一種用於女性盆底的生物複合補片及其製造方法
2023-06-15 02:04:46
專利名稱：一種用於女性盆底的生物複合補片及其製造方法
技術領域：
本發明涉及生物醫用材料領域，特別是涉及一種用於修復女性盆腔組織缺陷的補片。
背景技術：
女性盆底功能障礙性疾病是50歲以上中老年婦女的常見病、多發病，給中老年婦女的生活和健康造成嚴重的影響。目前的治療方法是用一些醫用聚丙烯類合成材料的網帶或片，通過外科手術進行盆底功能重建。相對生物材料，無機材料易引發嚴重的炎症反應。 臨床效果顯示，聚丙烯網片具有組織侵蝕性的缺點，其生物相容性差，易產生異物刺激的不適和組織侵蝕性、性交痛等，而且，單純聚丙烯網片較難和植入局部發生融合，再加上在體內老化變硬變脆、摩擦、位移、蝕穿等作用，常發生刺穿膀胱、陰道等不良併發症。為克服這些弊端曾有學者試用脫細胞屍體筋膜、自體筋膜、人造膠原材料來進行盆底功能重建。但這些材料均有各自特有缺陷難以克服，均處於試驗階段。而替代材料中，異種脫細胞基質材料最具有理想特性，其來源廣泛，強度良好，並含有生物活性因子，組織相容性優秀，是未來盆底理想的修復材料，唯一缺陷是自然降解性導致其遠期療效不穩定，現階段技術條件下，尚無法取代聚丙烯材料的地位。但可以將其用作聚丙烯的輔助材料，目的是提高生物相容性， 從而降低聚丙烯併發症。
發明內容
為了克服已有技術中上述缺陷，本發明提供了一種用於修復女性盆腔組織缺陷的補片，將異種脫細胞基質材料作為聚丙烯網片的輔助材料，以提高生物相容性、降低聚丙烯併發症，從而解決植入部位的炎症反應明顯的問題。同時，本發明還提供上述補片的製備方法。本發明的技術方案是一種用於女性盆底的生物複合補片，在聚丙烯網片的表面包裹有動物供體的膀胱脫細胞基質。其中，所述膀胱脫細胞基質優選接種有BMSCs。可選擇地，所述聚丙烯網片為長方形、正方形、圓形或異形體。進一步地，所述聚丙烯纖維的排列方向與膀胱脫細胞基質的纖維方向呈25-75 度，優選40-50度。進一步地，所述聚丙烯網片內置於兩片所述膀胱脫細胞基質之間，可吸收縫合線連接兩片所述膀胱脫細胞基質，將聚丙烯網片包裹於內。本發明還提供了一種用於女性盆底的生物複合補片的製備方法，包括如下步驟(1)製備膀胱脫細胞基質取動物供體的膀胱，去除黏膜層和漿膜層，獲得膀胱基質；對膀胱基質進行脫細胞處理以及凍幹處理；消毒後，低溫塑封保存；(2)取聚丙烯網片，將上述獲得的膀胱脫細胞基質包裹於所述聚丙烯網片的表面。
進一步地，所述步驟( 具體為將聚丙烯網片內置於兩片所述膀胱脫細胞基質之間，用可吸收縫合線將兩片所述膀胱脫細胞基質縫合，使得聚丙烯網片包裹於內。進一步地，所述的膀胱基質的脫細胞過程為採用脫細胞液和緩衝液對膀胱基質進行反覆浸泡和衝洗。優選地，所述脫細胞液為三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟的混合液。本發明的多功能生物補片的結構特點採用動物脫細胞膀胱材料(urinarybladder matrix,簡稱UBM)，經過特定工序，除掉動物膀胱的細胞成分，保留動物膀胱的脫細胞基質， 並含有細胞生長的各種生物成分，如血管生長因子，TGF-β，VFGF等，然後將聚丙烯網片包裹，構成「三明治」結構。本發明將生物材料和無機材料進行有效的結合，綜合二者的各自優勢，獲得了明顯優良的使用效果。其中，外層的膀胱基質能夠起到隔離聚丙烯網片和宿主組織的作用，能顯著提高生物相容性。同時，還能調節免疫反應向免疫適應性轉變，有效降低其免疫排異原性，柔軟性與人的組織相近，無異物刺激、蝕穿等弊端，植入後可誘導患者纖維組織長入，最後形成患者自身纖維組織的修復，可用於陰道前後壁膨出、子宮脫垂，張力性尿失禁等女性盆底功能障礙的手術治療。同時，本發明的生物複合補片經上述工藝處理可大大提高補片的穩定性。
圖1為本發明實施例的立體分解圖；圖2為本發明實施例的結構示意圖；圖3為本發明不同實驗組植入陰道黏膜下植入局部組織內⑶4細胞免疫組化檢測
結果；圖4為本發明不同實驗組植入陰道黏膜下植入局部組織內⑶8細胞免疫組化檢測
結果；圖5為本發明不同實驗組植入陰道黏膜下植入局部組織內CCR4細胞免疫組化檢測結果；圖6為本發明不同實驗組植入陰道黏膜下植入局部組織內CXCR3細胞免疫組化檢測結果。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的技術方案進行詳細說明。對於所屬技術領域的技術人員而言，從對本發明的詳細說明中，本發明的上述目的、特徵和優點將顯而易見。本發明提供一種用於女性盆底的生物複合補片，補片包括聚丙烯網片1和膀胱脫脫細胞基質2。其中，聚丙烯網片為市售產品，本發明不限制聚丙烯網片1的結構和形狀，也就是說，聚丙烯網片1可以採用長方形、正方形、圓形或其它異形體。在選取臨床應用的聚丙烯網片時，可以增加該網片的孔隙率，即將常規的2mm增加到4-5mm，以減少聚丙烯材料的密度，這種做法能進一步降低免疫反應強度。本發明使用的膀胱脫脫細胞基質2來自於動物供體，並經過脫細胞、殺菌處理，該動物供體包括但不限於豬、牛、羊，優選豬源性。SIS、 AP、UBM、ADM、CEM是五種最常用的豬脫細胞基質材料，均可以作為本發明的選擇，其中優選
4UBM，從相關特性檢測，包括吸水性、降解周期、抗菌性、細胞相容性、生物力學性能5個方面看，結果發現UBM具有最長的降解周期，最強的抗菌性、最高的吸水性、最好的生物力學性能、以及優秀的組織相容性，非常適合於盆底的特殊環境。如圖1、2所示，本實施例中，膀胱脫脫細胞基質2選自於豬的UBM(為表達清晰，以下出現的UBM 2均是膀胱脫細胞基質2)，UBM 2作為複合補片的生物隔離成分，將UBM 2和聚丙烯網片1兩種材料複合將上述聚丙烯網片1內置於兩片所述UBM 2之間，用可吸收縫合線(圖中未示)採用縫合方式連接兩片所述UBM 2，最終將聚丙烯網片1包裹在裡面，如圖2所示。縫合線可以是現有技術中所採用的任何一種醫用級可吸收縫合線，比如聚乙交酯-丙交酯材料製成的縫合線。如圖1所示，所述聚丙烯網片1採用長方形，其中的聚丙烯網片1的纖維11的排列方向與UBM 2的大體纖維21方向(圖中以虛線表示纖維方向)呈 40-50度，最好是45度。採用該結構的補片，聚丙烯纖維11起到「鋼筋」的支架作用，而UBM 2居於外面，不僅加強了 UBM 2的強度，而且不影響UBM 2的組織相容性，並且聚丙烯網片1 的纖維走向基本不會影響補片的順應性，能達到單純的UBM的順應性水平。上述的UBM 2取自於動物供體的膀胱，去除黏膜層和漿膜層後獲得膀胱基質 』然後對膀胱基質進行脫細胞處理以及凍幹處理；消毒後，採用低溫塑封保存。其中，脫細胞處理時，需要用脫細胞液和緩衝液對膀胱基質進行反覆浸泡和衝洗。本領域技術人員可以理解的是，該脫細胞液和緩衝液可以為任何一種適合的產品，優選的是脫細胞液採用三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟的混合液，混合重量比控制在80-120 1。作為優選的實施例，本發明還可以將幹細胞接種到生物材料上構建組織工程材料，即上述的UBM還可以按現有技術接種BMSCs (bone marrowmesenchymal stem cells骨髓間充質幹細胞)，體外培養一周。下面將要詳述的生物學評價，也會將其列為一個對照對象。下面給出UBM的一個具體製作方法，但不作為本發明的限制，作為本領域技術人員，還可採用現有技術中可行的其它方法。1、豬膀胱脫細胞基質的製備取封閉飼養豬(體重約200kg)死後半小時內的新鮮豬膀胱標本，在超淨臺下用機械方法除去黏膜層和漿膜層。2、脫細胞處理第一次處理取一乾淨IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g，加入約800ml去離子水，充分攪勻溶解，調PH值至8. 0。將溶液到入一乾淨 5000ml燒杯中，並將膀胱基質放入燒杯浸泡。將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時，過夜。第二次處理取一乾淨IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,加入約800ml去離子水，充分攪勻溶解，調PH值至8. 0，然後到入一乾淨 5000ml燒杯中，並將膀胱基質放入燒杯浸泡。將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時。第三次處理取一乾淨IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,加入約800ml去離子水，充分攪勻溶解，調PH值至8. 0，然後到入一乾淨 5000ml燒杯中，並將膀胱基質放入燒杯浸泡。將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時，過夜。第四次處理取一乾淨IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,加入約800ml去離子水，充分攪勻溶解，調PH值至8. 0，然後到入一乾淨5000ml燒杯中，並將膀胱基質放入燒杯浸泡。將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時。第五次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至 2000ml，並將溶液轉入5000ml燒杯。用適量磷酸鹽緩衝液洗滌膀胱基質後放入之前配置的溶液，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時，過夜。第六次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至 2000ml，並將溶液轉入5000ml燒杯，將膀胱基質放入燒杯浸泡，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時。第七次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至 2000ml，並將溶液轉入5000ml燒杯，將膀胱基質放入燒杯浸泡，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌，過夜。第八次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至 2000ml，並將溶液轉入5000ml燒杯，將膀胱基質放入燒杯浸泡，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時。第九次處理配置2000ml的DNA酶及RNA酶的雙酶消化溶液lmol/L的NaCl (含 DNase及RNA酶各40U/ml)，用適量的磷酸鹽緩衝液漂洗膀胱基質後，將膀胱基質放入雙酶消化液浸泡12小時，過夜。第十次處理配置2000ml的DNA酶及RNA酶的雙酶消化溶液，並將膀胱基質放入雙酶消化液浸泡12小時。第i^一次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至2000ml。用適量磷酸鹽緩衝液漂洗膀胱基質後放入之前配置的溶液，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時，過夜。第十二次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至2000ml後到入5000ml的燒杯中，將膀胱基質放入燒杯浸泡，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時。第十三次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至2000ml後到入5000ml的燒杯中，將膀胱基質放入燒杯浸泡，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時，過夜。第十四次處理取一乾淨500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分攪拌溶解，定容至2000ml後到入5000ml的燒杯中，將膀胱基質放入燒杯浸泡，將燒杯置於磁力攪拌器上攪拌12小時。第十五次處理配置2000ml的磷酸鹽緩衝液，並將膀胱基質放入漂洗12小時，過夜。第十六次處理配置2000ml的磷酸鹽緩衝液，並將膀胱基質放入漂洗12小時。第十七次處理配置2000ml的磷酸鹽緩衝液，並將膀胱基質放入漂洗12小時，過夜。
第十八次處理配置2000ml的磷酸鹽緩衝液，並將膀胱基質放入漂洗12小時。3、凍幹處理上述處理後的膀胱已經成為脫細胞UBM，取出後程序性降溫到-80攝氏度16小時。4、消毒處理C060 γ射線照射除菌，4°C保存備用。下面以動物為實驗對象進入植入試驗，對本發明獲得的複合補片材料作體內生物學反應評價。主要包括單純UBM、接種BMSCs的UBM、複合聚丙烯的UBM以及單純聚丙烯網片等四種不同材料作為盆底修復生物補片植入體內的生物反應性。一、實驗動物SD大鼠SPF級，200 士 10g，第三軍醫大學實驗動物中心提供。
.、主要試劑及材料
DMEM/A2培養基胎牛血清胰蛋白酶 EDTA
無水乙醇(分析純) 戊巴比妥鈉
兔抗大鼠CD8多克隆抗體(bs-0648R)
Gibco公司 Hyclone 公司 Sigma公司 Sigma公司
成都科龍化學試劑廠 Sigma公司
北京博奧森公司
北京博奧森公司北京博奧森公司北京博奧森公司北京博奧森麼Y司北京博奧森公司
兔抗大鼠CD4多克隆抗體(bs-0766R) 兔抗大鼠CCR4多克隆抗體(bs-1168R) 兔抗大鼠CXCR3多克隆抗體(bs-2209RR)
生物素標記山羊抗兔IgG
DAB染色試劑盒三、主要試劑配製1.0. 25%胰蛋白酶溶液胰蛋白酶0. 25g用D-HanlT s液IOOml溶解混勻，經0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌， 分裝成細1/瓶，_20°C保存備用。2. PBS 溶液成品PBS粉末，加ddH20 100ml、攪拌使之完全溶解，轉入2000ml容量瓶中，加 ddH20至刻度線，混勻，測量pH值為7. 5。分裝至500ml、100ml玻璃瓶中，高壓蒸汽消毒滅菌後，4°C冰箱保存備用。3.青黴素、鏈黴素雙抗培養基青黴素溶液的配製青黴素80萬單位加生理鹽水至80ml，依照公式計算其濃度為 10000U/ml,0. 22um微孔濾器過濾後分裝，-20°C儲存備用。使用時按的比例加入培養基中。鏈黴素溶液的配製取鏈黴素1. 0g，加無菌生理鹽水至100ml，則濃度為10000μ g/ml， 0. 22 μ m微孔濾器過濾後分裝，-20°c儲存備用。使用時按1 %的比例加入培養基中。4. DMEM-F12 全培養基DMEM_F12+10%胎牛血清+1%青/鏈黴素四、試驗方法(一 )植入補片1.實驗分為5組，每組12隻大鼠，分別植入UBM，接種BMSCs的UBM，複合聚丙烯網片的UBM(上述實施例獲得)，單純聚丙烯網片，假手術組。2.用手術剪剪開陰道黏膜，將UBM，接種BMSCs的UBM，複合聚丙烯網片的UBM，單純聚丙烯網片植入陰道黏膜下方，假手術組不植入任何材料，其餘操作程序相同；3.縫合創口，在創口上塗抹金黴素，防止感染。4.在手術後1，2，3，4周處死大鼠，每次3隻，觀察植入具備的大體變化，取植入組織及周圍組織，10%中性甲醛固定，進行組織學檢測和免疫組化檢測。( 二 )植入組織的組織學檢測和免疫組化檢測1.固定的組織進行石蠟切片和HE染色，同時製備白片進行免疫組化檢測；2.免疫組化檢測1)取白片於60°C恆溫箱中烘烤20分鐘；2)將組織切片置於二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯後在浸泡10分鐘；3)無水乙醇中浸泡五分鐘；4)95%乙醇中浸泡五分鐘；5) 75%乙醇中浸泡五分鐘；6)蒸餾水衝洗，置PBS浸泡5分鐘；7)用水浴鍋將0. OlM枸櫞酸鈉緩衝液(pH6. 0)加熱至95°C左右，放入組織切片加熱10-15分鐘，進行抗原修復；8)滴加3% H202,室溫孵育15min以阻斷內源性過氧化物酶；9) PBS衝洗，每次2分鐘，共3次；10)加10%山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘；11)傾去血清，滴加一抗，37°C孵育濁後，4°C溼盒過夜。12)取孵育過夜的切片，PBS衝洗，每次2分鐘，共3次；13)滴加生物素標記山羊抗兔IgG(l% BSA-PBS稀釋)，37°C孵育20分鐘；14) PBS衝洗，每次2分鐘，共3次；15)滴加辣根酶標記鏈黴卵白素(PBS稀釋)，37°C孵育20分鐘；16) PBS衝洗，每次2分鐘，共3次；17)用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，鏡下觀察顯色結果；18)自來水充分衝洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。五、試驗結果(一)大體觀察植入試驗1周後，可見單純植入的UBM顏色輕微淡黃，接種BMSCs的UBM顏色較單純的UBM顏色稍淺，而單純聚丙烯網片組有輕微感染現象，複合聚丙烯網片的UBM顏色較
8深，肉眼觀察效果較UBM和接種BMSCs的UBM要差，但明顯優於單純聚丙烯網片，假手術組沒有明顯異常，未見感染。植入後第2周，植入的UBM與1周前無顯著變化，接種BMSCs的 UBM與大鼠自身組織有融合現象，植入組織變輕微淡黃，單純聚丙烯網片組未與大鼠組織融合，界限清楚，複合聚丙烯網片的UBM變為輕微淡黃，聚丙烯網片與組織鑲嵌長在一起。植入後第3周，單純植入的UBM已無法在體內明顯分辯，植入部分有輕微淡黃變化，植入的UBM 大部分可能發生了降解，接種BMSCs的UBM也已無法辨別，單純聚丙烯網片的植入部分有結痂出現，複合聚丙烯的UBM補片未找到植入的UBM，可見聚丙烯網片融合於植入局部。第4 周的觀察結果與第3周無明顯差異。( 二 )植入部位的組織學變化單純UBM植入組植入一周後可見明顯的炎症反應，此後隨時間的延長，炎症反應逐漸減輕，但至第四周時，任有輕微的炎症反應。接種BMSCs的UBM植入一周後亦發生明顯的炎症反應，但其程度明顯低於單純UBM植入組，此後隨時間延長，炎症反應逐漸降低，至第四周時，植入局部的組織內僅有極少量的炎症細胞，其在植入後的各階段，炎症反應皆明顯低於單純UBM植入組。單純聚丙烯網片植入組具有較強的炎症反應，明顯高於其他各組， 且這種強烈的炎症反應伴隨於整個試驗觀察階段。複合聚丙烯網片的UBM植入組的炎症反應與單純UBM植入組類似，初期較為強烈，此後逐漸降低。假手術組未見明顯的炎症反應。(三)免疫組化檢測結果(1)⑶4免疫組化檢測結果單純UBM植入組植入第1周和第2周⑶4細胞比例分別為37. 1 士 9. 4 % 和27. 9士8. 1 %,此後其比例迅速下降，第3周和第4周比例分別為10. 6士5. 1 %和 8. 3士2. 9%。接種BMSCs的UBM植入後反應與單純UBM組類似，但⑶4細胞在植入後各階段均低於UBM組，其第1周至第4周植入局部組織的⑶4細胞比例分別為28. 5士4.7%， 18. 2士3. 5%,8. 3士3. 2%和5. 6士2. 4%。而單純聚丙烯網片組在植入後各階段的⑶4細胞比例均維持在一個較高的水平，其第1周至第4周植入局部組織的CD4細胞比例分別為 62. 9士 11. 7%，43. 5士8. 7%，39. 2士7. 4%和 38. 7士6. 9%。複合聚丙烯的 UBM 組植入後的反應趨勢與UBM組合接種BMSCs的UBM類似，但植入後各階段⑶4細胞比例均高於以上兩組，而顯著低於單純聚丙烯網片組，其第1周至第4周植入局部組織的⑶4細胞比例分別為46. 3士 10. 5%，32. 6士5. 4%，28. 9士4. 3%和 16. 4士3. 5%。對照組在各階段的 CD4 細胞比例均顯著低於其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的⑶4細胞比例分別為 5. 6士2. 3%，4. 8士2. 7%，6. 4士2. 9%和 5. 3士 1. 7%。參見圖 3。(2)⑶8免疫組化檢測結果單純UBM植入組植入第1周和第2周⑶8細胞比例分別為21. 6 士 3. 3 % 和21. 5士2. 7 %，此後其比例迅速下降，第3周和第4周比例分別為6. 2士2. 4 %和 5. 5士 2.8%。接種BMSCs的UBM植入後反應與單純UBM組類似，其第1周至第4周植入局部組織的 CD8 細胞比例分別為23. 4士3. 9%，21. 3士3. 5%，8. 1 士2. 7%和 7. 5士2. 7%。而單純聚丙烯網片組在植入後各階段的CD8細胞比例均維持在一個較高的水平，其第1周至第4周植入局部組織的CD8細胞比例分別為37. 3 士4. 6 %，34. 4士 3. 5 %，32. 6 士 2. 8 %和 30. 7士3. 6%。複合聚丙烯的UBM組植入後的反應趨勢與UBM組合接種BMSCs的UBM類似， 但植入後各階段CD8細胞比例均高於以上兩組，而顯著低於單純聚丙烯網片組，其第1周至第4周植入局部組織的CD8細胞比例分別為25. 7 士 2. 9 %，23. 4 士 3. 2 %，12. 6 士 2. 7 %和 10.4 士 3.6%。對照組在各階段的⑶8細胞比例均顯著低於其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的CD8細胞比例分別為6. 1 士2. 3%，5. 4士2. 8%，6. 8士 1. 9%和6. 3士 1. 2%。 參見圖4。(3) CCR4免疫組化檢測結果單純UBM植入組植入第1周CCR4細胞比例為12. 3士2. 1 %，第2周迅速增加至55. 5士5.6%，第3周和第4周發生回落，分別為13. 2士2. 2%和12. 3士3.7%。接種 BMSCs的UBM植入後反應趨勢與單純UBM組類似，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4 細胞比例分別為13. 4 士 2. 3%，62. 3 士 5. 3%，17. 9 士 2. 5% 和 15. 7 士 2. 3 %，除第一周外， 其與各周的比例均顯著高於UBM組。單純聚丙烯網片組在植入後各階段的CCR4細胞比例均維持在一個較低的水平，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4細胞比例分別為 6. 3士 1. 4%，8. 4士2. 3%，6. 2士2. 7%和7. 3士 1. 8%。複合聚丙烯的UBM組植入後的反應趨勢與UBM組合接種BMSCs的UBM類似，但植入後各階段CCR4細胞比例均低於以上兩組， 而顯著高於單純聚丙烯網片組，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4細胞比例分別為 9. 3士2. 7%, 24. 6士3. 5%,9. 6士2. 3%和8. 4士3. 1 %。對照組在各階段的CCR4細胞比例均顯著低於其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4細胞比例分別為2. 3士 1. 6%， 3. 8士2. 4%，1. 9士 1. 5%和 3. 2士 1. 2%。見圖 5。(4) CXCR3免疫組化檢測結果單純UBM植入組植入第1周0乂0 3細胞比例為23.8士4.6%，第2周回落至
16.6士3. 2%，第3周和第4周分別為9. 6士2. 4%和5. 3士2. 6%。接種BMSCs的UBM植入後反應趨勢與單純UBM組類似，其第1周至第4周植入局部組織的CXCR3細胞比例分別為 8. 9士2. 3%,7. 8士2. 1%,6. 3士2. 和3. 2士 1. 3%，各周的比例均顯著低於UBM組。單純聚丙烯網片組在植入後各階段的CXCR3細胞比例均維持在一個較高的水平，其第1周至第 4周植入局部組織的CXCR3細胞比例分別為43. 7 士 6. 4 %，38. 9 士 7. 3 %，26. 4 士 5. 4 %和
17.6 士6. 3%。複合聚丙烯的UBM組植入後的反應趨勢與UBM類似，但植入後各階段CXCR3 細胞比例均高於UBM組，而顯著低於單純聚丙烯網片組，其第1周至第4周植入局部組織的 CXCR3 細胞比例分別為32. 6士7. 3%，29. 3士5.7%，18. 6士4. 3%和 12. 1 士2. 5%。對照組在各階段的CXCR3細胞比例均顯著低於其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的CXCR3 細胞比例分別為4. 6士 1. 3%,5. 3士 1. 8%,4. 3士2. 和 4. 6士 1. 8%。見圖 6。上述的檢測結果表明不同的材料作為盆底修復補片，其與植入組織的融合程度各不相同。UBM和接種BMSCs的UBM至第三周時已不能從植入部位分辨出來，僅能在植入部位觀察到有微黃變化，可能是未降解的組織與體內組織發生融合所致。接種BMSCs的UBM 相對單純的UBM材料，其更易與植入部位的組織發生融合，其原因可能是接種有細胞的材料在植入初期相對未接種細胞的材料，材料內部具有較多的細胞，能表達更多的纖維連接蛋白等基質蛋白，因此更易於與植入局部組織發生融合。至試驗觀察期結束時，單純的聚丙烯材料仍無法和植入部位發生融合，而通過夾心方法將聚丙烯材料夾在UBM材料之間有助於聚丙烯材料與植入部位的組織發生融合，在植入後第二周時，就與植入部位的組織發生融合。植入材料與植入部位的有效融合，將有利於促進植入材料修復作用的發揮，因此複合聚丙烯網片的UBM，相對單純的UBM或聚丙烯材料，具有明顯的使用優勢。
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材料植入初期皆有一定的炎症反應，但UBM和接種BMSCs的UBM的炎症反應隨植入時間的延長而逐漸降低，但單純的聚丙烯材料，在整個植入周期均表現出強烈的炎症反應。複合聚丙烯的UBM的炎症反應與UBM反應趨勢移植，其炎症反應程度要顯著低於單純聚丙烯材料組，表明複合聚丙烯的UBM材料中UBM具有一定的炎症隔離作用。相對單純的 UBM，接種有BMSCs的UBM引發的炎症反應程度要低，原因可能是植入的幹細胞與不同的免疫細胞相互作用發生免疫調節，在部分程度上抑制了免疫排斥的發生。在材料植入體內的免疫排斥方面，接種BMSCs的UBM是本試驗評價的四種不同材料中具有較低免疫反應性材料，其次為單純的UBM，最差的為單純聚丙烯網片。通過對植入局部組織內的細胞免疫組化染色結果顯示，UBM組在植入初期CD4細胞比值較高，至第3周時才逐漸降低，接種BMSCs的UBM在植入初期儘管⑶4細胞比例有所升高，但顯著低於UBM 組，單純的聚丙烯網片組在整個植入期內均維持一個較高的⑶4比例，而複合聚丙烯網片的UBM植入後⑶4細胞比例趨勢與UBM類似，但在植入後各階段均顯著高於UBM組，且顯著低於單純居丙烯補片組。各組植入後⑶8細胞的趨勢與⑶4類似，但比值顯著低於⑶4細胞比值。結果顯示接種BMSCs的UBM和單純UBM組在第二周時CCR4細胞比值較高，而聚丙烯網片在植入後各階段的CCR4細胞比值均較低，複合聚丙烯網片的UBM介於二者之間，CXCR3 細胞比值在各組中與CCR4正好相反，表明UBM作為盆底修復補片具有移植適應的作用，並且可以利用UBM的這種特性改進聚丙烯網片的免疫排斥反應，同時利用幹細胞接種技術還可進一步誘導植入材料向免疫適應分化。總之，UBM作為盆底修復補片具有引發的炎症和免疫反應較小，且誘導免疫反應向免疫適應轉變，且UBM還可修飾聚丙烯網片，起到炎症隔離和免疫調節的作用，本發明中的複合聚丙烯網片的UBM是盆底修復材料的一種優秀選擇。值得注意的是，以上所述僅為本發明的較佳實施例，並非因此限定本發明的專利保護範圍，本發明還可以對上述各種零部件的構造進行材料和結構的改進，或者是採用技術等同物進行替換。故凡運用本發明的說明書及圖示內容所作的等效結構變化，或直接或間接運用於其他相關技術領域均同理皆包含於本發明所涵蓋的範圍內。
權利要求
1.一種用於女性盆底的生物複合補片，其特徵在於，在聚丙烯網片的表面包裹有動物供體的膀胱脫細胞基質。
2.根據權利要求1所述的補片，其特徵在於，所述膀胱脫細胞基質還接種有BMSCs。
3.根據權利要求1所述的補片，其特徵在於，所述聚丙烯網片為長方形、正方形、圓形或異形體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的補片，其特徵在於，所述聚丙烯纖維的排列方向與膀胱脫細胞基質的纖維方向呈25-75度。
5.根據權利要求4所述的補片，其特徵在於，所述聚丙烯網片的纖維的排列方向與膀胱脫細胞基質的纖維方向呈40-50度。
6.根據權利要求1所述的補片，其特徵在於，所述聚丙烯網片內置於兩片所述膀胱脫細胞基質之間，可吸收縫合線連接兩片所述膀胱脫細胞基質，將聚丙烯網片包裹於內。
7.一種用於女性盆底的生物複合補片的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)製備膀胱脫細胞基質取動物供體的膀胱，去除黏膜層和漿膜層，獲得膀胱基質；對膀胱基質進行脫細胞處理以及凍幹處理；消毒後，低溫塑封保存；(2)取聚丙烯網片，將上述獲得的膀胱脫細胞基質包裹於所述聚丙烯網片的表面。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述步驟(2)具體為將聚丙烯網片內置於兩片所述膀胱脫細胞基質之間，用可吸收縫合線將兩片所述膀胱脫細胞基質縫合， 使得聚丙烯網片包裹於內。
9.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述的膀胱基質的脫細胞過程為採用脫細胞液和緩衝液對膀胱基質進行反覆浸泡和衝洗。
10.根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，所述脫細胞液為三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺醯氟的混合液。
全文摘要
本發明涉及一種用於女性盆底的生物複合補片及其製造方法，該補片在聚丙烯網片的表面包裹有動物供體的膀胱脫細胞基質。對取自於動物供體的膀胱，需要進行脫細胞處理以及凍幹處理；消毒後，低溫塑封保存；然後將上述獲得的膀胱脫細胞基質包裹於所述聚丙烯網片的表面。本發明將生物材料和無機材料進行有效的結合，綜合二者的各自優勢，獲得了明顯優良的使用效果。其中，外層的膀胱基質能夠起到隔離聚丙烯網片和宿主組織的作用，能顯著提高生物相容性。補片被植入後，可誘導患者纖維組織長入，最後形成患者自身纖維組織的修復。
文檔編號A61L27/16GK102266585SQ201110203098
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者劉祿斌, 徐惠成, 梁志清, 王延洲 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院