一種雙光子螢光染料及其製備方法和用途與流程

2023-06-26 13:54:21

一、技術領域

本發明涉及一種雙光子螢光染料及其製備方法和用途，以實現示蹤和定位細胞中的溶酶體，具有單光子螢光量子產率高，斯託克斯位移大，有效雙光子吸收截面大，溶酶體定位係數高，光穩定性好的優點。

二、

背景技術：

溶酶體是真核細胞中的一種酸性細胞器，構成了哺乳動物細胞的終端降解「車間」，內含多種水解酶，專司分解各種外源和內源的大分子物質。它們通過吞噬、內吞和自噬的途徑接受和降解大分子，並且在多種生理過程中發揮重要的作用。為了深入了解它們的生理作用，各種溶酶體染料被開發，其中一些可商業購得。然而，這些染料大多都是單光子螢光染料。單光子螢光染料由於普遍存在激發光波長短(350-550nm)、穿透深度淺、光漂白和細胞自螢光等缺陷，因而限制了其在組織和活體成像中的應用。

克服這些問題首先需要可以在細胞和組織深處示蹤溶酶體的雙光子(tp)螢光染料，並藉助雙光子顯微鏡(tpm)實現該過程的可視化。tpm，它使用兩個低能量的光子激發，是一種可以在一段較長的時間內可視化深處完整組織的新技術。雙光子螢光染料具有很多單光子螢光染料所不具有的優點，如：細胞光毒性小，不會引起螢光自淬滅，時間空間解析度高，組織滲透深度大，因而雙光子螢光染料已經作為科學家們研究的一個重要課題。

確認一個生物活動是否發生在溶酶體中的最常見方法是利用螢光染料共定位實驗，在共定位實驗中，細胞被螢光染料標記用來識別特定的目標—溶酶體。為了能在雙光子顯微鏡下進行這樣的實驗，特定識別溶酶體的雙光子螢光染料是不可或缺的。

咔唑作為一種經典的螢光團，不僅具有大的共軛體系和共平面性能，而且具有良好的光穩定性。此外，由於聚乙二醇(peg)鏈既可以增加水溶性，又可以作為溶酶體靶向基團。所以本發明以咔唑為螢光團，peg鏈為溶酶體靶向基團開發了一種雙光子螢光溶酶體染料。以peg鏈為溶酶體靶向基團的咔唑基雙光子螢光染料未見報導。

三、

技術實現要素：

本發明旨在提供一種雙光子螢光染料及其製備方法和用途，所要解決的技術問題是通過分子設計遴選合適的雙光子螢光溶酶體染料結構，以實現示蹤細胞中的溶酶體，並具有良好的雙光子吸收性能和溶酶體定位效果，光穩定性好和細胞毒性小的優點。

本發明雙光子螢光染料，是以咔唑為母體，分別簡記為lyso-mco或lyso-nco，其結構式如下：

本發明雙光子螢光染料的製備方法，包括如下步驟：

1、中間體1的合成

在圓底燒瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g(5mmol)、koh0.560g(10mmol)、對甲苯磺酸三縮乙二醇單甲醚酯2.40g(me(ch2ch2o)3ots,7.55mmol)和dmf(30ml)後，充分攪拌溶解，室溫下反應24小時，反應過程中tlc跟蹤；反應結束後向反應液中加入水，然後用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，矽膠柱分離(洗脫液：石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v)，得到淡黃色固體1.695g，即為中間體1，產率60.0％。

2、lyso-mco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.33g(2.5mmol)4-甲氧基苯乙炔、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n於燒瓶中，在n2保護下110℃反應2天，反應液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，矽膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝14:1)，收集得到淡黃色固體lyso-mco，1.023g，產率為71.2％。

3、lyso-nco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.36g(2.5mmol)4-乙炔基-n,n-二甲基苯胺、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n於燒瓶中，在n2保護下110℃反應2天，反應液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，矽膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝13:1)，收集得到墨綠固體lyso-nco，1.14g，產率為76.2％。

本發明lyso-mco和lyso-nco的合成過程如下：

本發明雙光子螢光染料的用途，是在活細胞成像時作為溶酶體示蹤劑使用，檢測方法如下：

將本發明雙光子螢光染料lyso-mco或lyso-nco溶於dmso中製得2mm的母液，取50μl的該母液於10ml容量瓶中，再用不同溶劑定容，配製成10μm的檢測試劑。所用樣品池為1.0×1.0cm的石英比色皿，所用測試使用的溶劑均已除水，測試溫度皆為20～25℃。

本發明首先對雙光子螢光染料在二甲亞碸dmso溶劑中的的光物理性質做了研究，見圖1。從圖1中可以看出，化合物lyso-mco和lyso-nco的紫外最大吸收峰分別為318和328nm。分別以最大吸收波長為激發波長，它們的單光子螢光發射峰分別位於403nm和445nm(螢光量子產率分別為38.7％和42.5％)。化合物lyso-mco發藍光，化合物lyso-nco發藍綠光，lyso-nco較lyso-mco約有42nm的紅移。這和紫外吸收光譜的變化規律一致，隨著末端基團給電子能力的增強，螢光發射峰的紅移程度也隨之增大。在lyso-mco和lyso-nco濃度為0.5～10μm，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在403nm和445nm處的螢光發射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖3)。接著本發明對雙光子螢光染料在不同極性溶劑(甲苯toluene，乙酸乙酯ea，四氫呋喃thf，丙酮acetone，甲醇ch3oh，乙醇c2h5oh，n,n-二甲基甲醯胺dmf，二甲亞碸dmso)中的的光物理性質做了研究。溶劑的極性大小通常由溶劑的介電常數(ε)來確定，本實驗選取的溶劑按極性大小順序為：dmso(48.9)＞dmf(36.7)＞ch3oh(33.6)＞c2h5oh(24.3)＞acetone(20.7)＞thf(7.58)＞ea(6.02)＞toluene(2.37)。從圖2和表2中可以看出，兩種螢光染料都有明顯的溶致變色效應，並且溶劑的極性對lyso-nco的單光子螢光發射光譜的影響較lyso-mco更顯著。lyso-nco在不同溶劑中螢光發射峰位置的明顯變化，其主要原因是由於lyso-nco的分子結構中含有強的給電子基團—二甲氨基，化合物分子表現出較強的電荷轉移特徵，更容易和大極性的溶劑之間發生溶劑效應導致的。

利用雙光子誘導螢光測量技術，測試了濃度為10-3mol/l時目標化合物的雙光子吸收截面，從圖5可以看出，lyso-mco和lyso-nco的最大有效吸收截面(δф)分別是20gm、43gm，雙光子最大激發波長分別在690nm和700nm。在lyso-mco和lyso-nco濃度分別在0.2～1mm、0.01～1mm範圍內，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在418nm和493nm處的雙光子螢光發射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖4)。

使用mtt技術對lyso-mco和lyso-nco的細胞毒性進行了測試，從圖6可以看出，兩者的細胞毒性很低，適用於細胞內示蹤溶酶體。為了進一步證明螢光染料lyso-mco和lyso-nco的性能，我們研究了二者在細胞成像中的最佳濃度、最佳細胞培養時間、光穩定性和溶酶體定位係數測試。首先mcf細胞由deme(invitrogen)培養液培養，成像前一天，mcf細胞放於雷射共聚焦皿中，成像時mcf細胞分別和0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μm的螢光染料lyso-mco/lyso-nco的dmso溶液於37℃、含5％co2的細胞培養箱中孵育30min，用中性的pbs緩衝溶液洗滌3次。使用雙光子螢光共聚焦顯微鏡成像，設置綠色通道tracker1，激發波長為690nm，發射波段為380～420nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發射的螢光。重設綠色通道tracker1，激發波長為700nm，發射波段為425～465nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發射的螢光。從圖7可以觀察到，螢光染料lyso-mco和lyso-nco的在細胞成像中的最佳濃度為2.0μm。利用單一變量法，在相同實驗條件下，我們用2.0μm螢光染料lyso-mco和lyso-nco進行細胞成像，研究二者的最佳細胞培養時間。如圖8和9所示，螢光染料lyso-mco和lyso-nco的最佳細胞培養時間皆為12min。與此同時，螢光染料的光穩定性也是取決其性能的關鍵指標。因此，在相同的實驗條件下，我們用螢光染料lyso-mco和lyso-nco的最佳濃度培養細胞到最佳時間進行細胞成像，研究二者在不同時間點(0-20min)的光穩定性，即最長觀察時間。從圖10和11可以看出，螢光染料lyso-mco和lyso-nco的觀察時間皆為20min，在10min時，商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的螢光發射強度幾乎降低為0，而螢光染料lyso-mco和lyso-nco的螢光強度還有70％左右，這表明螢光染料lyso-mco和lyso-nco的光穩定性遠勝於lysosome@trackerred。從圖12可以看出，螢光染料lyso-mco和lyso-nco的綠色通道與商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的紅色通道之間圖像重疊效果很好，並得到了很高的位置重合係數(定位係數分別為0.9475和0.9398)。這一結果表明：螢光染料lyso-mco和lyso-nco能夠成功地選擇性定位細胞中的溶酶體。

本發明螢光染料分子結構簡單，易於合成，雙光子吸收性能好，快速靈敏，光穩定性好，細胞毒性小，能夠有效實現示蹤和可視化細胞內的溶酶體。

四、附圖說明

圖1是10μm的lyso-mco和lyso-nco在dmso中歸一化的紫外吸收光譜和螢光光譜。

圖2是10μm的lyso-mco和lyso-nco在不同溶劑中歸一化的紫外吸收光譜(a:lyso-mco,c:lyso-nco)和螢光光譜(b:lyso-mco,d:lyso-nco)。

圖3是10μm的lyso-mco(a)和lyso-nco(b)在不同濃度(0.5～10μm)下的單光子螢光光譜，插圖為單光子螢光發射峰強度隨染料濃度變化的線性關係。

圖4是lyso-mco(a,0.2～1mm)和lyso-nco(b,0.01～1mm)在不同濃度下的雙光子螢光光譜，插圖為雙光子螢光發射峰強度隨染料濃度變化的線性關係。

圖5是lyso-mco和lyso-nco在dmso中的有效雙光子吸收截面數值。

圖6是不同含量(0μm、5μm、10μm、15μm)的lyso-mco/lyso-nco的作用下的細胞存活率。

圖7是mcf細胞與不同濃度的lyso-mco/lyso-nco染色後的螢光共焦顯微鏡成像；比例尺：10μm。

圖8是mcf細胞與2.0μm的lyso-mco染色在不同的培養時間下的螢光共焦顯微鏡成像；比例尺：10μm。

圖9是mcf細胞與2.0μm的lyso-nco染色在不同的培養時間下的螢光共焦顯微鏡成像；比例尺：10μm。

圖10是mcf細胞與lyso-mco/lysosome@trackerred光穩定性測試，在培養12min後在不同時間點(0-20min)螢光共焦顯微鏡成像。比例尺：10μm。

圖11是mcf細胞與2.0μm的lyso-nco/lysosome@trackerred光穩定性測試，在培養12min後在不同時間點(0-20min)螢光共焦顯微鏡成像。比例尺：10μm。

圖12是2.0μm的lyso-mco和lyso-nco在mcf細胞中的溶酶體定位成像(圖a、e是mcf細胞的明場，圖b、f分別是2μm的lyso-mco和lyso-nco的成像，圖c、g是2μmlysosome@trackerred的成像，圖d是b、c的疊加，圖h是f、g的疊加。圖d、h的插圖分別為lyso-mco和lyso-nco與lysosome@trackerred的的螢光強度相關性，即二者對應的綠色通道與紅色通道的螢光強度相關性)。

五、具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步分析說明。

實施例1：化合物lyso-mco和lyso-nco的合成

1、中間體1的合成

在圓底燒瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g(5mmol)、koh0.560g(10mmol)、對甲苯磺酸三縮乙二醇單甲醚酯2.40g(me(ch2ch2o)3ots,7.55mmol)和dmf(30ml)後，充分攪拌溶解，室溫下反應24小時，反應過程中tlc跟蹤；反應結束後向反應液中加入水，然後用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，矽膠柱分離(洗脫液：石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v)，得到淡黃色固體1.695g，即為中間體1，產率60.0％。

m.p.72.4-74.6℃。ft-ir(kbr,cm-1):2884,1474,1422,1292,1123,798.1hnmr(cdcl3,400mhz):δ(ppm)8.29(d,j＝1.6hz,2h),7.70(d,j＝1.6hz,1h),7.68(d,j＝1.6hz,1h),7.22(d,j＝8.6hz,2h),4.40(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.81(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.52–3.37(m,8h),3.33(s,3h,ch3)；13cnmr(cdcl3,100mhz):δ(ppm)139.76,134.50,129.21,124.03,111.32,81.94,77.37,77.25,77.05,76.73,71.84,70.99,70.63,70.56,69.33,59.05,43.48；hrms(esi,m/z):calcdforc19h21i2no3([m+h]+)565.9709,found565.9689；anal.calcdforc19h21i2no3:c40.37,h3.74,i44.90,n2.47,o8.49；foundc40.58,h3.64,n2.26.

2、lyso-mco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.33g(2.5mmol)4-甲氧基苯乙炔、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n於燒瓶中，在n2保護下110℃反應2天，反應液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，用矽膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝14:1)，收集得到淡黃色固體lyso-mco，1.023g，產率為71.2％。

m.p.123.5-125.4℃.ft-ir(kbr,cm-1):2870,2520,1604,1360,1246,1021.1hnmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)8.23(d,j＝0.8hz,2h),7.62(d,j＝8.5,1.4hz,2h),7.51(d,j＝8.7hz,4h),7.41(d,j＝8.5hz,2h),6.90(d,j＝8.8hz,4h),4.47(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.87(t,j＝5.8hz,2h),3.84(s,6h,ch3),3.46(m,j＝8.7hz,8h,ch2),3.33(s,3h,ch3)；13cnmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm)159.36,140.50,132.92,129.58,123.81,122.58,115.93,114.41,114.01,109.30,89.11,87.70,77.35,77.24,77.04,76.72,71.84,71.02,70.66,70.58,69.37,59.02,55.32,43.53.hrms(esi,m/z):calcdforc37h35no5[m+h]+574.2611,found574.2593；anal.calcdforc37h35no5:c77.47,h6.15,n2.44；foundc77.00,h6.11,n2.26.

3、lyso-nco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.36g(2.5mmol)4-乙炔基-n,n-二甲基苯胺、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n於燒瓶中，在n2保護下110℃反應2天，反應液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，矽膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝13:1)，收集得到墨綠固體lyso-nco，1.14g，產率為76.2％。

m.p.145.2-147.6℃.ft-ir(kbr,cm-1):2884,2807,2207,1610,1512,1360,1130.1hnmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)8.22(s,2h),7.60(d,j＝8.5hz,2h),7.46(d,j＝8.7hz,4h),7.39(d,j＝8.5hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,4h),4.47(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.86(t,j＝5.7hz,2h,ch2),3.55(m,6h,ch2),3.41(t,j＝3.1hz,2h,ch2),3.34(s,3h,ch3),2.99(s,12h,ch3)；13cnmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm)149.86,140.23,132.56,129.43,123.56,122.59,114.88,111.97,110.74,109.16,88.71,88.32,71.81,70.99,70.61,70.53,69.34,58.98,43.45,40.28.hrms(esi,m/z):calcdforc39h41n3o3[m+h]+600.3250,found600.3226；anal.calcdforc39h41n3o3:c78.10,h6.89,n7.00；foundc78.05,h6.89,n6.80.

實施例2：雙光子螢光染料lyso-mco和lyso-nco在dmso中的光譜測試

將本發明雙光子螢光染料lyso-mco和lyso-nco分別溶於dmso中製得1mm的母液，取100μl的該母液於10ml容量瓶中，再用不同溶劑定容，配製成10μm的檢測試劑。從圖1中化合物lyso-mco和lyso-nco的紫外最大吸收峰分別為318和328nm。lyso-mco和lyso-nco分別在318nm、328nm激發下，lyso-mco和lyso-nco的單光子螢光發射峰分別位於403nm和445nm(圖1和表1)。化合物lyso-mco發藍光，化合物lyso-nco發藍綠光，lyso-nco較lyso-mco約有42nm的紅移。這和紫外吸收光譜的變化規律一致，隨著末端基團給電子能力的增強，螢光發射峰的紅移程度也隨之增大。在lyso-mco和lyso-nco濃度為0.5～10μm，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在403nm和445nm處的螢光發射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖3)。

表1化合物lyso-mco和lyso-nco在不同溶劑中的紫外吸收和單光子螢光光譜數據

註：a為紫外最大吸收波長；b為單光子螢光發射光譜的最大發射波長；c為斯託克斯位移；d為最大摩爾吸光係數。

實施例3：lyso-mco和lyso-nco的的雙光子吸收性能測試

利用雙光子誘導螢光測量技術，測試了濃度為10-3mol/l時目標化合物的雙光子吸收截面，從圖5可以看出，lyso-mco和lyso-nco的最大有效吸收截面(δф)分別是20gm、43gm，雙光子最大激發波長分別在690nm和700nm。從圖5中可以看出lyso-nco的雙光子吸收性能比lyso-mco更好。在lyso-mco和lyso-nco濃度分別在0.2～1mm、0.01～1mm範圍內，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在418nm和493nm處的雙光子螢光發射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖4)。

實施例4：細胞毒性測試

mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)實驗是根據已報導的文獻，做細胞毒性測試。分別在同一批mcf細胞中加入0，5，10，15μm的螢光染料分子，此條件是在37℃、含5％co2的細胞培養箱中孵育24小時，根據細胞存活度的公式：細胞存活率％＝od570(樣品)/od570(對照組)×100，可算得細胞存活率(圖6)。從圖6中我們可以看出，染料lyso-mco和lyso-nco的濃度為10μm時，細胞存活率分別為83％、88％左右，當二者的濃度達到15μm時，細胞存活率仍然分別有約80％、85％，說明了本發明螢光染料分子的細胞毒性小，因此可以用來做細胞檢測及跟蹤溶酶體。

實施例4：光穩定性測試

mcf細胞由deme(invitrogen)培養液培養，成像前一天，mcf細胞放於雷射共聚焦皿中，成像時mcf細胞分別和2μm的螢光染料lyso-mco和lyso-nco的dmso溶液於37℃、含5％co2的細胞培養箱中孵育12min，用中性的pbs緩衝溶液洗滌3次後，再往培養皿中分別加入0.5μm商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred溶液繼續孵育12min，用中性的pbs緩衝溶液洗滌3次。用雙光子螢光共聚焦成像，設置綠色通道tracker1，激發波長為690nm，發射波段為380～420nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco在不同時間點(0-20min)發射的螢光。在相同測試條件下，重設綠色通道tracker1，激發波長為700nm，發射波段為425～465nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco在不同時間點(0-20min)發射的螢光。設置紅色通道tracker2，激發波長為577nm，發射波長為580-600nm，這個通道用來接收商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred發射的螢光。從圖10和11可以看出，螢光染料lyso-mco和lyso-nco的最長觀察時間皆為20min，在10min時，商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的螢光發射強度幾乎降低為0，而螢光染料lyso-mco和lyso-nco的螢光強度還有70％左右，這表明螢光染料lyso-mco和lyso-nco的光穩定性遠勝於lysosome@trackerred。

實施例5：細胞溶酶體定位測試

mcf細胞由deme(invitrogen)培養液培養，成像前一天，mcf細胞放於雷射共聚焦皿中，成像時mcf細胞分別和2μm的螢光染料lyso-mco和lyso-nco的dmso溶液於37℃、含5％co2的細胞培養箱中孵育12min，用中性的pbs緩衝溶液洗滌3次後，再往培養皿中分別加入0.5μm商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred溶液繼續孵育12min，用中性的pbs緩衝溶液洗滌3次。用雙光子螢光共聚焦成像，設置綠色通道tracker1，激發波長為690nm，發射波段為380～420nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發射的螢光。設置紅色通道tracker2，激發波長為577nm，發射波長為580-600nm，這個通道用來接收商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred發射的螢光。在相同測試條件下，重設綠色通道tracker1，激發波長為700nm，發射波段為425～465nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發射的螢光。從圖12可以看出，螢光染料lyso-mco和lyso-nco的綠色通道與商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的紅色通道之間圖像重疊效果很好，並得到了很高的位置重合係數(定位係數分別為0.9475和0.9398)。這一結果表明：螢光染料lyso-mco和lyso-nco能夠成功地選擇性定位細胞中的溶酶體。