鹼基序列檢測方法
2023-06-27 00:37:26 2
專利名稱：鹼基序列檢測方法
技術領域：
本發明涉及鹼基序列檢測方法，更詳細地說，涉及SNPs(single nucleotidepolymorphisms)、甲基化胞嘧啶等對單鹼基的變異和變化的檢測方法、以及利用此方法的基因的診斷方法。
背景技術：
人類基因組的解析已經結束，基因組信息在各個領域得到應用的時代已經來臨。人的個體性和對藥品的敏感性在基因水平上的闡明正不斷推進，其結果將被應用於診斷和治療之中。這其中尤其是基因組序列中的單核苷酸多態(SNPs)被認為起著重要的作用。SNPs的資料庫的構建正在進行，並開始應用於各種診斷。
對於SNPs的解析提出了以下多種方法DNA序列確定方法，在變異部分插入與該變異對應的螢光標記核酸後、用凝膠電泳進行檢測的方法，根據變異部分的有無使用具有活性作用的螢光探針的方法，或如DNA晶片等那樣區分探針是否和靶點穩定雜交的方法，以及利用階段性互補鏈合成來確定序列的方法等。這些方法中很多是為製作SNPs資料庫而開發的技術，裝置往往龐大且造價高。因此希望使用簡便、運行成本低廉的SNPs的檢測方法。
DNA鹼基序列的檢測方法大致可以分為利用螢光的方法和利用化學發光的方法等兩種方法。在使用螢光的方法中，由於光源是必需的，因而通常裝置龐大。另一方面，在使用化學發光的方法中，以往主要是採用螢光素酶反應對ATP進行檢測和對細菌進行檢測(檢測ATP)，但最近使用的是焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)，該技術利用化學發光來確定DNA鹼基序列。
在焦磷酸測序技術中，將DNA互補鏈合成時生成的焦磷酸變成ATP，進行以該ATP為底物的螢光素·螢光素酶反應，通過檢測產生的光來確定序列。即，按照順序向反應槽中注入核酸底物，進行DNA互補鏈的合成反應。如果觀察到光，說明互補鏈合成反應已經進行，則從注入的核酸底物可以確定被插入位點的鹼基。反應後，剩餘的底物迅速進行酶分解，使得在注入下一個核酸底物時在反應槽中幾乎不存在。由於發光量與互補鏈合成的量成比例，同時插入2個底物時能觀察到2倍的發光。
但是，人基因組DNA是來源於母親和父親的2個等位基因進行配對，DNA樣品有雜合樣品和純合樣品，其中雜合樣品具有針對特定位點的序列的2種不同的等位基因，而純合樣品具有相同的等位基因。焦磷酸測序技術的情況下，雜合樣品中得到的信號強度是純合樣品的一半，對於不同樣品，這種一半的信號強度有時會持續一會。但是，這種情況在正確了解以SNPs為首的序列信息方面存在困難。
另外，在DNA互補鏈合成時，通常使用4種鹼基dATP、dCTP、dGTP、dTTP進行互補鏈的合成，但由於發光底物dATP與ATP的結構相似，也可作為螢光素酶反應的反應底物。即，為進行互補鏈的合成而加入dATP時，會引發螢光素酶反應，即使不引起DNA互補鏈的合成，也能觀察到發光。與此相反，國際專利申請98/13523號(特表2001-501092號公報)公開了使用不會成為發光底物的dATP類似物dATPαS和ddATP類似物進行互補鏈合成的方法，但由於dATPαS價格高而存在運行成本高的問題。
而且，在使用ATP的螢光素酶反應中，發光的同時會生成焦磷酸作為反應產物，但焦磷酸再次轉換成ATP作為發光反應的底物。即，發光能一直持續。與此相反，國際專利申請98/28440號(特表2001-506864號公報)公開了為了在每次加入核酸底物時發光(信號)，使分解酶三磷酸腺苷雙磷酸酶共存於反應液中，從而迅速分解加入的dNTP和ATP。但是，由於三磷酸腺苷雙磷酸酶的用量大時，會妨礙反應的進行，而用量小時，會發生由殘存的dNTP引起的反應，因而存在使用困難、價格高的問題。
此外，Science 1987，238，336-341報導了向反應槽中一起加入4種螢光標記終止劑，通過單核苷酸互補鏈的延伸檢測DNA變異的方法。但是，在此反應中，互補鏈延伸後，由於要分離插入的螢光標記終止劑產生的螢光和剩餘終止劑產生的螢光後進行檢測，所以必須利用凝膠電泳分離生成物再進行檢測。另外，Nucleic Acids Research，2000，Vol.28，Nol.12報導了4種終止劑同時加入反應槽中，進行單核苷酸延伸反應，再使用質量分析儀分析生成物的方法，但是，由於需要價格昂貴的裝置，因而缺乏廣泛應用性。
發明內容
本發明的課題在於解決以往技術中的問題，提供廉價而且重複性好、簡便的鹼基序列檢測方法，尤其是能在一個反應槽中檢測多個單核苷酸變異的鹼基序列檢測方法。
為克服上述課題，本發明提供以化學發光檢測方法為基礎的、廉價、重複性好、簡便的鹼基序列檢測方法。在以往的焦磷酸測序技術中，為了不影響後面的反應，用三磷酸腺苷雙磷酸酶分解加入的核酸底物，為降低背景發光，又必須使用dATPαS等高價樣品。在本發明的方法中，互補鏈合成反應以單個鹼基終止，通過使用不能進行1個鹼基以上的互補鏈延伸的擬核酸鹼基(ddNTP)，解決了這些問題。
即，使用無3』末端延伸能力的4種ddNTP作為互補鏈合成試劑，階段性進行互補鏈合成反應，再利用化學發光確定靶位點的鹼基序列。在本發明的方法中，由於插入的核酸鹼基無延伸能力，所以不必加入三磷酸腺苷雙磷酸酶等分解酶。以往認為ddATP與dATP產生同樣背景發光，因而一直迴避使用ddATP。但是，發明人已證實，ddATP與dATP不同，其作為螢光素酶反應的底物的活性低，因此不必使用價格高的dATPαS。而且，本發明中通過向試劑中加入微量PPase，降低背景化學發光，也能高靈敏度地進行鹼基序列的檢測。另外，通過使用多個引物，能在1個反應槽中檢測多個變異位點。
如果利用本發明，能利用化學發光簡便裝置檢測特定位點的鹼基序列和變異的有無。本發明中使用的核酸底物(ddNTP)沒有3』末端延伸能力，在插入到DNA鏈後，不能進行後面的互補鏈的合成，因而不必使用三磷酸腺苷雙磷酸酶等高價分解酶分解所加入的核酸底物。另外，由於ddNTP不會成為螢光素酶反應的底物，因而也不必使用dATPαS等高價試劑。在本發明的方法中使用的試劑(ddNTP和Ppase等)都是廉價的，又由於能在1個反應槽中同時檢測多個變異位點，所以與以往的檢查方法比較，成本和時間都得以降低。
圖1是表示對利用本發明的方法和焦磷酸測序技術法的階段反應的比較。
圖2是表示本發明方法(實施例1)中的反應式。
圖3是比較利用本發明得到的發光類型和焦磷酸測序技術中得到的發光類型。
圖4是比較以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作為底物時的螢光素酶反應引起的發光強度的曲線圖。
圖5是表示在本發明的方法中使用酶PPDK、並以AMP作為底物合成ATP的反應式。
圖6是表示3個SNPs的組合和觀察到的發光類型。
圖7是表示在3個SNPs的檢測中的發光類型的曲線圖。
圖8是表示按順序注入3種引物檢測多個SNPs的例子中的發光類型的曲線圖。
圖9是表示實施例2中除去三磷酸腺苷雙磷酸酶進行檢測的情況下(添加PPase 40mU/mL)得到的發光類型。
其中，101引物102來自父親的等位基因的一側DNA鏈103來自母親的等位基因的一側DNA鏈1021多態位點的鹼基(A)1031多態位點的鹼基(B)301添加ddCTP引起的發光強度的增加302添加ddTTP引起的發光強度的增加303添加dCTP引起的發光強度的增加304添加dTTP引起的發光強度的增加305-308向反應槽中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶時的發光強度的變化401ATP引起的發光402dATP引起的發光403dATPαS引起的發光404ddATP引起的發光405ddATPαS引起的發光
701加入ddATP時的發光強度(其他的3倍的強度)702加入ddCTP時的發光強度703加入ddGTP時的發光強度704加入ddCTP時的發光強度801用引物-2測定時加入ddATP時的發光802用引物-2測定時加入ddGTP時的發光803，804用引物-3測定時加入ddATP和ddGTP時的發光具體實施方式
本發明的方法是鹼基序列檢測方法，該方法包括以下工序向有核酸樣品的反應槽中加入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP等4種ddNTP或其衍生物中任一種進行互補鏈合成，使靶位點延伸一個鹼基的工序；使所得的焦磷酸生成ATP，並以此為反應底物進行化學發光反應的工序；以及利用所述化學發光判斷互補鏈合成的有無，確定所述靶位點的鹼基序列的工序。
4種ddNTP或其衍生物按順序每次一種加入反應槽中，通過只有注入與檢測對象位點互補的核酸鹼基才產生的發光，能夠確定靶位點的鹼基種類。ddNTP和其衍生物本身就是互補鏈合成的底物，但是由於其沒有3』末端延伸能力，因而所述互補鏈的合成只限於1個鹼基的延伸，所得化學發光通常是一個鹼基所對應的發光強度。另外，作為ddNTP的衍生物，例如，可以舉出ddATPαS等ddNTPαS。
以ATP作為反應底物的化學發光反應，可以採用螢光素·螢光素酶體系的酶發光反應。焦磷酸轉變成ATP可以利用以往的APS和ATP硫酸化酶反應體系，然而，如果使用不會成為螢光素反應的底物的AMP和丙酮酸磷酸二激酶反應體系，能避免背景發光的問題。
通過預先使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存於反應槽中，可以使螢光素酶反應中生成的焦磷酸和ATP馬上分解，因而，收集一定時間內(1分鐘)的發光，可以得到明顯的峰。作為分解焦磷酸和/或ATP的酶，可以使用焦磷酸酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，但優選廉價且活性高的焦磷酸酶。
本發明的方法能用於檢測包含單鹼基取代(SNPs)、癌變所伴隨的鹼基變異和甲基化(甲基化胞嘧啶等)、人為的鹼基取代等在內的所有單鹼基的變異和變化。可檢測的位點不只限於1個，只要滿足後述的一定條件，就能在1個反應槽中簡便地檢測2個或2個以上的靶位點。
檢測多個靶位點的情況下，準備與各位點對應的引物，使用其中2或3種引物，同時進行利用上述4種ddNTP及其衍生物的互補鏈合成和化學發光反應，由所得結果確定與上述2或3種引物對應的靶位點的鹼基序列。或者，利用1種引物，進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學發光反應，確定對應靶位點的鹼基序列後，再分解或除去添加到反應槽中的ddNTP及其衍生物，也可以按順序利用接下來的引物確定靶位點。另外，也可以反覆進行同時向反應槽中添加2種或2種以上引物同時檢測2個或2個以上靶位點的工序。作為分解除去ddNTP的方法，可以舉出上述酶解、和將核酸樣品固定在固相上後用反應液衝洗的方法。
本發明也提供用於上述鹼基序列檢測方法的試劑盒。該試劑盒中含有1)對應於鹼基AGTC的4種ddNTP或其衍生物2)DNA聚合酶3)螢光素和螢光素酶4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。
根據需要，試劑盒中還可進一步添加分解焦磷酸和/或ATP的酶。
下面利用實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於這些實施例。
實施例1圖1是比較利用本發明的方法的階段反應與焦磷酸測序技術的階段反應。個體的基因，是來源於父親和來源於母親的2個等位基因配對而成。本實施例中，以雜合樣品為例進行說明，該雜合樣品在某多態位點具有各一條A/G差異的2個等位基因。
圖1的102和103分別表示多態A(1021)和多態G(1031)2個等位基因的一側DNA鏈。使用通用的引物101，利用本發明的方法檢測單核苷酸多態的情形以A表示，利用以往的焦磷酸測序技術進行檢測的情形用B表示。發生互補鏈合成反應的情況下的發光強度與互補鏈合成時插入的鹼基數成比例。下面為了方便，將單鹼基所對應的發光強度作為「強度單位1(或1個單位)」進行說明。在本發明的方法中，由於使用ddNTP作為底物，因而延伸的鹼基數常常為1，所得的發光強度為強度單位1。另一方面，在焦磷酸測序技術中，由於使用dNTP作為底物，因而合成的鹼基的長度會因檢測對象多態位點的相鄰鹼基的種類和狀態而有所不同，會得到發光強度為1個單位、2個單位或3個或3個以上單位等各種值。
檢測的方案如下所述。首先擴增作為檢測對象的DNA，使之變成單鏈後加入到反應槽中。使設計的引物與該單鏈DNA雜交，所述引物與作為檢測對象的核酸鹼基之前的一個鹼基呈3』末端對應關係。即，設定為由引物引發的互補鏈合成，使得核酸底物插入到檢測對象位點。在本實施例中應該被插入到檢測對象位點的鹼基種類是T或C。通過加樣器(dispenser)按順序將4種核酸底物即擬核酸鹼基(終止劑)或核酸鹼基注入到反應槽中。注入的核酸底物的種類和順序，在本發明的方法的情況下是ddATP→ddCTP→ddGTP→ddTTP，在焦磷酸測序技術的情況下是dATPαS→dCTP→dGTP→dTTP。注入的核酸鹼基種類與檢測對象位點的鹼基互補的情況下，互補鏈合成反應繼續，注入的核酸鹼基結合到引物的3』末端。在本實施例中，焦磷酸測序技術中，因為需要而預先在反應液中加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶，因而注入的核酸底物在1分鐘內分解，但如後所述，該三磷酸腺苷雙磷酸酶產生的分解作用在本發明的方法中不一定需要。
最初注入的ddATP或dATPαS由於與檢測對象多態位點的鹼基不互補，因而互補鏈合成反應不發生。接下來如果注入ddCTP或dCTP，只在多態位點是G的等位基因的DNA鏈103處發生互補鏈合成反應，在本發明的方法和焦磷酸測序技術中都觀測到強度單位1的發光。同樣，接下來的ddGTP或dGTP由於與檢測對象多態位點的鹼基不互補，不引起互補鏈合成反應，觀察不到發光。接下來的ddTTP或dTTP的注入，在多態位點是A的等位基因的DNA鏈102處發生互補鏈合成反應，從而在本發明的方法中觀察到強度單位為1的發光。另一方面，在焦磷酸測序技術中，DNA鏈102的多態位點和其鄰位各插入了1個dTTP，同時另一個等位基因在DNA鏈103也插入了1個dTTP，合計觀察到3個鹼基對應的發光(強度單位為3)。圖2表示本發明方法中的一系列的反應式。另外，圖3示意性表示在本發明的方法(A)和焦磷酸測序技術(B)中觀察到的發光(信號強度)。
在本發明的方法中，由於只在變異位點插入與其數目相對應的核酸鹼基，因而，對於純合基因型的被檢驗者的DNA樣品，在一處觀察到2個單位的發光；對於雜合型DNA樣品，則在二處觀察到1個單位的發光。另一方面，在焦磷酸測序技術中，由於互補鏈合成持續發生，發光強度的表現方式變得複雜。
表1表示的是在本實施例中使用的反應液組成。在反應液中含有DNA聚合酶、ATP生成反應中使用的ATP硫酸化酶、APS、發光反應中使用的螢光素酶、螢光素。而且，在焦磷酸測序技術中由於有必要分解注入的核酸底物，所以反應液中添加有分解酶三磷酸腺苷雙磷酸酶。如後所述，由於試劑中常常含有雜質焦磷酸等，所以在本發明的方法中，在加入有擬核酸鹼基的試劑中預先了加入微量的焦磷酸酶(PPase)。
表1反應液組成
*Amersham Bioscience公司生產的循環測序用耐熱性DNA聚合酶。
若加入與模板DNA互補的核酸底物，則進行互補鏈的合成，能觀察到發光，但互補鏈的合成進行時，會產生副產物焦磷酸。焦磷酸在APS和ATP硫酸化酶的存在下，生成ATP，但APS本身也能成為螢光素酶反應的底物引起發光反應。在焦磷酸測序技術中為了進行任意階段的互補鏈延伸反應，有必要預先加入足夠的APS，致使背景發光變大。但是，本發明的方法中，由於不需要存在與焦磷酸測序技術同樣大量的APS，所以實質上觀察不到APS引起的背景發光。
ATP在螢光素酶的存在下，與螢光素反應發光，釋放出焦磷酸。由於焦磷酸再次與APS反應生成ATP，發光反應持續到螢光素消耗殆盡或APS用盡。但是，加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下，由於三磷酸腺苷雙磷酸酶也分解ATP，所以發光在1分鐘左右的較短時間停止。圖4表示這樣在三磷酸腺苷雙磷酸酶存在下觀察到的發光(信號強度)。在本實施例中，由於PPase的量少，因而如果發生互補鏈合成，信號強度急劇升高，隨著焦磷酸的緩慢分解，信號強度慢慢減弱(401)。接下來，注入下一個擬核酸鹼基，此鹼基被插入而引起互補鏈的合成時，由於信號強度再次急劇增加，因而能容易地檢測出。
如上所述，反應中使用的各種試劑中往往含有雜質焦磷酸(PPi)。焦磷酸在混合反應試劑時被轉變成ATP，引起發光反應，成為背景發光的原因。因而，在本實施例中，使微量的Ppase共存於加入有擬核酸鹼基的試劑中，從而分解了作為雜質的焦磷酸。PPase的加入量如果多，則由於在ATP→PPi→ATP循環反應中焦磷酸減少，發光反應會在短時間內停止。互補鏈合成時生成的焦磷酸轉變成ATP的過程也受到影響，發光(信號強度)也變小，但不妨礙測定。
另外，也可以使用三磷酸腺苷雙磷酸酶代替上述PPase。由於三磷酸腺苷雙磷酸酶分解ATP、dNTP、ddNTP等，因而如前所述，在分解ATP並在短時間內收集發光的同時分解加入的擬核酸鹼基(ddNTP)。但是，由於PPase的價格是三磷酸腺苷雙磷酸酶的一半左右，而且必需的使用量是三磷酸腺苷雙磷酸酶的1/10左右，所以使用PPase能使成本降低。
本實施例中，擬核酸鹼基使用終止劑ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。圖4表示分別以dATP、dATPαS、ddATP以及ddATPαS作為底物時的螢光素酶反應引起的發光強度(401ATP、402dATP、403dATPαS、404ddATP、405ddATPαS)。dATP作為螢光素酶反應的反應底物比dATPαS的活性高300倍左右，而ddATP只顯示了與dATPαS大致相同的低活性。由於ddATP的價格約是dATPαS的一半，而且反應必需的量是dATPαS的1/10左右，所以使用ddATP的本發明的方法與以往的方法比較，使檢測成本降低。
在本發明的方法中，由於只在核酸鹼基插入到引物的3』末端時，能觀察到1個單位的發光，所以所得數據(發光類型)簡單而且明了。通過只有注入與檢測對象位點互補的核酸鹼基種類時產生的發光，能夠簡單地判別靶SNPs。如上，如果利用本發明的方法，使用廉價的試劑ddATP和PPase能簡便地檢測單核苷酸多態(SNPs)。
實施例2在實施例1中，在焦磷酸轉變成ATP的反應中使用了ATP硫酸化酶，由焦磷酸和APS生成ATP。如上所述，APS作為螢光素酶發光底物的活性低，但是如果大量共存於反應槽中，由此引起的發光將不能忽視，往往使檢測靈敏度下降。所以，在本實施例中，使用不會成為螢光素酶反應的底物的AMP作為焦磷酸的反應底物，並使用丙酮酸磷酸二激酶(Pyruvate Phosphate DikinasePPDK)進行反應，針對該體系進行說明。圖5表示本實施例的反應概況。本實施例的方法除ATP生成反應以外，幾乎與實施例1相同，但是，由於設定了所使用的酶PPDK的適用條件，因而所用試劑和反應條件有所不同。表2表示本實施例中使用的反應液的組成。
表2反應液組成
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*Amersham Bioscience公司生產的循環測序用耐熱性DNA聚合酶。
在使用PPDK的反應體系中由於背景發光小，增加螢光素酶的量，能使發光量增加數倍。所以即使微量的樣品也能靈敏地測定。
檢測的方案如下所述。按順序向反應槽中加入4種ddNTP，進行互補鏈合成反應。只有注入與檢測對象位點的鹼基互補的擬核酸鹼基時，才進行互補鏈的合成，生成焦磷酸(PPi)。Ppi和AMP在PPDK的存在下反應生成ATP。ATP成為螢光素酶反應的底物，在發出螢光的同時，生成AMP和PPi。與實施例1相同，生成的PPi與AMP反應再次生成ATP。即使在本實施例中，由於利用PPase或三磷酸腺苷雙磷酸酶分解PPi，因而發光強度緩慢降低。檢測對象樣品的基因型有純合和雜合的兩種情形。純合的情況下，互補鏈合成所伴隨的發光強度的急劇增加只觀察到1次，但雜合的情況下，則觀察到2次。通過觀察這種發光強度的變化，能檢測到作為靶的檢測對象位點的變異。
圖9是表2的試劑中除去三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下的實施例。多態是A/G雜合的情形。已知道，只有注入與多態對應的鹼基的情況下，發光強度才急劇增加。使4種ddNTP或其衍生物按順序反應的情況下，純合時能觀察到1次發光強度的急劇增加，雜合時能觀察到2次。在本實施例中由於不加入三磷酸腺苷雙磷酸酶，而加入40mU/mL PPase，因而延伸時生成的PPi被PPase分解，發光強度緩慢減弱。其減少量比加入三磷酸腺苷雙磷酸酶的情況下要緩慢。在本發明中，由於使用ddNTP和其衍生物，延伸鹼基數總保持每次1個鹼基，判斷簡便，如本實施例那樣，不加入試劑三磷酸腺苷雙磷酸酶也能判斷鹼基的不同。
實施例3本發明的方法能在1個反應容器中檢測多個單核苷酸多態(SNPs)。首先，作為第一個例子，對檢測對象SNPs是3個的情形進行說明。
SNPs幾乎都是由一般型(野生型)和其一個鹼基被其他3種鹼基中某一個特定取代而成的類型(變雜合)構成。即，可以說SNPs位點的變異通常有2種。因此，同時檢測3個多態的情況下，應確定的鹼基的個數一共為6個(2個×3種)。而且，由於自然界中可能存在的鹼基有A、C、G、T 4種，對於3個SNPs，如果不同時測定組合完全相同的SNPs，則6個可採用的鹼基的自由度一共為27。因此，完全確定3個SNPs的條件如下所示。
首先，為了使3個SNPs不成為完全相同的組合，有必要選擇檢測對象SNPs。另外，在3個SNPs的可採用鹼基，即6個鹼基中，有必要使4種鹼基ACGT中的任一個都至少存在1個。例如，有必要如(A/G、A/G、T/C)那樣，在3種SNPs中含有2個相同的「A/G」組合；如(A/G、A/C、G/C)那樣，在3種SNPs中不完全含有4種鹼基ACGT(此種情況下不含有「T」)。
關於檢測對象SNPs的組合的這些限定條件，由於單純通過與其對應的引物的組合就可設定，所以不失一般性。下面，以3種檢測對象SNPs(SNP-1、SNP-2、SNP-3)分別是(A/C、A/G、C/T)的情形為例，對本發明中多個SNPs的檢測方法進行具體說明。
首先，向檢測對象DNA中加入3種引物，配製反應液。然後如在實施例1和2中說明的那樣，按順序加入4種ddNTP，觀察發光強度。加入的鹼基不被插入的情況下發光強度為零，1個檢測對象位點被插入時發光強度為1。另外，加入的鹼基與基因型為純合的1個SNPs對應的情況下，或與基因型為雜合的2個SNPs對應的情況下，發光強度都為2。而且，加入ddATP以外的擬核酸鹼基時，在對應的SNPs等位基因為純合時，得到的發光強度為2，雜合時發光強度為1，但純合時，如果具有鹼基A的等位基因，則為零。這樣，通過比較對應於加入的鹼基的發光強度，能確定全部多態位點。
圖6表示3種檢測對象SNPs在各種組合時所觀察到的發光情況。發光強度合計都是6個單位。這18種組合的發光類型完全不同，由所得的發光類型能唯一確定多態位點。圖7是實際的測定例。這裡使用了具有(A/C)、(A/G)、(C/T)3個SNPs的樣品。在測定例中加入T、G和C時，發光強度為1個單位(702、703、704)，加入A時的發光強度為3個單位(701)，由此確定樣品的基因型是(AA、AG、CT)。這相當於圖6的案例13。
從圖6可知，只要滿足上述條件，利用本發明的方法對於任何SNPs都能唯一確定至3個。另外，對於檢測對象SNPs存在於1條DNA鏈上的情形和存在於不同DNA鏈上的情形，也同樣處理。
在本發明的方法中，ddNTP的注入是每次一種核酸鹼基，加入的ddNTP即使有殘留，也沒有妨礙測定。因此沒有必要加入試劑中預先含有的PPase以外的分解酶。為了觀察到呈尖峰狀的發光信號，在本實施例的反應液中加入了三磷酸腺苷雙磷酸酶，但不加進行測定當然也可以。
實施例4下面對多個SNPs的檢測例子進行說明。檢測多個SNPs的情形下，按順序在反應槽中加入多個引物，再向其中按順序加入4種擬核酸鹼基進行測定(圖8)。因此為了不使引物之間發生部分雜交而阻礙互補鏈合成反應，將反應溫度升至接近40℃(優選32℃～40℃)，並且加入的引物量儘量少。優選各引物的量與檢測對象DNA樣品等摩爾。
反應槽中不加入引物的情況下，在加入ddNTP時，不產生發光(圖8最上面的圖)。在多個SNPs位點的檢測中，為了不影響使用下一個引物的檢測，必須除去注入的ddNTP。ddNTP的除去方法有，如上述利用PPase和三磷酸腺苷雙磷酸酶等分解酶的分解法和用反應液衝洗的方法。
在使用第一個引物(primer-1)進行第一次測定中，只有加入ddATP時，才能觀察到發光(信號)(801)。這表示對應於加入的引物的位點是基因型(AA)的純合。在加入新的引物進行第二次測定時，由於當殘留有以前使用的ddNTP時不好，因而向反應槽中加入三磷酸腺苷雙磷酸酶進行分解。在進行利用接下來的引物的測定中，ddNTP只要是在加入相同鹼基的循環結束前，被分解即可，因而加入的三磷酸腺苷雙磷酸酶的量可以比焦磷酸測序技術少。
在使用第二個引物(primer-2)進行測定時，雖然能觀察到ddATP的若干發光(信號)，但由其強度認為，是在第一次的測定中插入未反應的位點引起的(802)。在此測定中，添加ddGTP時觀察到強發光(信號)。由此顯示對應於第二個引物的位點是基因型(GC)的純合。
在使用第三個引物(primer-3)進行測定中，注入ddATP和ddGTP時，得到幾乎相同強度的發光(信號)(803)。由此顯示對應於第三個引物的位點是基因型(AG)的雜合。
因此對於多個SNPs，通過按順序加入不同的引物進行測定能分別確定SNPs的基因型。在本實施例中，按順序每次加入1個引物，也可以3個一起加入。在此情況下，添加3～4個引物可以確定大於等於10處的SNPs。
產業上的可利用性本發明的檢測方法能有效地適用於特定位點的鹼基序列的檢測、尤其是對含有單核苷酸(SNPs)和甲基化的基因的變異的檢測。
權利要求
1.一種鹼基序列檢測方法，其特徵在於，具有在含有核酸樣品的反應槽中添加與鹼基AGTC相對應的4種ddNTP或其衍生物中的至少一種進行互補鏈的合成，使靶位點延伸一個鹼基的工序；以由所得的焦磷酸生成的ATP作為反應底物進行化學發光反應的工序；和利用上述化學發光判斷是否有互補鏈合成，確定上述靶位點的鹼基序列的工序。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，按順序每次向反應槽中加入一種上述4種ddNTP或其衍生物進行互補鏈的合成。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，使用丙酮酸磷酸二激酶和AMP由上述互補鏈合成中得到的焦磷酸生成ATP。
4.如權利要求1～3任一項所述的方法，其特徵在於，所述化學發光反應是螢光素酶引起的酶發光反應。
5.如權利要求1～4任一項所述的方法，其特徵在於，使分解焦磷酸和/或ATP的酶共存於上述反應槽中。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，利用所述的酶分解所述化學發光反應中生成的焦磷酸和/或ATP，在一定時間內收集發光。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，所述酶是焦磷酸酶和/或三磷酸腺苷雙磷酸酶。
8.一種鹼基序列的檢測方法，其是使用權利要求1～7任一項所述的方法檢測2個或2個以上靶位點的方法，其特徵在於，準備與各種所述靶位點對應的引物，針對其中的2種或3種引物，同時進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學發光反應，由其結果確定與上述2種或3種引物對應的靶位點的鹼基序列。
9.一種鹼基序列的檢測方法，其是使用權利要求1～7任一項所述的方法檢測2個或2個以上靶位點的方法，其特徵在於，準備與各種所述靶位點對應的引物，針對一種引物，進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學發光反應，確定對應的靶位點的鹼基序列後，分解或除去反應槽中添加的ddNTP或其衍生物，然後按順序利用接下來的引物確定靶位點。
10.一種鹼基序列的檢測方法，其是使用權利要求1～7任一項所述的方法檢測2個或2個以上靶位點的方法，其特徵在於，準備與各種所述靶位點對應的引物，同時向反應槽中添加2種或2種以上引物，進行利用上述4種ddNTP或其衍生物的互補鏈合成和化學發光反應，確定對應的靶位點的鹼基序列後，分解或除去反應槽中添加的ddNTP或其衍生物，然後按順序利用下一個或二個或二個以上引物確定靶位點。
11.如權利要求1～10任一項所述的方法，其特徵在於，所述靶位點是單鹼基發生了變異或變化的位點。
12.鹼基序列檢測用試劑盒，其包括下列1)～4)1)對應於鹼基AGTC的4種ddNTP或其衍生物2)DNA聚合酶3)螢光素和螢光素酶4)AMP和磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸磷酸二激酶、和/或APS和ATP硫酸化酶。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其進一步含有分解焦磷酸和/或ATP的酶。
全文摘要
本發明提供價格便宜、重複性好、並且簡便的鹼基序列檢測方法，尤其是能在1個反應槽中檢測多個變異位點。在含有核酸樣品的反應槽中，添加與鹼基AGTC相對應的4種ddNTP或其衍生物中的至少一種進行互補鏈的合成，使靶位點延伸一個鹼基，以由所得的焦磷酸生成的ATP作為反應底物進行化學發光反應，利用上述化學發光判斷是否有互補鏈合成，確定上述靶位點的鹼基序列。
文檔編號C12Q1/68GK1854308SQ20051009309
公開日2006年11月1日 申請日期2005年8月25日 優先權日2005年4月21日
發明者神原秀記, 周國華, 梶山智晴 申請人:株式會社日立製作所