生長是非必須的。
表1和表2列舉了枯草桿菌的這些基因。
本說明書基於Nature 390，249-256(1997)中報導的，及JAFANJapan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)(http://bacillus.genome.ad.jp/)出版的枯草桿菌基因組資料庫，描述了基因的名稱、位點、鹼基數目及功能。
表1

表2

下列基因被認為與表1所列舉基因相當與表1或表2所列枯草桿菌基因功能相同的基因；來源自其它微生物的基因，優選的是來自桿菌屬細菌，並且表現出與表1所列基因中的一個基因有70％或更多同源，優選的是80％或更多，更為優選的是90％或更多同源性。這些基因被包括在本發明的待缺失或失活的基因當中。胺基酸序列之間的同源性是通過Lipman-Pearson方法計算的(Science，227，1435(1985))。
當一個或幾個選自上述基因的基因被缺失或失活時，微生物的芽孢形成所需的化學能消耗便降低了，蛋白質或多肽的生成期被延長，或獲得其它益處，使得提高了蛋白質或多肽的生產力。
對被缺失或失活的基因數目無需強加限制，只要有至少一個基因被缺失或失活即可。數目可以是3個或更多，或5個或更多。優選的是2個或3個，尤其優選的是2個。
為構建本發明的微生物，還可缺失或失活除上述基因外的一個或幾個基因。通過這樣組合，便可預期在改進生產力方面獲得更大的效果。
基因的缺失或失活可通過已知方法進行。實例包括順序地缺失或失活目標基因的方法，以及通過缺失或突變使一個或幾個任意DNA片段失活，並通過適當技術根據蛋白質生產力分析和評估相應基因的方法。
通過例如同源重組方法缺失或失活目標基因。特定的是通過利用合適的質粒載體進行克隆而獲得含目標基因的DNA片段。其它方法中，是採用如下方式使所獲DNA片段突變的，即通過常規基因工程技術使基因的全部區域或目標基因的部分區域缺失，而保留與目標基因的相應末端相連的DNA片段；通過鹼基替代、移碼突變等方法引起結構基因中的無意義突變；或者通過克隆化或PCR分離目標基因片段，再將DNA片段插入分離的目標基因片段中的方法。隨後將突變DNA片段導入母體微生物，從而在與目標基因相應末端鄰近的兩個區域，與母體微生物的基因組同源重組。這樣，基因組上的目標基因便可被已缺失或失活目標基因的DNA片段所替代。
當以枯草桿菌細菌為母體微生物以獲得本發明微生物時，通過同源重組缺失或失活目標基因的一些方法已有報導(如Mol.Gen.Genet.，223，268(1990))。本發明的宿主微生物可通過重複這種方法獲得。
也可通過與上述類似的方式，利用片段進行克隆和同源重組，從母體微生物獲得一個或幾個任意DNA片段；或可選地通過γ射線照射母體微生物，從而使一個或幾個任意DNA片段缺失或失活。
本發明的重組微生物可通過如下方法獲得，即將編碼目標蛋白質或多肽的基因(下文見「目標蛋白質或多肽基因」)整合到已缺失或失活一個或幾個參與芽孢形成中期到晚期的基因的微生物中。
對目標蛋白質或多肽基因無需強加限制。這種基因的實例包括工業用酶，如用於生產清潔劑、食品、纖維、飼料、化學製品的酶，醫用酶，診斷用酶，以及生理學活性肽。工業用酶基於其功能可分類為氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、連接酶/合成酶及其它。目標蛋白質或多肽基因優選的實例包括編碼水解酶，諸如纖維素酶、α-澱粉酶或蛋白酶的基因。特定實例包括屬於多糖水解酶分類中的家族5的纖維素酶(Biochem.J.，280，309(1991))。其中，例證了來源自微生物的纖維素酶，特別是來源自桿菌屬細菌的纖維素酶。更多特定實例包括來源自桿菌屬細菌，並具有SEQ ID NO1或2序列的鹼性纖維素酶；及具有特定序列的纖維素酶，該序列具有與SEQ ID NO1或2序列70％或更多，優選的80％或更多，更為優選的90％或更多的同源性。胺基酸序列之間的同源性是通過Lipman-Pearson方法測定的(Science，227，1435(1985))。α-澱粉酶的實例包括來源自微生物的α-澱粉酶，特別優選的是來源自桿菌屬細菌的液化型澱粉酶。蛋白酶的實例包括來源自微生物的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，特別是來源自桿菌屬細菌的蛋白酶。
目標蛋白質或多肽基因在其上遊末端被理想地連接到參與基因轉錄或翻譯、或基因產物分泌的調節區域，即含有啟動子和轉錄起始點的轉錄起始調節區域、含有核糖體結合位點和起始密碼子的翻譯起始區域、或合適形式的分泌信號肽區域。例如，目標蛋白質或多肽基因被理想地連接到纖維素酶基因包含的上述調節區域中，該纖維素酶基因來源自Japanese Patent Application Laid-Open(kokai)No.2000-210081或Hei 4-190793所描述的桿菌屬細菌，以及被連接到纖維素基因上遊末端鄰近區域包含的上述調節區域中並具有1kb或小於1kb，優選的0.6kb或小於0.6kb的長度。特定的在其它情況當中，目標蛋白質或多肽基因被理想地連接到SEQ ID NO1或2序列，或與SEQ ID NO1或2序列一定程度上同源、具有與上述序列相似調節功能的鹼基序列中。
本發明的重組微生物可通過如下方法獲得，使含有目標蛋白質或多肽基因的DNA片段與合適的質粒載體組合，並通過常規轉化方法將重組質粒整合進宿主微生物。可選地，本發明的重組微生物可通過另一方法獲得，即利用被連接到宿主微生物基因的合適同源區域中的DNA片段，將其直接整合進宿主微生物基因。
利用本發明的重組微生物進行目標蛋白質或多肽的生產可通過如下方法完成將重組微生物接種至含有可同化碳源、氮源和其它基本成分的培養基中，通過常規方法培養重組微生物，並於培養完成後，收集並純化目標蛋白質或多肽。
如上所述，可生成已缺失或失活芽孢形成相關基因的目標宿主微生物，並且通過利用宿主微生物可生產目標重組微生物。另外，利用重組微生物，可有效生產有用的蛋白質或多肽。通過利用枯草桿菌製得α-澱粉酶或纖維素酶的實例情況將於下文特別描述。
例如，當枯草桿菌屬細菌編碼RNA聚合酶亞基σF因子的sigF基因(768bp)被缺失時，可應用下列操作步驟，該RNA聚合酶亞基σF因子在芽孢形成II期或隨後時期出現的前芽孢中表達。
第一步，從枯草桿菌菌株的宿主微生物中提取基因組基因。以基因組基因為模板，通過SOE(重疊延伸拼接法)-PCR(Gene，77，61(1989))或其它方法將標記基因，如抗氯黴素基因插入待連接片段，即位於sigF基因起始密碼子上遊的DNA片段和位於sigF基因終止密碼子下遊的DNA片段之間，使二者連接起來。
下一步，通過適當方法利用上一步所獲DNA片段轉化宿主枯草桿菌屬細菌，並基於氯黴素抗性或其它特性，分離轉化株，促成sigF基因的上遊和下遊區域的同源重組，從而獲得相應的轉化株，該轉化株中，位於基因組上的sigF基因被諸如抗氯黴素基因等標記基因所替代。
其後，將含有編碼α-澱粉酶或纖維素酶的基因的質粒導入上一步獲得的轉化株中，並以枯草桿菌的原始細胞係為對照。在合適的條件下，例如在營養培養基中進行震蕩，培養已獲得的重組體。檢測培養溶液上清的α-澱粉酶活性或纖維素酶活性，並將其生產力與枯草桿菌原始細胞系的生產力相比較，從而確認通過缺失sigF基因可獲得增加量的目標產物。當分離和純化培養液時，可獲得α-澱粉酶和纖維素酶。
實施例實施例1從枯草桿菌168中提取基因組DNA。以提取的基因為模板，使基因組上在sigF基因(鹼基號2442658←2443425)上遊末端與其鄰近的一個長度為1.5-kb的DNA片段(A)，和在sigF基因下遊末端與其鄰近的一個長度為1.5-kb的DNA片段(B)倍增。以質粒pC194為模板，單獨倍增含有抗氯黴素基因的0.9-kb DNA片段(C)。通過SOE-PCR按順序連續連接片段(A)、(B)、(C)，從而製得長度為3.9-kb的DNA片段。通過適當方法利用獲得的DNA片段轉化枯草桿菌168。在含有氯黴素的LB瓊脂培養基上培養枯草桿菌168，分離菌落作為轉化株。通過PCR和測序證實該轉化株具有的基因組中，含sigF基因(2442632-2443318)的區域缺失，並被抗氯黴素基因替代。基因組的下列區域中的每一個都被分別缺失，並以與上述相似的方式被抗氯黴素基因替代含sigE基因的區域(1604136-1604976)；含spoIISB基因的替代部分(1347913←1348083)的區域(1347781-1348081)；含spoIIE基因的替代部分(70536→73019)的區域(70537-73018)；含sigG基因的替代部分(1605025→1605807)的區域(1605083-1605877)；含spoIVCB基因(2652262→2652732)的區域(2652156-2652723)；或含從spoIVCB基因到spoIIIC基因的區域(2652262→2701023)的區域(2652156-2701031)，從而製得參與芽孢形成的基因缺失的微生物。
將來源自桿菌sp.KSM-S237(Japanese Patent Application Laid-Open(kokai)No.2000-210081)的鹼性纖維素酶基因的一個DNA片段(3.1kb)導入穿梭載體pHY300PLK的限制酶BamHI切割點，從而製得重組體質粒pHY-S237。通過原生質體方法將質粒整合進實施例1製得的每個基因缺失微生物內，並以枯草桿菌168作為對照。在LB培養基(10ml)中，37℃，震蕩條件下培養獲得的微生物過夜。將相應的培養液(0.05ml)接種至2×L-麥芽糖培養基中(50ml；2％蛋白腖，1％酵母提取物，1％NaCl，7.5％麥芽糖，7.5-ppm 4-5水合硫酸錳，15-ppm四環素)，然後在30℃震蕩條件下培養3天。培養完成後，通過離心從培養液中除去細胞，並檢測上清液中的鹼性纖維素酶活性，以測定培養期間細胞外分泌的鹼性纖維素酶的數量。結果如表3所示，發現與對照微生物枯草桿菌168(野生型)相比，所有缺失了參與芽孢形成的基因的微生物都分泌了增加量的鹼性纖維素酶。
表3

工業適用性當應用本發明微生物時不形成芽孢。因此，本發明能夠生產目標蛋白質或目標多肽，同時降低能量損失、副產物的生產和特定生產速度，以大量減少培養基不必要的消耗。此外，蛋白質或多肽的生產期可以被延長，由此可以有效地製得目標產物。
序列表110花王株式會社120宿主微生物130KS-660140
141
150JP P2001-1605201512001-05-291602170PatentIn Ver.2.121012113150212DNA213桿菌sp.KSM-S237220
221CDS222(573)..(3044)220
221sig_肽222(573)..(659)220
221mat_肽222(660)..(3044)4001gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa 60taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt 120gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac 180gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata 240
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1.一種微生物，其中缺失或失活了一個或幾個參與芽孢形成中期到晚期的基因。
2.權利要求1所述的微生物，該微生物是屬於桿菌屬的細菌。
3.權利要求2所述的微生物，其中屬於桿菌屬的細菌是枯草桿菌。
4.權利要求1～3中任何一項所述的微生物，其中基因是於芽孢形成的II、III、IV和V期中的任意一個時期表達的，從而參與了芽孢形成。
5.權利要求1～4中任何一項所述的微生物，其中待缺失或失活的基因選自枯草桿菌的sigE基因、sigF基因、spoIIE基因、spoIISB基因、sigG基因、屬於從枯草桿菌的spoIVCB到spoIIIC區域中的基因、與這些基因中的任意一個或幾個等同的基因。
6.一種重組微生物，通過如下方法獲得將編碼了蛋白質或多肽，並連接到轉錄起始調節區域、翻譯起始調節區域、或分泌信號區域的區域下遊末端的基因整合進權利要求1～5中任何一項所述的微生物中。
7.權利要求6所述的重組微生物，其中轉錄起始調節區域、翻譯起始調節區域、或分泌信號區域來源自桿菌屬細菌的纖維素酶基因，或來源自纖維素酶基因的上遊延伸的1 kb區域。
8.權利要求6或7所述的重組微生物，其中轉錄起始調節區域、翻譯起始調節區域、或分泌信號區域來源自具有SEQ ID NO1或2序列，或具有與SEQ ID NO1或2序列有70％或更多同源性序列的纖維素酶基因。
9.一種通過利用權利要求6～8中任何一項所述的微生物生產蛋白質或多肽的方法。
全文摘要
一種已缺失或失活一個或幾個參與芽孢形成中期到晚期的基因的微生物；一種利用微生物製得目標產物(蛋白質)的方法。當應用該微生物時，不形成芽孢，由此能夠生產目標產物(蛋白質)，同時降低能量消耗、副產物的生產和特定生產速度，以減少培養基的不必要的消耗。此外，生產期可以被延長，從而可以有效地製得目標產物(蛋白質)。
文檔編號C12N1/20GK1513057SQ02811118
公開日2004年7月14日 申請日期2002年5月28日 優先權日2001年5月29日
發明者澤田和久, 遠藤圭二, 小澤忠弘, 東畑正敏, 尾崎克也, 也, 二, 弘, 敏 申請人:花王株式會社