基於補體組分c5a的疫苗的製作方法

2023-06-26 19:22:31

基於補體組分c5a的疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種包含至少一種肽的疫苗，所述肽組成為由以下胺基酸序列組成的7至19個胺基酸殘基：(X3)mKDX2QLGX1 (SEQ ID No.99)，其中X1是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，X2是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，X3是(X4)nANISX5(SEQ ID No.100)或其由1至4個胺基酸殘基組成的N端截短的片段，X4是VVASQLR(SEQ ID No.101)或其由1至6個胺基酸殘基組成的N端截短的片段，X5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、精氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，m是0或1，且n是0或1，其中所述至少一種肽與包含至少一種T細胞表位的載體偶聯或融合。
【專利說明】基於補體組分C5A的疫苗
[0001] 本發明涉及一種要在醫學、免疫學、和分子生物學領域中使用以預防和/或治療 補體組分C5a誘導的慢性炎性疾病的藥物。
[0002] 補體是先天免疫系統的一種中心組分，其針對微生物，諸如病毒，細菌和其他外 來的及異常的細胞為宿主提供保護。然而，補體系統的不適當或過多的活化可以導致針 對宿主自身的破壞能力。不受控制的補體活化參與許多慢性炎性疾病，諸如阿爾茨海默 (Alzheimer)氏病，帕金森（Parkinson)氏病，亨丁頓（Huntington)氏病，年齡相關性黃斑 變性（age-relatedmaculardegeneration)，類風溼性關節炎（rheumatoidarthritis) 系統性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosus),抗磷脂症候群（antiphospholipid syndrome)，哮喘，血管炎（vasculitis)，動脈粥樣硬化（atherosclerosis)，多發性硬化 (multiplesclerosis)，炎性皮炎(inflammatorydermatitis)，諸如銀屑病（psoriasis) 和慢性蕁麻疫（chronicurticaria)，格巴二氏症候群（Guillain-Barresyndrome)，和溶 血尿毒症候群（hemolyticuremicsyndrome) 〇
[0003]不受控制的補體活化也可以在癌症，妊娠併發症（pregnancycomplication)， 諸如先兆子癇（preeclampsia)和抗磷脂症候群中，以及在急性病理狀況，包括敗血症 (sepsis),急性肺損傷（acutelunginjury),急性呼吸窘迫症候群（acuterespiratory distresssyndrome,ARDS),和缺血-再灌注損傷下發生。大面積的補體活化也存在於人工 表面上，導致血液透析關聯的血栓形成（hemodialysis-associatedthrombosis)。
[0004] 這些狀況中看到的許多毒性效應可歸因於促進炎性反應並使其永久存在的過敏 毒素C5a的過多生成。C5a的主要功能是粒細胞、柱狀細胞、和巨噬細胞的趨化性和活化，其 介導可溶性免疫因子的釋放。因此，多年來已經公認對補體活性的抑制或調控是一種有希 望的治療策略。
[0005] 大多數補體蛋白質以無活性前體形式存在於血漿中，該無活性前體響應三種不同 機制而在蛋白水解級聯中彼此切割並活化：經典途徑，凝集素誘導，和旁路途經。所有三種 活化級聯的最終結果是應答的大幅放大和過敏毒素C3a和C5a及細胞殺傷膜攻擊複合物 (MAC)(-種引起細胞裂解的孔）的形成。
[0006] 補體組分C5是一種190kDa蛋白質，並且包含兩條鏈（a115kDa和0 75kDa)。任 一種補體途徑的活化可以生成酶C5轉化酶，其能夠切割C5為C5b和有力的過敏毒素C5a。 在C5的切割後，C5a片段上的C端新表位（neoepitope)被暴露。
[0007] 人C5a是一種具有12-14. 5kDa分子量的長74個胺基酸的糖蛋白。該分子由通過 三個內部二硫鍵穩定的4個a-螺旋構成。天冬醯胺位於64位，其具有對於生物學活性 而言不是必需，但是非常可能調節C5體內活性的N-連接的碳水化合物模塊（moiety)。在 C5a片段被C5轉化酶切割後不久，長74個胺基酸的C5a蛋白的恰好C末端精氨酸殘基被血 清和細胞表面羧基肽酶除去，並且形成活性較小的C5adesARG分子。C5a蛋白的兩種形式 C5aARG和C5adesARG都結合7次跨膜域受體C5aR(CD88)和特徵較少的C5L2 (gpr77)，其 在極其多種細胞上遍在表達，但是尤其在免疫細胞，如巨噬細胞，嗜中性粒細胞，柱狀細胞， 和T細胞的表面上表達。C5aR的配體結合位點是複雜的，並且由至少兩個物理上可分開的 結合域組成。一個結合二硫化物連接的C5a核心（胺基酸15-46)，而第二個結合C5a羧基 端末端（胺基酸67-74)。05&1?與其配體053的結合親和力是非常高的，解離常數〇(1))為 約InM。
[0008] 本發明的一個目的是提供用於治療補體組分C5a誘導的疾病或病理學的手段和 方法。
[0009] 本發明涉及一種包含至少一種肽的疫苗，所述肽組成為由以下胺基酸序列組成的 7至19個，優選7至14個胺基酸殘基：
[0010] (X3)mKDX2QLGX1(SEQIDNo. 99),
[0011] 其中
[0012] &是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，
[0013] x2是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、 甲硫氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，
[0014] X3是（X4)nANISX5(SEQIDNo. 100)或其由1至4個，優選1、2、3或4個胺基酸殘 基組成的N端截短的片段，
[0015] IDNo. 101)或其由1至6個，優選1、2、3、4、5或6個胺基酸殘 基組成的N端截短的片段，
[0016] x5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、精氨 酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，
[0017] m是 0 或 1，且
[0018] n 是 0 或 1，
[0019] 其中所述至少一種肽與包含至少一種T細胞表位的載體偶聯或融合。
[0020] 本發明涉及針對在各種慢性炎性疾病中上調的身體自身的C5a的自動免疫。在 C5a的C端在C5分子切割後變得易接近的新表位是本發明的免疫靶物。因此，C5b片段（其 在宿主防禦中發揮主要作用）的生成和功能不會受到影響。
[0021] 更詳細地，本發明涉及基於偶聯或融合於包含至少一種T細胞表位的載體的初始 hC5aC端表位的肽變體（所謂的VARI0T0PES)的疫苗，其中VARI0T0PES相對於hC5a的初 始C端序列包含至少1處胺基酸殘基交換。
[0022] VARI0T0PES模擬感興趣的表位而不與其相同，因此VARI0T0PE疫苗的優點是躲避 對自身抗原的自身耐受性。此外，VARI0T0PES的使用減輕由於使用自身抗原而普遍的無意 副作用的風險。
[0023] 例如，可以使用"丙氨酸掃描"法鑑定並選擇hC5aC端表位的VARI0T0PES。丙氨 酸掃描誘變指將某個蛋白質或肽區內的各個胺基酸用丙氨酸殘基系統性取代以測定某些 位置的功能作用。丙氨酸由於其消除0碳上的側鏈並且不改變主鏈構象且它也不強加極 端的靜電或空間效應而成為選擇的取代殘基。
[0024] 使用此技術，可以鑑定hC5aC端表位中對於hC5a體液免疫應答的誘導至關重要 或必不可少的胺基酸殘基。在下一步中，可以將在不損害hC5a體液免疫應答的誘導的前提 下證明為可交換的位置用具有不同特性的胺基酸殘基系統性取代以確定VARI0T0PES，其在 與初始表位相比時能夠誘導具有更高或至少相等的針對人C5a的抑制活性的抗體。隨後， 可以對在hC5a的C端表位內的兩個或三個胺基酸交換的組合測試其免疫原性和功能活性。
[0025] VARI0T0PES是本發明的目的，其與初始C端表位相比能夠誘導顯示更高或至少相 等的針對人C5a的抑制活性的抗體。
[0026] 令人驚訝地，證明了為了能夠引發令人滿意的免疫應答，肽需要SEQ ID No. 99中 分別在2、3、5、6和7位的至少賴氨酸、天冬氨酸、穀氨醯胺、亮氨酸和甘氨酸殘基的存在 (圖1A和1B)。甚至更令人驚訝的是如下的實情：在最後一位上具有胺基酸交換的肽（SEQ ID N0. 99的X1;X 1在野生型C5a C端區中是精氨酸殘基，參見SEQ ID No. 1至4)能夠誘導 的針對C5a蛋白的體液免疫應答顯著高於由包含SEQ ID No. 1至4的野生型C5a的片段誘 導的免疫應答（圖1A至1D)。重要地，如圖2A至2D中描繪的，較高的體液免疫應答還導致 顯著較高的對C5a活性的抑制。在使用含有野生型C5a C端區的最後第5位M殘基的氨基 酸交換的肽（參見例如SEQ ID No. 10或18)或含有野生型C5a C端表位的最後第8位H殘 基的胺基酸交換的肽（參見例如SEQ ID No. 7或17)免疫時也可以觀察到類似的結果（圖 1和圖2)。圖3至圖6中顯示的結果支持這種令人驚訝的效應，即源自上述胺基酸（分別 在野生型C5a末端表位的最後，最後第5和最後第8位的R、M或H;參見例如SEQ ID No. 1 至4)的胺基酸交換的肽具有誘導C5a特異性抗體免疫應答的能力，該C5a特異性抗體免疫 應答比包含SEQ ID No. 1至4的野生型C5a片段誘導的免疫應答更高且更有力。本文描述 了與相應的野生型C5a片段相比顯示高得多的C5a抑制能力的肽。
[0027] 對於本發明而言無關的是在W0 90/09162中，公開了幾種肽，其顯示與人野生型 C5a片段的一些同源性，並且其用作C5a活性激動劑。然而，其中公開的肽以可溶性肽應用， 該可溶性肽尚未與載體蛋白偶聯，並且因此不能用於本發明的目的，因為它們不能誘導抑 制C5a活性的抗體的形成。例如，在W0 90/09162的實施例426中，公開了在1位包含苯丙 氨酸殘基的肽。在本發明中，可以顯示此類取代導致顯著降低的C5a抑制活性（參見例如 SEQ ID No. 54,圖 4)。
[0028] 本發明疫苗中包含的至少一種肽包含或組成為（consist of) 7個，優選8個，優選 9個，優選10個，優選11個，優選12個，優選13個，優選14個，優選15個，優選16個，優選 17個，優選18個，優選19個胺基酸殘基。
[0029] 根據本發明，&是（X4)nANISX 5(SEQ ID No. 100)或其N端截短的片段。因此， 此 N 端截短的片段可以由 ANISX5(SEQ ID N〇.102)，NISX5(SEQ ID N〇.103)，ISX5，SX5* X5組成。這意味著本發明的疫苗可以包含至少一種肽，若m= 1，則該肽具有胺基酸序列 ANISXgKDX^LGX^SEQ ID No. 104), NISXgKDX^LGXi (SEQ ID No. 105), ISXgKDX^LGXi (SEQ ID No. 106)，SXgKDXWLGXi (SEQ ID No. 107)或 XgKDXWLGXi (SEQ ID No. 108)。
[0030] 根據本發明，ID No. 101)或其N端截短的片段。VVASQLR 的片段可以由下列一項胺基酸序列組成：VASQLR (SEQ ID No. 109)，ASQLR (SEQ ID No. 110)，SQLR(SEQ ID No. 111)，QLR，LR，或 R。因此，若 m和 n 是 1，則本發明疫苗中 使用的至少一種肽可以具有下列一項胺基酸序列WVASQLRANISXJDXALGXi (SEQ ID No. 112) , VASQLRANISXgKDX^LGX^SEQ ID No. 113) , ASQLRANISXgKDX^LGX! (SEQ ID No. 114), SQLRANISXgKDX^LGX^SEQ ID No. 115), QLRANISXgKDX^LGX! (SEQ ID No. 116), LRANISX5KDX2QLGX1(SEQIDNo.117)，*RANISX5KDX2QLGX1(SEQIDNo.118)。
[0031] 本發明的疫苗可以包含超過一種依照SEQIDNo.99的肽。特別優選的是，疫苗包 含至少一種具有胺基酸序列SEQIDNo. 99的肽。然而，本發明的疫苗還可以包含至少2種， 至少3種，至少4種，或甚至至少5種具有胺基酸序列SEQIDNo. 99的肽。當然，也有可能 組合本發明的至少一種肽與可以用於治療與本發明狀況相同的狀況的其他肽或活性成分。
[0032] 肽/載體組合是重要的，因為本發明的肽在不與載體偶聯的情況下注射時沒有誘 導相關量的抗體的能力。此外，載體有助於持久抗體應答的誘導。因此，針對hC5a的主動 免疫的本發明相對於採用用於治療基於C5a的疾病的單克隆抗體療法提供優勢。因此，可 以避開單克隆C5a抗體療法的缺點，包括需要重複輸注大量的抗體、患者的頻繁醫院訪視， 和人源化抗體的高生產成本。
[0033] 可以通過本領域中公知的化學合成法，以分離的肽或以另一種肽或多肽的一部 分以合成方式生成本發明的至少一種肽。或者，至少一種肽可以在在微生物，諸如細菌， 酵母或真菌中，在真核細胞，諸如哺乳動物或昆蟲細胞中，或在重組病毒載體，諸如腺病 毒，痘病毒，皰疫病毒，Simliki森林病毒（Simlikiforestvirus)、杆狀病毒、噬菌體、辛 德比斯病毒（sindbisvirus)或仙臺病毒（sendaivirus)中生成，其生成化合物/肽，然 後，將所述化合物/肽分離，並且在期望時進一步純化。適合於生成化合物/肽的細菌包 括大腸桿菌（E.coli)、枯草芽孢桿菌（B.subtilis)或任何其它能表達肽的細菌。適合於 表達所述化合物/肽的酵母類型包括釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖 酵母（Schizosaccharomycespombe)、假絲酵母屬菌種（Candidaspp.)、巴斯德畢赤酵母 (Pichiapastoris)或任何其它能表達肽的酵母。相應的方法是本領域中公知的。還有，用 於純化並分離重組生成的肽的方法是本領域中公知的，且包括例如凝膠過濾、親和層析、離 子交換層析等。
[0034] 為了有助於分離化合物/肽，可以生成融合多肽，其中將所述化合物/肽與異源多 肽在翻譯上融合（共價融合），所述異源多肽使得能夠通過親和層析來進行分離。典型的異 源多肽是His標籤（例如His6 ;6個組氨酸殘基）、GST標籤（穀胱甘肽-S-轉移酶）等。 融合多肽不僅幫助化合物/肽的純化，還能預防純化步驟期間化合物/肽的降解。如果期 望在純化後移除異源多肽，那麼該融合多肽可在化合物/肽和異源多肽之間的接合處包含 切割位點。所述切割位點可由用酶（例如蛋白酶）切割的胺基酸序列組成，所述酶對於該 位點處的胺基酸序列是特異性的。
[0035] Xi可以是非極性脂肪族胺基酸殘基，諸如A、G、V、L、M或I;極性、不帶電荷的氨基 酸殘基，諸如S、T、N或Q;帶正電荷的胺基酸殘基，諸如K或H;或極性芳香族胺基酸殘基， 諸如￥。&可以是選自下組的胺基酸殘基'1^乂、1、1(、1?、11、1'和￥。乂 5可以是非極性脂 肪族胺基酸殘基，諸如A、M、I;極性不帶電荷的胺基酸殘基，諸如S、T、N或Q;或帶電荷的氨 基酸殘基，諸如K、R、H或E。
[0036] 根據本發明的一個優選的實施方案，\是選自下組的胺基酸殘基：蘇氨酸、穀氨醯 胺、酪氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、和纈氨酸。
[0037] 本發明的又一個優選的實施方案，若m是1且X5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨 酸、組氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸，和/或&是選自下組的胺基酸殘基：甲硫氨酸、丙氨酸、 賴氨酸和纈氨酸，則&是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、賴 氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸（XIisanaminoacidresidueselectedfromthe groupconsistingofalanine,asparagine,glutamine,histidine,lysine,methionine ，serine，andthreonineifmislandXsisanaminoacidresidueselectedfrom thegroupconsistingofalanine,histidine,methionineandthreonine,preferably alanine,threonineormethionine,and/orX2isanaminoacidresidueselected fromthegroupconsistingofmethionine,alanine,lysineandvaline)。
[0038] 根據本發明的一個特別優選的實施方案，m是1，且X5是選自下組的胺基酸殘基： 丙氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸。
[0039] 根據本發明的一個優選的實施方案，\是選自下組的胺基酸殘基：甲硫氨酸、丙氨 酸、賴氨酸和纈氨酸。
[0040] 根據本發明的又一個優選的實施方案，至少一種肽選自下組：
[0041] ISHKDMQLGA(SEQIDNo. 14) ,ANISHKDMQLGA(SEQIDNo. 21) ,KDMQLGA(SEQ IDNo. 22),VVASQLRANISHKDMQLGA(SEQIDNo. 23),ANISHKDMQLGT(SEQIDNo. 24),ANISHKDMQLGQ(SEQIDNo. 25),ANISHKDMQLGY(SEQIDNo. 26),ANISHKDMQLGM(SEQID No. 27),ANISHKDMQLGG(SEQIDNo. 28),ANISHKDMQLGV(SEQIDNo. 29),ANISHKDMQLGK(SEQ IDNo.30), ANISHKDMQLGS(SEQIDNo.31), ANISHKDMQLGH(SEQIDNo.32), ANISHKDMQLGN(SEQIDNo.33),ANISHKDMQLGL(SEQIDNo. 34),ANISTKDMQLGA(SEQ IDNo.70), ANISTKDMQLGQ(SEQIDNo.71), ANISTKDMQLGS(SEQIDNo.72), ANISTKDMQLGM(SEQIDNo. 73),ANISMKDMQLGN(SEQIDNo. 74),ANISTKDKQLGM(SEQID No. 75),ANISTKDMQLGH(SEQIDNo. 76),ANISAKDMQLGA(SEQIDNo. 77),ANISMKDMQLGA(SEQ IDNo.78), ANISTKDKQLGA(SEQIDNo.79), ANISTKDAQLGA(SEQIDNo.80), ANISMKDMQLGS(SEQIDNo. 81),ANISTKDVQLGA(SEQIDNo. 82),ANISTKDMQLGN(SEQID No. 83),ANISTKDMQLGK(SEQIDNo. 84),ANISMKDMQLGM(SEQIDNo. 85),ANISTKDMQLGT(SEQ IDNo.86)，ANISHKDKQLGK(SEQIDNo.87)，ANISMKDMQLGH(SEQIDNo.88)，和 ANISAKDAQLGA(SEQIDNo.89)。
[0042] 根據一個特別優選的實施方案，至少一種由胺基酸序列SEQIDNo. 99組成的肽在 其N和/或C端包含與其直接或經由間隔物序列結合的至少一個半胱氨酸殘基。
[0043] 此半胱氨酸殘基可以充當反應基團以使肽與另一種分子或載體結合。例如，可以 使用此基團使肽與載體蛋白結合。可以將半胱氨酸殘基直接與本發明的肽結合或者經由間 隔物序列結合。優選地，間隔物序列包含至少1個，優選至少2個，更優選至少3個，甚至更 優選至少4個，且任選最多10個，優選最少5個小的非極性胺基酸殘基，諸如甘氨酸。
[0044]根據本發明的一個優選的實施方案，載體選自下組：匙孔蟲戚血藍蛋白（KLH)、 CRM197、破傷風類毒素（TT)、白喉毒素（DT)、蛋白D或含有T細胞表位的任何其他蛋白質或 肽。
[0045] 根據本發明，將肽與藥學可接受載體，優選KLH(匙孔蟲戚血藍蛋白）、破傷風類毒 素、清蛋白結合蛋白、牛血清清蛋白、樹枝狀聚合物（dendrimer)、肽接頭（或側翼區）及 Singh等（Singh等，Nat.Biotech. 17，（1999) : 1075-1081 (特別是所述文件表 1 中的那些 佐劑物質）），及 〇，Hagan等（0，HaganandValiante,NatureReviews,DrugDiscovery 2(9) ; (2003): 727-735 (特別是其中描述的內源免疫加強化合物和投遞系統））中描述的佐 劑物質，或其混合物偶聯或融合。此背景中的偶聯化學（例如經由異雙功能化合物如GMBS， 以及當然還有其他化合物，如在"BioconjugateTechniques",GregT.Hermanson中描述的 化合物）可以選自本領域技術人員已知的反應。
[0046] 或者，也可能通過本領域中已知的方法將本發明的至少一種肽與蛋白質載體融 合。此類蛋白質包含如本文中描述的肽以及無關的免疫原性蛋白質。優選地，免疫原性蛋白 質能夠引發回憶應答。此類蛋白質的例子包括破傷風、肺結核、肝炎蛋白和蛋白D，即革蘭氏 陰性細菌乙型流感嗜血菌（HaemophilusinfluenzaB)的表面蛋白（W0 91/18926)。優選 地，使用蛋白D衍生物，其包含所述蛋白質的大致第一個三分之一（例如N端的前100-110 個胺基酸），並且可以是脂質化的。可以用於提供融合蛋白的另一種載體可以是稱為LYTA 的蛋白質，或其部分（優選C端部分hLYTA源自肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumonia), 其合成稱為醯胺酶LYTA的N-乙醯基-L-丙氨酸醯胺酶（其由LytA基因編碼；Gene43 ; (1986) :265-292)。LYTA是一種特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵的自溶素。在一個優選 的實施方案內，可以將LYTA的重複部分摻入融合蛋白中。重複部分存在於開始於殘基178A 的C端區中。一個特別優選的重複部分摻入殘基188-305。
[0047] 根據本發明的一個優選的實施方案，肽是與佐劑一起配製的，優選吸附至明礬 (alum)〇
[0048] 依照本發明的疫苗可以與佐劑，優選低可溶性鋁組合物，特別是氫氧化鋁 一起配製。當然，也可以使用如下的佐劑，如MF59、磷酸鋁、磷酸鈣、細胞因子（例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、皂苷類（例如QS21)、MDP衍生物、CpG寡聚物、LPS、MPL、聚磷腈 (polyphosphazene)、乳劑（例如弗氏（Freund，S)、SAF)、脂質體、病毒顆粒（virosome)、 Iscoms、Cochleate、PLG微粒、泊洛沙姆（poloxamer)顆粒、病毒樣顆粒、熱不穩定性腸毒素 (LT)、霍亂毒素（CT)、突變體毒素（例如LTK63和LTR72)、微粒和/或聚合的脂質體。
[0049] 例如，合適的佐劑以AS01B，AS02A，AS15,AS-2 及其衍生物（GlaxoSmithKline Philadelphia,PA) ;CWS，TDM，Leif，鋁鹽，諸如氫氧化鋁凝膠（明礬）或磷酸鋁；鈣、鐵 或鋅的鹽；醯化酪氨酸的不溶性懸浮液；醯化糖類；陽離子或陰離子衍生化多糖；聚磷腈 (polyphosphazene);生物降解性微球體；單磷醯脂質A和QuilA可購得。細胞因子，諸如 GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可以用作佐劑。
[0050] 在本文中提供的疫苗內，佐劑組合物優選設計為主要誘導Thl型的免疫應答。高 水平的Thl型細胞因子（例如IFN-y、TNFct、IL-2和IL-12)趨向於有利於誘導細胞介導的 對施用抗原的免疫應答。比較而言，高水平的Th2型細胞因子（例如IL-4、IL-5、IL-6和 IL-10)趨向於有利於誘導體液免疫應答。
[0051] 在如本文中提供的疫苗應用後，患者會支持包括Thl和Th2型應答在內的免疫應 答。在一個優選的實施方案內，其中應答主要是Thl型，Thl型細胞因子的水平會升高至比 Th2型細胞因子的水平大的程度。可以使用標準測定法容易評估這些細胞因子的水平。對 於細胞因子家族的綜述，參見Janeway等，Immunobiology,第5版，2001。
[0052] 在引發主要Thl型應答中使用的優選佐劑包括例如單磷醯脂質A， 優選3-0-脫醯化單磷醯脂質A(3D-MPL)，任選與鋁鹽的組合（參見例如Ribi 等,ImmunologyandImmunopharmacologyofBacterialEndotoxins,PlenumPubl. Corp. ,NY, (1986):407-419;GB2122204B;GB2220211;及US4,912,094)。一種優選的 3D-MPL形式是具有直徑小於0. 2mm的小粒徑的乳劑，並且其製備方法公開於W0 94/21292。 包含單磷醯脂質A和表面活性劑的水性配製劑已經記載於W0 98/43670中。例示性的優 選佐劑包括AS01B(脂質體配製劑中的MPL和QS21)，脂質體配製劑中的3D-MPL和QS21，AS02A(MPL和QS21及水包油乳劑），3D-MPL和QS21和水包油乳劑，及AS15,可購自 GlaxoSmithKline。MPL佐劑可購自GlaxoSmithKline,Seattle,WA(參見US4, 436, 727;US 4, 877, 611;US4, 866, 034 及US4, 912, 094)。
[0053] 含有CpG的寡核苷酸（其中CpG二核苷酸是未甲基化的）也誘導主要Thl應答。 CpG是存在於DNA中的胞苷-鳥苷二核苷酸基序的縮寫。此類核苷酸是公知的，並且記載於 例如恥96/02555，恥99/33488，舊6,008,200和舊5,856,462。例如，5&仂等，5(^611。6 273 ; (1996) :352也描述了免疫刺激性DNA序列。CpG在配製成疫苗時通常與游離的抗原一 起以游離的溶液施用（W096/02555;MCCluSkie和Davis，見上文）或與抗原共價綴合（TO 98/16247)，或與載體諸如氫氧化鋁一起配製（（肝炎表面抗原）Davis等，見上文；
[0054] Brazolot-Millan等，PNASUSA, 95 (26)，（1998) : 15553-8)。 本領 域中已知CpG為可以通過系統和黏膜路徑兩者施用的佐劑（W0 96/02555,EP 0468520,Davis等，J.Immunol,160 (2)，（1998):870-876;McCluskie和Davis,J.Immun ol.，161(9)，（1998):4463-6)。
[0055] 另一種優選的佐劑是皂苷或皂苷模擬物或衍生物，優選QS21(Aquila BiopharmaceuticalsInc.)，其可以單獨或與其他佐劑組合使用。例如，增強的系統牽涉 單磷醯脂質A和皂苷衍生物的組合，諸如如W0 94/00153中描述的QS21和3D-MPL的組 合，或反應原性較小的（lessreactogenic)組合物，其中QS21用膽固醇淬滅，如記載於 W0 96/33739的。其他優選的配製劑包含水包油乳劑和生育酚。一種牽涉水包油乳劑中的 QS2U3D-MPL和生育酚的特別有力的佐劑配製劑記載於W0 95/17210。本發明中使用的額 外皂苷佐劑包括QS7(記載於W0 96/33739和W0 96/11711)和QS17(記載於US5,057,540 和EP0362279B1)。
[0056] 其他優選的佐劑包括MontanideISA720 (Seppic,France)、 SAF(Chiron,California,UnitedStates)、ISCOMS(CSL)、MF-59 (Chiron)、SBAS佐劑序列 (例如SBAS-2、AS2,、AS2、SBAS-4、或SBAS6,可購自GlaxoSmithKline)、Detox(Corixa)、 RC-529(C〇riXa，Hamilt〇n，MT)和其他氨基-烷基氨基葡糖苷4-磷酸（AGP)。其他佐劑例 子包括合成的MPL和基於志賀毒素（Shigatoxin)B亞基的佐劑（參見W0 2005/112991)。
[0057] 本發明的疫苗可以皮下，肌肉內，皮內，靜脈內施用（參見例如"Handbook ofPharmaceuticalManufacturingFormula-tions，'，SarfarazNiazi,CRCPress Inc，2004)。根據施用路徑，藥物可以包含相應的載體、佐劑、和/或賦形劑。
[0058] 依照本發明的疫苗含有0?lng至10mg，優選10ng至lmg，特別是100ng至lOOiig， 或備選例如l〇〇fmol至10umol,優選lOpmol至1umol,特別是lOOpmol至lOOnmol量的 依照本發明的化合物。以優選每劑l〇〇ng至lmg，更優選1iig至500iig，甚至更優選10iig 至100Ug，特別是20至40或30yg的量對哺乳動物施用本發明的化合物或肽。通常，疫苗 還可以含有輔助物質，例如緩衝劑，穩定劑，等等。依照本發明的疫苗在2周直至2個月的 時間間隔中應用3至6次。在存在抗C5a抗體後，以約6個月的定期時間間隔應用疫苗。 [0059] 依照本發明的一個優選的實施方案，在補體介導的病症的治療中使用疫苗（參見 例如AllegrettiM等，CurrMedChem12(2005):217-236)。因此，本發明還涉及用於治療 患有補體介導的病症的個體的方法，其通過施用依照本發明的疫苗進行。
[0060] 補體介導的病症優選是炎性疾病，優選慢性炎性疾病。
[0061] 優選地，炎性疾病選自下組：年齡相關性黃斑變性（AMD)，神經變性性病症，優選 阿爾茨海默氏病，帕金森氏病或亨丁頓氏病，變應性哮喘（allergicasthma)，動脈粥樣硬 化，格巴二氏症候群，血管炎，炎性皮炎，優選銀屑病和蕁麻疹，類風溼性關節炎，抗磷脂綜 合徵（APS)，多發性硬化，溶血尿毒症候群，和系統性紅斑狼瘡（SLE)。
[0062] 補體介導的病症優選是缺血-再灌注損傷，急性肺損傷，急性呼吸窘迫症候群 (ARDS)，敗血症，癌症，妊娠併發症，諸如先兆子癇，反覆性自然流產，宮內生長遲緩和APS。 [0063] 根據本發明，補體介導的病症也是一種牽涉不想要的或不適當的補體活性的病 症，諸如血液透析關聯的血栓形成。此活性可以通過本領域中已知的方法測定。可以用依 照本發明的疫苗治療的病症以升高的C5a活性為特徵。
[0064] AMD是一種通常影響老年成人並且由於對視網膜的損害而導致視場中心（視網膜 中區）的視覺喪失的醫學狀況。它以"乾性"和"溼性"形式發生，而乾性形式佔到所有AMD 情況的90%。溼性和乾性AMD的最早的臨床標誌之一是在與視網膜色素上皮接近的區域中 細胞外積累的無定形脂蛋白性沉積物的出現。這些病原性組分稱作Drusen。最近的研究已 經在Drusen(乾性AMD的標誌）的形成中暗示局部炎性和補體級聯的活化。這與顯示除了 其他分子外補體組分C5在這些Drusen內積累的其它研究一致。
[0065] 此外，已經顯示了除了VEGF(C5a參與VEGF的釋放）外，C5a在誘導脈絡膜新血管 化（其在AMD的溼性形式中發生）中發揮關鍵作用。最重要地，可以顯示針對C5a的中和 性抗體能夠在動物模型中停止疾病的進展。
[0066] 總之，在AMD的溼性和乾性形式中存在有補體介導的疾病的強烈支持，因此C5a似 乎是治療這兩種AMD形式的最佳靶物。
[0067] 提出了補體介導的炎症（其主要由C5a引起）在阿爾茨海默氏病的加速或進展中 發揮作用。阿爾茨海默症腦中的纖維狀AP斑塊引發長時間的補體激活，並且該疾病的許 多表現是由於C5a募集和激活的促進炎性事件的神經膠質。類似的事件可以也適用帕金森 氏症和亨廷頓氏病。此外，初步數據表明補體C5激活片段（C5a)在運動神經元病中的特定 病理作用，所述運動神經元病是一組造成進行性運動神經元死亡，最終導致癱瘓和死亡的 退行性疾病。
[0068] 在實驗性過敏性哮喘中，阻斷C5aR明顯減輕了氣道發炎和氣道高反應性。但是， 補體成分C5在哮喘中的作用仍然有爭議。C5曾被描述為能夠在實驗性過敏性哮喘中促進 或者對抗氣道高反應性，說明C5a在過敏性哮喘中可能有雙重作用。一種假設是C5aR信號 轉導在過敏原致敏過程中有保護免於肺過敏發展的作用，但在效應期期間增強發炎的肺環 境的過敏表型。因此C5aR阻斷對已建立哮喘的處置可以有治療上的益處。
[0069] C5a還在動脈粥樣硬化中發揮作用。C3a和C5a在人冠狀動脈斑塊中表達。此外， 最近已經顯示在晚期動脈粥樣硬化患者中C5a預示了心血管事件，升高的C5a血清水平與 股淺動脈氣囊血管成形術後再狹窄的形成有關。
[0070] 血管炎是血管的炎性過程，其組織病理學特徵在於血管壁的發炎或纖維蛋白樣壞 死。這種形式的血管炎的臨床範圍從紫癜到重度增殖性腎小球腎炎變化，並且提出了補體 系統關鍵地參與這些過程。例如，C5a在抗嗜中性粒細胞胞漿自身抗體（ANCA)相關性血管 炎這種相對不常見但可能會危及生命的系統性自身免疫疾病中發揮重要作用。ANCA誘導的 壞死性新月體性腎小球腎炎需要補體參與其發病機制。C5a和嗜中性粒細胞C5aR可能給ANCA介導的嗜中性粒細胞激活構成一個放大循環。C5aR可能提供了ANCA誘導的壞死性新 月體性腎小球腎炎的一個新的治療靶點。
[0071] 補體激活參與自身免疫性皮炎（包括大皰性類天皰瘡（BP)、尋常性銀屑病和慢性 蕁麻疹）的炎性改變的發病機制。在天皰瘡中，似乎是表皮中天皰瘡抗體引起的補體激活 造成了被稱為嗜酸細胞性海綿層水腫的特徵性炎性改變的發生。在銀屑病鱗屑中發現了高 水平C5a，表明該疾病中涉及到補體激活。銀屑病已知是T細胞介導的疾病，但是嗜中性粒 細胞和肥大細胞可能也參與了該病的發病機制。T細胞和嗜中性粒細胞受到C5a的化學吸 弓丨，因此C5a可以作為銀屑病治療的重要治療靶點。
[0072] 補體激活還對自身免疫炎性疾病類風溼性關節炎有作用。過敏毒素C5a似乎是補 體激活中造成類風溼性關節炎組織損傷的主要產物，雖然膜攻擊複合物的沉積以及C3b片 段的調理作用也是重要的。
[0073] 補體在系統性紅斑狼瘡（SLE)的發病機制中的作用仍然有爭議。一方面，補體 成分似乎介導自身抗體引發的組織損傷。另一方面，補體系統似乎具有保護性特性，因 為某些補體的遺傳性缺乏與增加的SLE風險相關。已知SLE患者往往患有低補體血症 (hypocomplementemia)。此外，證明了C5a/C5aR信號傳導通過調節血腦屏障的完整性在中 樞神經系統狼瘡的發病機制中扮演重要角色。突出顯示了C5a/C5aR阻斷有潛力成為SLE 的有前景的治療策略。
[0074] 似乎組織再灌注（R)，而不是局部缺血（I)激活了補體，造成炎症誘導的損傷。雖 然補體激活在I/R損傷中的確切參與情況還不清楚，多項實驗性研究表明補體與I/R損傷 的發病機制之間存在聯繫，並且已經提出補體抑制作為強力療法。例如，在鼠心肌I/R損傷 模型中，再灌注前30分鐘系統性C5抑制顯著保護小鼠免於心肌I/R損傷。
[0075] 在許多形式的急性肺損傷中證明了存在補體激活。C5a濃度在酸灌注誘發的急性 肺損傷中的支氣管肺泡灌洗液（BALF)中是增加的，並且C5a濃度在人移植肺中也是升高 的。C5a將嗜中性粒細胞吸引到肺中，並直接激活嗜中性粒細胞、巨噬細胞和內皮細胞。抗 C5a的保護性作用與BALF中TNF-a水平的劇烈下降，以及肺血管胞間粘附分子ICAM-1表 達的極大減少有關，表明C5a對於炎症網絡的建立、調節炎性介質的表達和調節粘附分子 的表達是至關重要的。
[0076] 急性肺損傷和急性呼吸窘迫症候群（ARDS)特徵在於肺泡內空間中存在富含纖維 蛋白的炎性滲出物以及嗜中性粒細胞廣泛遷移到肺泡內。對來自健康志願者的嗜中性粒細 胞中的TNF-a和C5a信號傳導進行的藥學阻斷能夠顯著消除這些否則正常的細胞的BALF 誘導的前凝血劑活性，造成同時喪失組織因子（TF)的表達。這些結果表明C5a和TNF-a 信號傳導對受到AFDS影響的肺泡中累積的嗜中性粒細胞中TF表達的誘導有作用。
[0077] 在敗血症的開始期間，炎性系統變得極度活躍，包括細胞和體液防禦機制兩者。已 經顯示人敗血症過程中的補體激活，特別是反映為C5a水平提高的補體激活，當與較不嚴 重的敗血症患者和存活者相比時，與明顯下降的存活率以及多器官衰竭相關聯。而且，對 C5a或C5aR的阻斷顯著改善齧齒動物中進行的實驗性敗血症期間的存活。因此，C5似乎是 敗血症發展的關鍵因素，對C5a/C5aR結合進行幹擾可能給有較高的形成敗血症的風險的 患者提供一種用於預防性處理的有力臨床方法。
[0078] 在心肺分流術和血透析中，當人血液與心肺機或者腎透析儀的人工表面發生接觸 時旁路補體途徑被激活，從而產生了C5a。C5a導致毛細血管通透性提高和水腫、支氣管收 縮、肺血管收縮、白細胞和血小板激活並滲濾到組織，特別是肺中。顯示了施用抗C5a單克 隆抗體降低心肺分流和心臟麻痺誘發的冠狀動脈內皮官能障礙。
[0079] 腫瘤驅動的補體激活可以提供腫瘤生長優勢。補體C5a在腫瘤微環境中的產生通 過抑制抗腫瘤CD8+T細胞介導的反應增強腫瘤生長。使用小鼠腫瘤生長模型揭示了C5aR的 缺乏或者阻斷與延遲的腫瘤生長有關。因此補體抑制被認為是抗癌療法中有效和有前景的 辦法。
[0080] 顯著增加的補體激活與不同病理性懷孕後果，即先兆子癇（preeclampsia)、反覆 性自然流產、宮內發育遲緩和抗磷脂症候群（APS)有關。患有先兆子癇的女性比正常懷孕 女性顯示升高的C5a血漿濃度。對於APS，抗磷脂抗體和補體激活（經由C3a、C5a和MAC) 可能合作引發局部的炎性過程，最終導致胎盤血栓、缺氧症和嗜中性粒細胞滲濾。組織因子 (TF)代表了抗磷脂抗體誘發的胎兒損傷中C5a和嗜中性粒細胞激活之間的連接。
[0081] 總之，肽誘導的抗C5a免疫反應提供了對C5a介導的（慢性炎性）疾病的有效 療法，所述疾病包括神經變性性疾病，比如阿爾茨海默症（參見例如FonSeca，M.I.等 (2009) ,JImmunol"TreatmentwithaC5aRAntagonistDecreasesPathologyand EnhancesBehavioralPerformanceinMurineModelsofAlzheimer'sDisease. " 和Klos,A等(2009),MolImmunol"Theroleoftheanaphylatoxinsinhealth anddisease."）、帕金森氏症（參見例如McGeer,P.L?等（2004),ParkinsonismRelat DisorcTInflammationandneurodegenerationinParkinson^disease. "）、亨廷頓氏病 (參見例如Singhrao,S.K?等（l"9),ExpNeurol"Increasedcomplementbiosynthesis bymicrogliaandcomplementactivationonneuronsinHuntington,sdisease.，'） 和年齡相關性黃斑變性（參見例如Nozaki，M.等（2006)，ProcNatlAcadSci"Drusen complementcomponentsC3aandC5apromotechoroidalneovascularization.，'）、 類風溼性關節炎（參見例如 〇kroj，M?等（2007)，AnnMed"Rheumatoidarthritisand thecomplementsystem. "）、系統性紅斑狼瘡（SLE)(參見例如Chen,M?等（2009)，J Autoimmun"complementsysteminsystemicautoimmunedisease.，'；Jacob,A.等 (2010) ,JNeuroimmunol"InhibitionofC5areceptoralleviatesexperimentalCNS lupus. "和Jacob,A,等（2010)，FASEBJ"C5aaltersblood-brainbarrierintegrityin experimentallupus."）、哮喘（參見例如Kohl,J?等（2006)，JClinInvest"Aregulatory rolefortheC5aanaphylatoxinintype2immunityinasthma. "）、血管炎、抗憐月旨綜 合徵（APS)、動脈粥樣硬化、炎性皮炎，比如銀屑病和慢性蕁麻疹、格巴二氏症候群、溶血尿 毒症症候群和多發性硬化症。因為失控的hC5a釋放也會促進其他病理狀況，比如局部缺血 和再灌注損傷、敗血症、急性肺損傷、與血液透析相關的併發症、癌症、懷孕併發症（比如先 兆子癇和APS)，通過主動免疫將C5a中和也可能給這些病理併發症提供有效的療法。
[0082] 如本文中使用的，"治療/處理"指提供處理，即對受試者提供任何類型的醫學或手 術管理。可以提供治療以反轉、減輕、抑制疾病，病症，或狀況的進展，阻止或降低疾病、病症 或狀況的可能性，或以反轉、減輕、抑制或阻止疾病、病症或狀況的進展，阻止或降低疾病、 病症或狀況的一種或多種症狀或表現的可能性。"預防"指在至少一些個體中使疾病、病症、 狀況、或其症狀或表現在至少一段時間不發生。治療可以包括在指示補體介導的狀況的一 種或多種症狀或表現形成後對受試者施用藥劑，例如以反轉、減輕、降低狀況的嚴重性，和/ 或抑制或阻止狀況的進展和/或以反轉、減輕、降低狀況的一種或多種症狀或表現的嚴重 性，和/或抑制狀況的一種或多種症狀或表現。可以對受試者施用本發明的組合物，所述受 試者已經形成補體介導的病症或者相對於一般群體的成員有增加的形成此類病症的風險。 可以預防性施用本發明的組合物，即在形成狀況的任何症狀或表現前。通常，在此情況下， 受試者會有形成狀況的風險。
[0083] 本發明的另一個方面涉及組成為由以下胺基酸序列組成的7至19個胺基酸殘基 的肽：
[0084] (X3)mKDX2QLGX1(SEQIDNo. 99),
[0085] 其中：
[0086] &是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，
[0087]X2是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、 甲硫氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，
[0088] &是（X4)nANISX5(SEQIDNo. 100)或由1至4個胺基酸殘基組成的其N端截短的 片段，
[0089] 乂4是VVASQLR(SEQIDNo. 101)或由1至6個胺基酸殘基組成的其N端截短的片 段，
[0090] x5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、精氨 酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，
[0091] m是 0 或 1，且
[0092] n是 0 或 1，
[0093] 其中所述至少一種肽與包含至少一種T細胞表位的載體偶聯或融合。
[0094] 依照本發明的一個優選的實施方案，\是選自下組的胺基酸殘基：蘇氨酸、穀氨醯 胺、酪氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、和纈氨酸。
[0095] 優選地，若m是1且X5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和蘇 氨酸，優選丙氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，和/或&是選自下組的胺基酸殘基：甲硫氨酸、丙氨 酸、賴氨酸和纈氨酸，則&是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、 賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸。
[0096] 依照本發明的一個特別優選的實施方案，m是1，且X5是選自下組的胺基酸殘基： 丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸，優選丙氨酸、蘇氨酸、或甲硫氨酸。
[0097] 依照本發明的另一個優選的實施方案，&是選自下組的胺基酸殘基：甲硫氨酸、丙 氨酸、賴氨酸和纈氨酸。
[0098] 依照本發明的一個特別優選的實施方案，肽選自下組：ISHKDMQLGA(SEQ IDNo. 14),ANISHKDMQLGA(SEQIDNo. 21) ,KDMQLGA(SEQIDNo. 22), VVASQLRANISHKDMQLGA(SEQIDNo. 23),ANISHKDMQLGT(SEQIDNo. 24),ANISHKDMQLGQ(SEQ IDNo.25),ANISHKDMQLGY(SEQIDNo.26),ANISHKDMQLGM(SEQIDNo.27), ANISHKDMQLGG(SEQIDNo. 28),ANISHKDMQLGV(SEQIDNo. 29),ANISHKDMQLGK(SEQID No. 30)，ANISHKDMQLGS(SEQIDNo. 31)，ANISHKDMQLGH(SEQIDNo. 32)，ANISHKDMQLGN(SEQ IDNo.33), ANISHKDMQLGL(SEQIDNo.34), ANISTKDMQLGA(SEQIDNo.70), ANISTKDMQLGQ(SEQIDNo. 71),ANISTKDMQLGS(SEQIDNo. 72),ANISTKDMQLGM(SEQID No. 73),ANISMKDMQLGN(SEQIDNo. 74),ANISTKDKQLGM(SEQIDNo. 75),ANISTKDMQLGH(SEQ IDNo.76), ANISAKDMQLGA(SEQIDNo.77), ANISMKDMQLGA(SEQIDNo.78), ANISTKDKQLGA(SEQIDNo. 79),ANISTKDAQLGA(SEQIDNo. 80),ANISMKDMQLGS(SEQID No. 81),ANISTKDVQLGA(SEQIDNo. 82),ANISTKDMQLGN(SEQIDNo. 83),ANISTKDMQLGK(SEQ IDNo.84), ANISMKDMQLGM(SEQIDNo.85), ANISTKDMQLGT(SEQIDNo.86), No.89)。
[0099] 本發明的另一個方面涉及包含至少一種肽的疫苗，所述肽組成為由以下胺基酸序 列組成的7至19個胺基酸殘基：
[0100] (X3)mKDX2QLGX1(SEQIDNo. 99),
[0101] 其中
[0102] &是選自下組的胺基酸殘基：精氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，最優選精氨酸，
[0103] x2是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、 蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，優選丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或亮氨酸，更優選纈氨酸，
[0104] &是（X4)nANISX5(SEQIDNo. 100)或由1至4個胺基酸殘基組成的其N端截短的 片段，
[0105] 乂4是VVASQLR(SEQIDNo. 101)或由1至6個胺基酸殘基組成的其N端截短的片 段，
[0106] x5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、精氨 酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，最優選組氨酸，
[0107] m是 0 或 1，且
[0108] n 是 0 或 1，
[0109] 其中所述至少一種肽與包含至少一種T細胞表位的載體偶聯或融合。
[0110] 本發明的又一個方面涉及包含至少一種肽的疫苗，所述肽組成為由以下胺基酸序 列組成的7至19個胺基酸殘基 ：
[0111] (X3)mKDX2QLGX1(SEQIDNo. 99),
[0112] 其中
[0113] &是選自下組的胺基酸殘基：精氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，最優選精氨酸，
[0114] X2是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、 甲硫氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸，優選甲硫氨酸，
[0115] &是（X4)nANISX5(SEQIDNo. 100)或由1至4個胺基酸殘基組成的其N端截短的 片段，
[0116] 乂4是VVASQLR(SEQIDNo. 101)或由1至6個胺基酸殘基組成的其N端截短的片 段，
[0117]X5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、精氨酸、異亮 氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，優選蘇氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、絲氨酸、賴氨酸 或天冬醯胺，更優選蘇氨酸或穀氨醯胺，
[0118] m是0或 1，且
[0119]n是 0 或 1，
[0120] 其中所述至少一種肽與包含至少一種T細胞表位的載體偶聯或融合。
[0121] 依照本發明的一個優選的實施方案，乂3是（X4)nANISX5(SEQIDNo. 100)或其N端 截短的片段，且乂1是精氨酸。因此，此N端截短的片段可以由ANISX5(SEQIDNo. 102)、 NISX5(SEQIDNo. 103)、15\、3\或乂5組成。這意味著若111=1，則本發明的疫苗可以 包含至少一種具有胺基酸序列ANISX5KDX2QLGR(SEQIDNo. 119)、NISX5KDX2QLGR(SEQID No. 120)、ISX5KDX2QLGR(SEQIDNo. 121)、SX5KDX2QLGR(SEQIDNo. 122)或X5KDX2QLGR(SEQ IDNo. 123)的肽。
[0122] 依照本發明的一個優選的實施方案，X4是VVASQLR(SEQIDNo. 101)或其N端截 短的片段。VVASQLR的片段可以由下列胺基酸序列之一組成：VASQLR(SEQIDNo. 109)、 八5〇1^(5￡〇10唚.110)、5〇1^(5￡〇10唚.111)、〇1^、1^、或1?。因此，若111和11是1，則本發 明的疫苗中使用的至少一種肽可以具有下列胺基酸序列之一：WASQLRANISX5KDX2QLGR(SEQ IDNo. 124) ,VASQLRANISX5KDX2QLGR(SEQIDNo. 125) ,ASQLRANISX5KDX2QLGR(SEQID No.126)、SQLRANISX5KDX2QLGR(SEQIDNo.127)、QLRANISX5KDX2QLGR(SEQIDNo.128)、 LRANISX5KDX2QLGR(SEQIDN〇.129)、*RANISX5KDX2QLGR(SEQIDN〇.130)。
[0123] 在本發明的一個特別優選的實施方案中，若X2是如上文限定的胺基酸殘基而非甲 硫氨酸，則SEQIDNo. 119至130的X5是組氨酸。
[0124] 在本發明的一個進一步優選的實施方案中，若X5是如上文限定的胺基酸殘基而非 組氨酸，則SEQIDNo. 119至130的X2是甲硫氨酸。
[0125] 依照本發明的一個具體的優選實施方案，肽選自下組：
[0126]ANISHKDVQLGR(SEQIDNo. 56),ANISHKDTQLGR(SEQIDNo. 57),ANISHKDYQLGR(SEQ IDNo.58),ANISHKDLQLGR(SEQIDNo.59),ANISHKDAQLGR(SEQIDNo. 18), ANISTKDMQLGR(SEQIDNo. 39),ANISQKDMQLGR(SEQIDNo. 40),ANISEKDMQLGR(SEQID No.41)，ANISSKDMQLGR(SEQIDNo.42)，ANISKKDMQLGR(SEQID 10唚.44)，優選選自下組：六見51?0￥〇11^(5￡〇10唚.56)，六見51'1(01〇11^(5￡〇10唚.39) 和ANISQKDMQLGR(SEQIDNo. 40)。
[0127]本發明的又一個方面涉及選自下組的肽：ANISHKDVQLGR(SEQIDNo. 56)， ANISHKDTQLGR(SEQIDNo.57),ANISHKDYQLGR(SEQIDNo. 58),ANISHKDLQLGR(SEQ IDNo.59),ANISHKDAQLGR(SEQIDNo. 18) ,ANISTKDMQLGR(SEQIDNo.39), ANISQKDMQLGR(SEQIDNo. 40),ANISEKDMQLGR(SEQIDNo. 41),ANISSKDMQLGR(SEQID No.42)，ANISKKDMQLGR(SEQIDNo.43)和ANISNKDMQLGR(SEQID唚.44)，優選選自下組： No. 40)。
[0128] 本發明通過以下圖和實施例進一步例示，然而並不受限於此。
[0129] 圖1顯示了hC5a的各種長度的C端片段（SEQIDN〇:l-4)的丙氨酸掃描（SEQID N〇:5-23)以限定可以在不消除免疫原性和誘導針對hC5a的抗體的能力的情況下交換的位 置。圖1(A)顯示了初始表位hC5a位置65-74(SEQIDNo:l)及其VARIOTOPES，（B)初始表 位hC5a位置 63-74(SEQIDNo:2)及其VARIOTOPES，（C)初始表位hC5a位置 68-74(SEQID No:3)及其VARIOTOPE，（D)初始表位hC5a位置 55-74(SEQIDNo:4)及其VARIOTOPE的免 疫原性（以滴度描繪）。
[0130] 圖2顯示了相對於初始表位序列（其描繪為100%(SEQIDNo:l-4))的用 乂八1?101'0?￡5 5￡〇10此:5-23接種疫苗的小鼠的免疫血清的抑制活性。圖2仏）顯示了由初 始表位hC5a位置65-74(SEQIDNo:l)及其VARI0T0PES，（B)初始表位hC5a位置63-74(SEQ IDNo:2)及其VARIOTOPES，（C)初始表位hC5a位置 68-74(SEQIDNo:3)及其VARI0T0PE， (D)初始表位hC5a位置55-74(SEQIDNo:4)及其VARIOTOPE誘導的免疫血清的抑制。
[0131] 圖3顯示了由hC5a的長12個胺基酸的C端片段（SEQIDNo:2)的VARI0T0PES 誘導的抗體的抑制活性的評估，其中hC5a的74位R用不同特徵的胺基酸殘基交換（SEQID No:21，24-38)。
[0132] 圖4顯示了由hC5a的長12個胺基酸的C端片段（SEQIDNo:2)的VARI0T0PES 誘導的抗體的抑制活性的評估，其中hC5a的67位H用不同特徵的胺基酸殘基交換（SEQID No:17,39-55)。
[0133] 圖5顯示了由hC5a的長12個胺基酸的C端片段（SEQIDNo:2)的VARI0T0PES 誘導的抗體的抑制活性的評估，其中hC5a的67位H用不同特徵的胺基酸殘基交換（SEQID No:18,56-69)。
[0134] 圖6顯示了由hC5a的長12個胺基酸的C端片段（SEQIDNo:2)的VARI0T0PES 誘導的抗體的抑制活性，其中hC5a的74位R和67或70位的一個或兩個額外的胺基酸用 其他胺基酸殘基交換（SEQIDNo:70-98)。 實施例
[0135] 本發明的一個目的是開發針對過多的人C5a的中和性活性免疫應答以避免其在 慢性炎性疾病或急性病理學情況中的病理學活性。
[0136] 為了實現此目的，設計所謂的VARI0T0PES並將其用於免疫，以誘導針對人C5a分 子的C端新表位的抗體。在C5蛋白被C5轉化酶切割從而產生較小的過敏性片段C5a和 C5b(膜攻擊複合物的一部分）後，C5a上的此新表位變得易接近。VARI0T0PES是能夠通 過模仿靶定蛋白上的表位誘導針對感興趣蛋白質的體液免疫應答的免疫原性肽。因此， VARIOTOPE疫苗的優點是避免對自身抗原的自身耐受性並且降低由於使用自身抗原而普遍 的不想要的副作用的風險。
[0137] 將所有肽經由N端的半胱氨酸殘基與蛋白質載體匙孔蟲戚血藍蛋白（KLH)化學連 接，並與作為佐劑的明礬一起對小鼠施用。對自用hC5a的初始C端序列或VARI0T0PES免疫 的小鼠獲得的所有免疫血清分析其誘導針對hC5a的功能性活性抗體和抗體滴度的能力。
[0138] 材料和方法:
[0139] 小鼠的免疫
[0140] 使用BALB/c小鼠作為hC5a-VARI0T0PE免疫實驗的模型系統。用綴合有KLH的 VARIOTOPE疫苗（磷酸鹽緩衝液pH= 7. 4中200yl，皮下）激發6至8周齡的雌性BALB/ C小鼠，並以每二周的時間間隔加強免疫四次。使用鋁水凝膠作為佐劑。使用5至6隻小鼠 進行用相應VARIOTOPE疫苗的免疫。
[0141] 免疫原性測定法
[0142] 使用酶聯免疫吸附測定法（ELISA)對接種疫苗的小鼠的免疫血清分析其對注射 肽（數據未顯示）及對人C5a蛋白的抗體應答。抗體滴度以給出半最大結合的血清稀釋 (即0D_/2)確定，並且呈現每組的所有小鼠的均值滴度。
[0143] C5a抑制測定法
[0144] 使用人U937細胞通過葡糖醛酸糖苷酶酶釋放測定法評估肽或VARI0T0PE誘導的 針對hC5a的抗體的抑制活性。用環狀腺苷3' ： 5' -單磷酸分化U937細胞，並且在用人重 組C5a蛋白刺激後，0 -葡糖醛酸糖苷酶被釋放。此效果可以通過添加hC5a特異性抗體或 肽誘導的抗hC5a免疫血清阻斷。
[0145] 更為詳細地，將U937細胞用RPMI，10%FCS中的0. 5mM環狀腺苷3' ：5' -單磷酸 (cAMP)分化5天。在第5天，將細胞於37°C用細胞鬆弛素B(2.5iig/ml)預處理10分鐘。 對於每種方法，用總體積12〇111祖6-〇11緩衝液（2〇1111冊?￡3口11=7.4，1251111恥(：1，51111 KCl，0.5mM葡萄糖，ImMCaCl2，lmMMgCl2,0.25%BSA)中單獨的 10nMhC5a或 10nMhC5a加 上8%源自用不同肽或7八1?101'(^5彼〇10此：1-98，如表1和2中指示的）免疫的小鼠的 熱滅活血清（於56°C進行lh)刺激1. 8x105個經預處理的細胞。在於37°C溫育10分鐘 後，將細胞沉澱，將上清液轉移至96孔微量滴定板，並在總體積150ill中用0. 01MP-硝基 苯基-0 -D-葡糖苷酸（溶解於0. 1M乙酸鈉pH= 4. 0)以1:1稀釋。將微量滴定板在黑暗 中於37°C溫育lh。然後，通過添加0.4M甘氨酸緩衝液（pH= 10.0)停止反應。葡糖醛 酸糖苷酶將P-硝基苯基-0 -D-葡糖苷酸轉化成微黃色顏色，將該顏色於405nm測量。
[0146] 表1 :用作生成VARI0T0PES的模板的人C5aC端表位。
【權利要求】
1. 包含至少一種肽的疫苗，所述肽組成為由以下胺基酸序列組成的7至19個胺基酸殘 基： (X3)mKDX2QLGX1 (SEQ ID No. 99), 其中 &是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、 亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸， X2是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫 氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸， &是（X4)nANISX5(SEQ ID No. 100)或其由1至4個胺基酸殘基組成的N端截短的片段， ID No. 101)或其由1至6個胺基酸殘基組成的N端截短的片段， X5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、精氨酸、異 亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸， m是0或1，且 n是0或1， 其中所述至少一種肽與包含至少一種T細胞表位的載體偶聯或融合。
2. 根據權利要求1的疫苗，其中X i是選自下組的胺基酸殘基：蘇氨酸、穀氨醯胺、酪氨 酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、和纈氨酸。
3. 根據權利要求1的疫苗，其中若m是1且X 5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、組 氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸，優選丙氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，和/或X2是選自下組的胺基酸 殘基：甲硫氨酸、丙氨酸、賴氨酸和纈氨酸，則&是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、天冬醯 胺、穀氨醯胺、組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、和蘇氨酸。
4. 根據權利要求1或2的疫苗，其中m是1，且X 5是選自下組的胺基酸殘基：丙氨酸、 組氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸，優選丙氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸。
5. 根據權利要求1、2或4的疫苗，其中乂2是選自下組的胺基酸殘基：甲硫氨酸、丙氨 酸、賴氨酸和纈氨酸。
6. 根據權利要求1至5中任一項的疫苗，其中所述至少一種肽選自下組： ISHKDMQLGA(SEQ ID No. 14),ANISHKDMQLGA(SEQ ID No. 21),KDMQLGA(SEQ ID No. 22), VVASQLRANISHKDMQLGA(SEQ ID No. 23), ANISHKDMQLGT(SEQ ID No. 24), ANISHKDMQLGQ(SEQ ID No.25), ANISHKDMQLGY(SEQ ID No.26), ANISHKDMQLGM (SEQ ID No.27), ANISHKDMQLGG(SEQ ID No. 28), ANISHKDMQLGV(SEQ ID No. 29), ANISHKDMQLGK(SEQ ID No. 30)，ANISHKDMQLGS(SEQ ID No. 31)，ANISHKDMQLGH(SEQ ID No. 32)，ANISHKDMQLGN(SEQ ID No.33), ANISHKDMQLGL(SEQ ID No.34), ANISTKDMQLGA (SEQ ID No.70), ANISTKDMQLGQ(SEQ ID No. 71), ANISTKDMQLGS(SEQ ID No. 72), ANISTKDMQLGM(SEQ ID No. 73)，ANISMKDMQLGN(SEQ ID No. 74)，ANISTKDKQLGM(SEQ ID No. 75)，ANISTKDMQLGH(SEQ ID No.76), ANISAKDMQLGA(SEQ ID No.77), ANISMKDMQLGA (SEQ ID No.78), ANISTKDKQLGA(SEQ ID No. 79), ANISTKDAQLGA(SEQ ID No. 80), ANISMKDMQLGS(SEQ ID No. 81), ANISTKDVQLGA(SEQ ID No. 82), ANISTKDMQLGN(SEQ ID No. 83), ANISTKDMQLGK (SEQ ID No.84), ANISMKDMQLGM(SEQ ID No.85), ANISTKDMQLGT (SEQ ID No.86), ANISHKDKQLGK(SEQIDNo.87)，ANISMKDMQLGH(SEQIDNo.88)jPANISAKDAQLGA(SEQID No.89)。
7. 根據權利要求1至6中任一項的疫苗，其特徵在於所述至少一種肽在其N端包含與 其直接或經由間隔物序列結合的至少一個半胱氨酸殘基。
8. 根據權利要求1至7中任一項的疫苗，其特徵在於所述包含至少一種T細胞表位的 載體是蛋白質載體。
9. 根據權利要求8的疫苗，其特徵在於所述蛋白質載體選自下組：匙孔蟲戚血藍蛋白 (KLH)、CRM197、破傷風類毒素（TT)、蛋白D或白喉毒素（DT)。
10. 根據權利要求1至9中任一項的疫苗，其特徵在於所述化合物是與佐劑一起配製 的，優選吸附至明礬。
11. 根據權利要求1至10中任一項的疫苗，其在用於治療和/或預防補體介導的病症 的方法中使用。
12. 根據權利要求11的疫苗，其特徵在於所述補體介導的病症是炎性疾病，優選慢性 炎性疾病。
13. 根據權利要求12的疫苗，其特徵在於所述炎性疾病選自下組：年齡相關性黃 斑變性（age-related macular degeneration, AMD),神經變性性病症，優選阿爾茨海默 (Alzheimer)氏病，帕金森（Parkinson)氏病或亨丁頓（Huntington)氏病，哮喘，動脈 粥樣硬化（atherosclerosis)，血管炎（vasculitis),皮炎（dermatitis),優選銀屑病 (psoriasis)和蕁麻疫（urticaria)，溶血尿毒症候群（hemolytic uremic syndrome)，類風 溼性關節炎（rheumatoid arthritis)，格巴二氏症候群（Guillain-Barre syndrome)，多發 性硬化（multiple sclerosis)，抗磷脂症候群（antiphospholipid syndrome)，溶血尿毒綜 合徵，和系統性紅斑狼瘡（SLE)。
14. 根據權利要求11的疫苗，其特徵在於所述補體介導的病症選自下組：缺 血/再灌注損傷，急性肺損傷，急性呼吸窘迫症候群（acute respiratory distress syndrome),敗血症（sepsis),癌症，妊娠併發症（pregnancy complication)，諸如 先兆子癇（preeclampsia)，反覆性自然流產（recurrent spontaneous abortion)， 宮內生長遲緩（intra-uterine growth retardation)和血液透析關聯的血栓形成 (hemodialysis-associated thrombosis)〇
【文檔編號】A61K38/04GK104507966SQ201380035942
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2012年5月23日
【發明者】G.斯塔夫勒, C.蘭德林傑, F.馬特納 申請人:阿費裡斯股份公司