新型血管活性腸肽類似物的製作方法

2023-06-15 12:40:41 4

專利名稱：：新型血管活性腸肽類似物的製作方法新型血管活性腸肽類似物首次從豬腸發現、分離和純化了血管活性腸肽(VIP)[US3，879,371]。該肽具有二十八(28)個胺基酸，並帶有對促胰液素和胰高血糖素廣泛的同源性。[Carlquist等，激素和代謝研究(Horm.Metab.Res.),14,28-29(1982)]。VIP的胺基酸序列如下His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gin-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQIDNO:1)已知VIP表現出遍及腸胃道和循環系統的廣泛範圍生物學活性。根據其與腸胃激素的相似性，發現VIP剌激胰腺和膽汁分泌、肝糖原水解、胰高血糖素和胰島素分泌，並活化胰腺碳酸氫鹽釋放。已知並從人、大鼠、小鼠、雞、魚和青蛙中克隆了兩種類型的VIP受體。目前將它們確定為VPAC1和VPAC2，並響應具有相似親和性的天然VIP。VPAC2受體mRNA存在於人呼吸道，包括氣管和支氣管上皮、腺細胞和免疫細胞、肺泡壁和巨噬細胞中。[Groneberg等，實驗室研究(Lab.Invest)81:749-755(2001)和Laburthe等，受體和通道(ReceptorsandChannels)8:137-153(2002)]。己通過免疫測定將含有VIP的神經細胞定位在內分泌和外分泌系統、腸和平滑肌的細胞內。發現VIP是神經效應子，其引起若干激素包括催乳激素、甲狀腺素、和胰島素和胰高血糖素的釋放。還發現VIP刺激由腎體內和體外釋放腎素。發現VIP存在於多種動物物種和人呼吸道中的神經和神經末梢中。VIP的心血管和支氣管肺效應是感興趣的，因為發現VIP是強血管擴張劑和強平滑肌弛緩劑，其作用於外周、肺部、和冠狀血管床。發現VIP具有對腦血管的血管擴張作用。體外研究證明外源應用於腦動脈的血管活性腸肽誘導血管舒張，這提示VIP作為可能的腦血管舒張遞質。據此，也顯示出VIP是強血管擴張劑。VIP可以對免疫系統具有調節作用，例如，VIP能夠調節淋巴細胞的增殖和轉移。已顯示出天然VIP抑制在LPS-刺激的巨噬細胞中生成IL-12,影響IFNY合成。VIP抑制在鼠科巨噬細胞中生成TGF-pi，並抑制在人單核細胞中經過NFkB生成IL-8。[Sun等，神經免疫性雜誌(J.Neuroimmunol.)107:88-99(2000)和Delgado和Ganea,生物化學和生物物理學研究專欄(Biochem.Biophys.Res.Commun.)302:275-283(2003)]。由於發現VIP鬆弛平滑肌，並且其通常存在於呼吸道組織中，如上所示，假設了VIP可能是內源的支氣管平滑肌鬆弛介質。顯示出來自在哮喘患者的組織，與來自正常患者的組織相比，不含免疫反應性VIP。這可能指示出與哮喘疾病相關的VIP或VIPergic神經纖維的缺乏。體外和體內檢驗顯示VIP鬆弛氣管平滑肌並保護以避免支氣管收縮劑諸如組胺和前列腺素F^。當靜脈內給藥時，發現VIP保護以避免支氣管收縮劑諸如組胺、前列腺素F2a、白三烯、血小板活化因子以及抗原-誘導的支氣管收縮。還發現VIP體外抑制人呼吸道組織中的粘液分泌。呼吸道病症具有多種原因，但是共有若干病理生理和臨床特徵。這些病症的特徵是由呼吸道阻塞、呼吸道壁變厚，炎症或間質組織彈性缺乏引起的氣流限制。共同-病狀可以包括粘液分泌過多、呼吸道超反應性、和氣體交換異常，這可以引起咳嗽、痰產生、喘息和呼吸困難。常見呼吸道病症包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支氣管炎、肺氣腫、和肺部高血壓。[Mayer等，呼吸生理學(RespirationPhysiol.)128:3-11(2001)]。COPD是一組由肺呼吸道阻塞定義的慢性病症。COPD包括兩種主要的呼吸疾病，即慢性(阻塞性)支氣管炎和肺氣腫。這兩種疾病均與呼吸困難和不呼吸相關。COPD可以伴隨著肺病高血壓。長期吸菸是COPD的主要風險因素。通常認為與COPD相關的呼吸道限制是不能逆轉的。慢性支氣管炎是累進的炎性疾病。與該疾病相關的是呼吸道中粘液產量的增多和細菌感染發生率的增高。該慢性炎性病症誘導支氣管壁的加厚，從而引起增加充血和呼吸困難。肺氣腫是通過利用擴大氣體空間和減小肺泡表面積而損傷肺組織的潛在COPD病理學。肺損傷是由弱化和破壞肺內的氣囊所引起的。肺組織的天然彈性也降低，從而導致過度伸展和破裂。可以損傷較小的支氣管管，這能夠導致它們破碎並阻塞氣流，從而引起呼吸不足。COPD，在其基本醫學意義中，通常伴隨著支氣管阻塞。因此，最常見的COPD症狀包括呼吸缺乏、慢性咳嗽、胸緊、更努力去呼吸、增多的粘液產量和頻繁清喉嚨。患者不能進行它們平常的日常活動。單獨形成慢性支氣管炎和肺氣腫是可能的，但是大多數患有COPD的人具有這些病症的組合。分解肺實質中結締組織，具體地彈性蛋白，導致許多呼吸道疾病中存在的彈性降低。己在肺氣腫和COPD中顯示出了彈性蛋白降解的證據。認為嗜中性彈性蛋白酶是造成彈性蛋白破壞的主要蛋白酶。[Bames等，歐洲呼吸作用雜誌(Eur.Respir.J.)22:672-688(2003)]。顯示出在COPD患者的肺中，嗜中性彈性蛋白酶的產量增多。[Higashimoto等，呼吸作用(Respiration)72:629-635(2005)]。由於令人感興趣的和潛在的VIP臨床有效生物學活性，所以該肽一直是若干報告的合成程序的目標，目的是增強該分子一種或多種性質。Takeyama等報告了在位置8處具有穀氨酸取代天冬氨酸的VIP類似物。發現該化合物沒有天然VIP有效。[化學和製藥學期刊(Chem,Pharm.Bull.)28:2265-2269(1980)]。Wendlberger等公開了製備在位置17處具有正亮氨酸取代甲硫氨酸的VIP類似物。[肽程序(PeptideProc.)第16界歐洲肽研i寸會(16thEur.Pept.Symp.),290-295(1980)]。發現該肽在從肝膜製品中轉移放射性碘標記的VIP的能力上與天然VIP均等。Watts和Wooton報告了一系列線性和環狀VIP片段，其包含6-12個來自天然序列的殘基。[EP184,309,EP325,044;US4,737,487,US4,866,039]。Turner等報告了片段VIP(10-28)是VIP的拮抗齊!J[肽(Peptides)7:849-854(1986)]。還報告了取代的類似物[4-Cl-D-Phe氣Leu口]-VIP與VIP受體結合，並對抗VIP的活性[Pandol等，胃腸和肝生理學(Gastrointest.LiverPhysiol.)13:G553-G557(1986)]。Gozes等報告了類似物[Lys',Pro2,Arg3,Arg4,Pro5,Tyr6]-VIP是VIP的競爭性抑制劑，從而與其在神經膠質細胞上的受體相結合。[內分泌學(Endocrinology)125:2945-2949(1989)]。Robberecht等報告了若干在天然VIPN-末端中具有D-殘基取代的VIP類似物。[肽(Peptides)9:339-3456(1988)]。全部這些類似物較不緊密地與VIP受體結合，並在c-AMP活化中顯示出比天然VIP低的活性。Tachibana和Ito報告了前體分子的若干VIP類似物。[在:月太化學(PeptideChem.)中，Shiba和Sakakibara(版本),保護研究基礎(Prot.Res.Foundation),1988,481-486,JP1083012,US4,822,774]。這些化合物顯示出是比VIP1-3倍更有效的支氣管擴張劑，並具有1-2倍更高的低血壓活性。Musso等還報告了若干VIP類似物在位置6-7、9-13、15-17、和19-28處具有取代。[生物化學(Biochem)27:8174-8181(1988);US4,835,252]。發現這些化合物在與VIP受體結合和生物學響應中與天然VIP等效或不如其有效。Bartfai等報告了一系列多重取代的[Leu17]-VIP類似物[WO89/05857]。Gourlet等報告了具有對VIP受體親和性的[Arg"]-VIP衍生物[BBA1314:267-273(1996)]。Onoue等報告了VIP的一系列精氨酸衍生物和平截體[Onoue等，生命科學(LifeSci.)74:1465-77(2004)和Ohmori等,調節肽(Regul.Pept.)123:201-207(2004)]。還報告了一系列聚-丙氨酸衍生物[Igarashi等，藥理學和實驗治療學雜誌(J.Pharm.Exper.Ther.)鄧:3:445-460(2002)和Igarashi等，製藥學和實驗治療學雜誌(J.Pharm.Exper.Ther.)315:370-81(2005)]。在US20050203009中，描述了具有選擇性VPAC1激動劑活性的VIP類似物。報告了VIP類似物和C-末端加入聚乙二醇的衍生物一直用於治療代謝病症，包括糖尿病[例如，WO2006042152]。識別了具有VPAC2激動劑活性的肽，其包括PACAP和VIP類似物[Gourlet等，肽(peptides)18:403-408;Xia等，藥理學和實驗治療學雜誌(J.Pharmacol.Exp.Ther.)281:629-633(1997)]。報告了VIP環狀類似物具有提高的穩定性和活性[Bolin等,生物多聚體(Biopolymers)37:57-66(1995)，US5,677，419]。在人中，當通過靜脈內灌輸對哮喘患者給藥時，VIP顯示出引起峰呼氣流速的增高，並保護以避免組胺-誘導的支氣管舒張。[Morice和Sever,肽(peptides)7:279-280(1986);Morice等，TheLancet,II1225-1227(1983)]。然而，通過該靜脈內灌輸VIP觀察到的肺部作用伴隨著心血管的副作用，最顯著地，血壓過低和心動過速，以及臉紅。當以不引起心血管作用的靜脈內劑量給藥時，VIP不改變特定的呼吸道電導率。[Palmer等，胸(Thorax)41:663-666(1986)]。將活性的缺乏解釋為是由於施用了低劑量和可能由於該化合物的快速降解。當通過氣霧劑向人給藥時，天然VIP在保護以避免組胺-誘導的支氣管收縮中僅具有或多或少的效力。[AMeri等，藥理學家(Pharmacologist)25:123(1983)]。發現當通過吸入對人給藥時，VIP對基線呼吸道參數沒有顯著影響，但確實具有抗組胺-誘導的支氣管收縮的保護作用。[Barnes禾nDbcon,美國呼吸疾病綜述(Am.Rev.Respir.Dis.),130:162-166(1984)]。報告了當通過氣霧劑給藥時，VIP不表現出與支氣管舒張一起的心動過速或血壓過低作用。[Said等，在血管活性腸肽(VasoactiveIntestinalPeptide),所述]版本)中，Raven出版社(RavenPress),紐約，1928,185-191]。報告了VIP衍生物，即RO25-1553，在輕度哮喘病中，具有臨床前和臨床支氣管擴張劑的功效。[KallstromandWaldeck,歐洲製藥學雜誌(Eur.丄Pharm.)430:335-40(2001)和Linden等，胸(Thorax)58:217-21(2003)]。報告了天然VIP有效治療COPD、肺病高血壓和其他呼吸道病症[WO03061680,WO0243746和WO2005014030]。然而，存在對新型血管活性腸肽類似物的需要，所述新型血管活性腸肽類似物具有對VPAC2受體的選擇性，同時具有比現存VPAC激動劑同等或更好的潛力、藥物動力學性質和藥理學性質。優選地，存在對這樣的化合物的需要，所述化合物具有比先前可獲得的那些更長的活性持續時間。本發明包括式(I)的VPAC-2受體激動劑X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-R16-Me-R18-Ala-Lvs-Lvs21-Tvr-Leu-Asn-Asp25-Leu-R27-R28-Gly-Gly-Thr-Y[X匿(SEQIDNO:2)-Yj其中，X是組氨酸N-末端氨基的氫，其可以任選地被能水解的氨基保護基團,最優選地，被乙醯基替代，Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基，其可以任選地被能水解的羧基保護基團，最優選地，被NH2替代，下劃線標識的殘基表示片段內第一(Lys")和最後(Asp,胺基酸的側鏈與側鏈的共價連接，R2是Ser或Ala,R5是Thr,Ser,Asp,Gin,Pro或CaMeVal,R"是Gin,Ala，或Arg,R's是Ala,Lys或Glu，R27是Lys或Leu，除了當R5是CaMeVal且R16是Arg時，R27必須是Lys以外，R"是Lys或Asn,或其藥用鹽。本發明的化合物是VPAC2受體的活性激動劑，並具有提高的針對人嗜中性彈性蛋白酶的穩定性。因此，該化合物，作為具有針對人肺中存在的彈性蛋白酶作用的改良抗性的天然VIP選擇性穩定類似物，應該有效地治療呼吸道病症，包括COPD。按照通常的慣例書寫本文中提及的全部肽序列，由此N-末端胺基酸位於左側，且C-末端胺基酸位於右側，除非另外註明。兩個胺基酸殘基之間的短線表示肽鍵。下劃線標識的胺基酸片段表示該片段內第一和最後胺基酸的側鏈與側鏈的共價鍵。典型地，其為醯胺鍵。當胺基酸具有同分異構形式時，代表的是胺基酸的L形式，除非另外特別指出。為了方便地描述本發明，使用了多種胺基酸的常規和非常規縮寫。這些縮寫是本領域技術人員所熟悉的，但是為了清楚，如下列出Asp:D-天冬氨酸；Ala二A二丙氨酸；Arg二I^精氨酸；Asr^N:天冬醯胺；GlyK^甘氨酸；Gli^E二穀氨酸；Gln-(^穀氨醯胺；His^H^組氨酸；化=1=異亮氨酸；Lei^I^亮氨酸；Lys:K^賴氨酸；Met二M二甲硫氨酸；MeVal=MeV=CaMeVal;Nle-正亮氨酸；Phe二F二苯丙氨酸；Pro:P,甫氨酸；Se產S-絲氨酸；ThFT:蘇氨酸；1^=\￥=色氨酸；Tyr^^酪氨酸；和Va卜V^領氨酸。關於術語"能水解的氨基保護基團"和"能水解的羧基保護基團"，按照本發明能夠使用任何能夠通過水解去除的常規保護基團。在下文中顯示所述基團的實例。優選的氨基保護基團是醯基，其式如下其中，《是低級烷基或滷代低級垸基。在這些保護基團中，其中X3是d-C3烷基或滷代-C,-C3烷基的那些是特別優選的。優選的羧基保護基團是低級垸基酯，NH2和低級烷基醯胺，其中CVC3垸基酯、NH2和C,-C3垸基醯胺是特別優選的。也為了方便，且本領域技術人員容易知道地，下列縮寫或符號用於代表本發明中使用的部分、試劑等Nle:正亮氨酸；CaMeVal:Qx-甲基-L-纈氨酸；MeVal:Ca-甲基-L-纈氨酸；CH2C12:二氯甲烷；Ac:乙醯基；Ac20:乙酐；AcOH:乙酸；ACN:乙腈；DMAc:二甲基乙醯胺；DMF:二甲基甲醯胺；DIPEA:N,N-二異丙基乙胺；TFA:三氟乙酸；HOBT:N-羥基苯並三唑;DIC:N,N，-二異丙基碳二亞胺；BOP:苯並三唑-l-基氧-三-(二甲基氨基)轔-六氟磷酸鹽；HBTU:2-(lH-苯並三唑-l-基H,l,3,3-四甲基尿鐵-六氟磷酸鹽；NMP:l-甲基-2-吡咯烷酮；MALDI-TOF:矩陣輔助雷射解吸附離子化-飛行時間；FAB-MS:快原子轟擊質譜法；ES-MS:電噴質譜法；RT:室溫o用於本文時，術語"烷基"意指支鏈或者直鏈的、環狀或無環的、飽和或不飽和的(例如，鏈烯基或炔基)的烴基，其可以是取代的或未取代。當是環狀的時候，烷基優選地是c3-c12,更優選地CrC1Q,更優選地C5-C7.當是無環的時候，烷基優選地是C,-d。，更優選地，CPC6,更優選地，甲基、乙基、丙基(正丙基或異丙基)、丁基(正丁基，異丁基或叔丁基)或戊基(包括正戊基和異戊基)，更優選地，甲基。用於本文時，術語"低級烷基"意指支鏈或者直鏈的、環狀或無環的、飽和或不飽和的(例如，鏈烯基或炔基)烴基，其中所述環狀低級垸基是C5、Q或C7,且其中所述無環低級垸基是d、C2、C3或Q，且優選地選自甲基、乙基、丙基(正丙基或異丙基)或丁基(正丁基，異丁基或叔丁基)。用於本文時，術語"醯基"意指任意取代的烷基、環烷基、雜環的、通過羰基鍵合的芳基或雜芳基，並包括諸如乙醯基、丙醯基、苯甲醯基、3-吡啶羰基、2-嗎啉代羰基、4-羥基-丁醯基、4-氟苯甲醯基、2-萘甲醯基、2-苯乙醯基、2-甲氧乙醯基等基團。用於本文時，術語"芳基"意指取代的或未取代的碳環芳香基團，諸如苯基或萘基，或取代的或未取代的雜芳香基團，其包含一個或多個，優選地一個，雜原子。垸基和芳基可以是取代的或未取代的。當是取代的時候，通常存在1-3個取代基，優選地l個取代基。取代可以包括含碳基團，諸如垸基、芳基、芳烷基(例如，取代的和未取代的苯基、取代的和未取代的苄基)；滷原子和含滷基團，諸如滷代烷基(例如，三氟甲基)；含氧基團，諸如醇(例如，羥基、羥垸基、芳基(羥基)烷基)，醚(例如，烷氧基，芳氧基，垸氧基-烷基，芳氧基垸基)，醛(例如甲醛)，酮(例如烷基羰基，烷基羰基垸基，芳基羰基，芳基烷基羰基，芳基羰基烷基)，酸(例如羧基，羧基烷基)，酸衍生物如酯(例如垸氧羰基，垸氧羰基烷基，烷基羰氧基，烷基羰氧基垸基)，醯胺(例如氨基羰基，單-或者二-垸基氨基羰基，氨基羰基垸基，單-或二-烷基氨基羰基垸基，芳基氨基羰基)，氨基甲酸酯(例如烷氧基羰基氨基，芳氧羰基氨基，氨基羰氧基，單-或二-烷基氨基羰氧基，芳基氨基羰氧基(arylminocarbonloxy))和脲(例如單-或二-烷基氨基羰基氨基或者芳基氨基羰基氨基)；含氮基團如胺(例如氨基，單-或二-垸基氨基，氨基垸基，單-或二-烷基氨基烷基)，疊氮化物，腈(例如氰基，氰基烷基)，硝基；含硫基團如硫醇、硫醚、亞碸和碸(例如烷硫基，烷基亞磺醯基，烷基磺醯基，垸基硫代垸基，烷基亞磺醯基烷基，垸基磺醯基垸基，芳硫基，芳基亞磺醯基，芳基磺醯基，芳硫基垸基，芳基亞磺醯基烷基，芳基磺醯基烷基)；和含有一個或多個，優選一個雜原子的雜環基團。用於本文時，術語"卣素"是指氟、氯、溴或碘，優選氟、氯或溴，並且更優選為氟或氯。"藥用鹽"指常規酸式加成鹽或鹼式加成鹽，其保持式I化合物的生物有效性和性質，並由合適的非毒性有機或無機酸或有機或無機鹼形成。樣品酸式加成鹽包括源自無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的那些；和源自有機酸，諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、富馬酸等的那些。樣品鹼式加成鹽包括源自銨、鉀、鈉、和氫氧化季銨的那些，諸如例如，四甲基11氫氧化銨。將藥物化合物(即，藥物)化學修飾為鹽是眾所周知的技術，其用於試圖改良涉及化合物物理或化學穩定性的性質，例如吸溼性、流動性或溶解性。見例如，Ansel等，製藥劑量形式和藥物遞送系統(PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems)(第6版，1995)在第196頁和第1456-1457頁。"藥用酯"指具有羧基的常規酯化式I化合物，所述酯保持式I化合物的生物有效性和性質，並在體內(生物體內)分裂為相應的活性羧酸。體內分裂(在該情形中是水解)為相應羧酸的酯基團實例是其中分裂的氫被低級垸基取代的那些，所述低級烷基任選地被雜環、環烷基，等取代。取代的低級烷基酯的實例是其中的低級垸基被吡咯烷、哌啶、嗎啉、N-甲基哌嗪，等取代的那些。體內分裂的基團可以是例如乙基、嗎啉代乙基、和二乙基氨基乙基。連同本發明，也認為-CONH2是酯，因為-NH2體內分裂，並被羥基替代，從而形成相應的羧酸。前藥設計(DesignofProdrugs),Bundgaard(版本)(Elsevier,1985)中可以獲得關於遞送藥物化合物的酯的實例和應用的其他信息。也見，Ansel等，製藥劑量開試和藥物遞送系統(PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems)(第6版，1995)在第108-109頁；Krogsgaard-Larsen等,藥物設計與開發教禾鬥書(TextbookofDrugDesignandDevelopment)(第2版，1996)在第152-191頁。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中X是組氨酸N-末端氨基的氫或其中所述氫被乙醯基替代。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中X是組氨酸N-末端氮基的氫。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基或其中所述羥基被NH2替代。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中W是Ser。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中W是Ala。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中RS是Thr、Ser或CocMeVal。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R5是Thr。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中RS是Ser。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中RS是CaMeVal。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R"是Gln或Arg。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R"是Gln。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R"是Arg。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R's是Ala。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R"是Lys。在另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R's是Glu。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R^是Lys。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中R"是Lys。在一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中X是組氨酸N-末端氨基的氫或所述氫被乙醯基替代，Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基或所述羥基被NH2替代，R2是Ser或Ala,R5是Thr、Ser或CaMeVal，R"是Gln或Arg,R's是Ala、Lys或Glu,R27是Lys或Leu，除了當R5是CaMeVal且R16是Arg時，R27必須是Lys以外,禾口R28是Lys。另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中X是組氨酸N-末端氨基的氫或所述氫被乙醯基替代，Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基或所述羥基被NH2替代，R2是Ser或Ala,R5是Thr,Ser或CaMeVal,R"是Gln或Arg,R"是Ala、Lys或Glu，R27是Lys或Leu，除了當R5是CaMeVal且R16是Arg時，R27必須是Lys以外,和R28是Lys。另一個實施方案中，本發明提供式I的化合物，其中X是組氨酸N-末端氨基的氫或所述氫被乙醯基替代，Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基或所述羥基被NH2替代，R2是Ser或Ala,R5是Ser或CaMeVal,R"是Gln,R's是Ala，R"是Lys或Leu,和R28是Lys。可以通過任何已知的形成胺基酸間肽鍵的常規程序，容易地合成本發明典型的化合物。所述常規程序包括，例如任何溶液相程序，其允許胺基酸或其具有其羧基和其他受保護反應基的殘基的游離a氨基與另一個胺基酸或其具有其氨基或其他受保護反應基的游離伯羧基(primarycarboxygroup)之間的縮合。所述合成本發明新型化合物的常規程序包括，例如，任何固相肽合成方法。在這樣的方法中，新型化合物的合成能夠通過按照固相方法的普遍原理將理想的胺基酸殘基逐個順序引入到生長肽鏈中而進行。所述方法公開在，例如Merrifield,美國化學界雜誌(J.Amer.Chem.Soc.)85:2149-2154(1963);Barany等，肽、分析、合成和生物學(ThePeptides,Analysis,SynthesisandBiology)，巻2，Gross禾HMeienhofer,(版本)科學出版社(AcademicPress)1-284(1980)中，將其引入本文作為參考。可以手工或利用自動化裝置進行肽合成。還可以利用微波-輔助的合成。通常肽化學合成是用合適保護基團保護多種胺基酸部分的反應性側鏈基團，這將保護在該位點不發生化學反應，直到最終去除保護基團。通常還常見的是保護胺基酸或片段上的a氨基，同時該實體在羧基上反應，隨後選擇性去除a氨基保護基團，從而容許在該位點處發生隨後的反應。雖然關於固相合成方法公開了具體保護基團，但是應該注意到，每種胺基酸能夠受到對溶液相合成中的各種胺基酸常規使用的保護基團的保護。a氨基可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自芳香尿烷-型保護基團、諸如烯丙氧基羰基、苄氧基羰基(Z)和取代的苄氧基羰基,諸如，對-氯苄氧基羰基、對-硝基苄基-氧羰基、對-溴苄氧基羰基、對-聯苯-異丙基氧基羰基、9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)和對-甲氧基苄氧基羰基(Moz);脂肪族尿烷-型保護基團，諸如叔-丁氧基羰基(Boc)、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧基羰基、和烯丙氧基羰基。在此，Fmoc對a氨基的保護是最優選的。胍基可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自硝基、對-甲苯磺醯基(Tos),(Z，)2，2，5,7,8-五甲基苯並二氫吡喃-6-磺醯基(Pmc);4-甲氧基-2,3,6,-三甲基苯磺醯基(Mtr)。Pmc和Mtr是對精氨酸(Arg)最優選的。s-氨基可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自2-氯-苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴-苄氧基羰基(2-Br-Z)-和Boc。Boc對(Lys)最優選。羥基(OH)可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自苄基(Bzl)、2，6二氯苄基(2,6-二Cl-Bzl)、和叔-丁基(t-Bu).tBu是對(Tyr),(Ser)和(Thr)最優選的。(3-和Y-醯胺基可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自4-甲基三苯甲基(Mtt)、2，4,6-三甲氧基苄基(Tmob)、4,4-二甲氧基二苯甲基(dityl)/二-(l甲氧基苯基)-甲基(Dod)和三苯甲基(Trt)。Trt是對(Asn)和(Gln)最優選的。吲哚基團可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自甲醯基(For),mesityl-2-磺醯基(Mts)和Boc。Boc是對(Trp)最優選的。(3-和Y-羧基可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自叔-丁基(tBu)、和2-苯基異丙基酯(2Pip)。tBu是對(Glu)最優選的，且2Pip是對(Asp)最優選的。咪唑基團可以受到合適保護基團的保護，所述合適保護基團選自苄基(Bzl)、Boc、和三苯甲基(Trt)。Trt是對(His)最優選的。所有的溶劑,即異丙醇(iPrOH)、二氯甲烷(CH2C12)、DMF和NMP購自Fisher、JTBaker或Burdick&Jackson，並在不另外蒸餾的條件下使用。TFA購自Halocarbon,Aldrich或Fluka，並在不進一步純化的條件下使用。DIC和DIPEA購自Fluka或Aldrich，並在不進一步純化的條件下使用。HOBT、二甲硫(DMS)和1,2-乙二硫醇(EDT)購自Aldrich、SigmaChemicalCo.或Anaspec，並在不進一步純化的條件下使用。受保護的胺基酸通常具有L構型且商購自Bachem、AdvancedChemTech、CEM或Neosystem。使用前，由薄層色譜法、NMR和熔點證實這些試劑的純度。二苯甲基胺樹脂(BHA)是獲自Bachem,Anaspec或AdvancedChemtech的苯乙烯一1%二乙烯基苯的共聚物(100-200或200-400網孔)。這些樹脂的總氮含量通常是0.3-1.2m叫/g。在LDC設備上進行高通量液相色譜法(HPLC)，所述LDC設備由ConstametricI和III泵、梯度主溶劑程序設計器和混合器(GradientMastersolventprogrammerandmixer)、和具有可變波長UV檢測器的光譜監測儀III組成。利用PursuitC,8柱(4.5x50mm)，反相進行分析HPLC。在Pursuit柱(50x250mm)上進行製備型HPLC分離。在優選的實施方案中，通過由Merrifield(美國化學界雜誌(J.Amer.Chem.Soc.)85:2149(1963))概括描述的方法，利用固相合成法製備肽，儘管如前所述地，能夠使用本領域中已知的其他等價化學合成法。固相合成法通過偶聯受保護的a-胺基酸和合適樹脂，起始自肽的C-末端。這樣的起始物能夠通過酯鍵將a-氨基-保護的胺基酸附著到對-苄氧基苄基醇(Wang)樹脂上，或由Fmoc-連接體，諸如對-((R,S)-cx-(l-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲醯胺基)-2，4-二甲氧基苄基)-苯氧基乙酸(Rink連接體)之間的醯胺鍵將(x-氨基-保護的胺基酸附著到二苯甲基胺(BHA)樹脂上。羥基甲基樹脂的製備在本領域中眾所周知。Fmoc-連接體-BHA樹脂支持體是可商購的，且通常，當理想的合成肽在C-末端具有未取代的醯胺時使用。典型地，利用胺基酸或模仿物的Fmoc保護形式，用l-5個胺基酸等價物和適合偶聯試劑將胺基酸或模仿物偶聯在Fmoc-連接體-BHA樹脂上。偶聯後，可以在真空下清洗和乾燥樹脂。將胺基酸加載到樹脂上可以由Fmoc-胺基酸樹脂等分試樣的胺基酸分析，或由UV分析確定Fmoc基團來確定。可以在二氯甲烷或DMF中，通過用乙酐和二異丙基乙基胺處理樹脂，而對任何未反應的胺基加帽。樹脂經歷若干重複循環，以順序加入胺基酸。在鹼性條件下去除a氨基Fmoc保護基團。為了該目的，可以使用DMF中的哌啶，哌嗪或嗎啉(20-40%v/v)。優選地，典型使用40。/。哌啶的DMF溶液。在去除(X氨基保護基團後，隨後保護的胺基酸以理想順序逐漸偶聯，以獲得中間產物，即受保護的肽-樹脂。用於在肽的固相合成中偶聯胺基酸的活化試劑是本領域眾所周知的。例如，對所述合成合適的試劑是BOP、溴-三-吡咯烷子基-轔六氟磷酸鹽(PyBroP)、HBTU和DIC。此處優選的是HBTU和DIC。可以使用由Barany和Merrifield(在肽(ThePeptides),巻2,Meienhofer(版本)，科學出版社(AcademicPress)，1979,第1-284頁)描述的其他活化試劑。可以將不同試劑，諸如HOBT、N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)和3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1,2,3-苯並三嗪(HOOBT)加入到該偶聯混合物中，從而最優化合成循環。在此優選的是HOBT。典型的合成循^^方案如下:方案1步驟試劑時間1DMF2x30秒220%哌啶/DMFl分鐘20%哌啶/DMF15分鐘4DMF2x30秒iPrOH2x30秒6DMF3x30秒7偶聯的60分鐘-18小時8DMF2x30秒9iPrOH1x30秒10DMF1x30秒11CH2C122x30秒稱量體積為10-20ml/g樹脂的所有清洗和偶聯溶劑。偶聯反應在合成全過程中由Kaiser茚三酮檢驗監測，從而確定完成的程度[Kaiser等，分析生物化學(Anal.Biochem.)34:595-598(1970)]。任何不完全的偶聯反應與新鮮配製的活化胺基酸再偶聯或如上所述通過用乙酐處理肽樹脂而被加帽。在真空中乾燥完整組裝的肽-樹脂若干小時。可以利用應用生物系統433A合成器(AppliedBiosystem433Asynthesizer)(FosterCity,CA)，進行肽合成。對樹脂取樣或非樹脂取樣，1741mL反應容器，使用FastMoc0.25mmole循環。用DMF中的2.1gNMP、2g0.45MHOBT/HBTU，和2MDIEA溶解Fmoc-胺基酸樹脂，然後將其移至反應容器中。基本FastMoc偶聯循環由模塊"BADEIFD"代表，其中每個字母代表一個模塊。例如B代表利用20%哌啶/NMP的Fmoc去保護和相關清洗和讀數30分鐘的模塊(UV監測或傳感性)；A代表在盒內用0.45MHBTU/HOBt和2.0MDIEA活化胺基酸並與N2泡混合的模塊；D代表在反應容器中NMP清洗樹脂的模塊；E代表將活化的胺基酸移至反應容器中從而偶聯的模塊；I代表10分鐘等待時期的模塊，其中渦旋攪拌反應容器或不攪拌反應容器；和F代表清潔盒、偶聯約10分鐘並排空反應容器的模塊。典型地，通過一次或多次添加模塊"I"來擴大偶聯。例如，通過進行程序"BADEIIADEIFD"來進行雙偶聯。還存在其他模塊，諸如c關於二氯甲垸清洗，和"C"關於用乙酐加帽。還可以通過，例如改變不同活動的時間，諸如轉移時間來改良各個模塊，從而改變轉移的溶劑或試劑的量。以上循環典型地用於偶聯一個胺基酸。然而，為了合成四肽，重複所述循環，並將其連在一起。例如，使用BADEIIADEIFD偶聯第一胺基酸，隨後使用BADEIIADEIFD偶聯第二胺基酸，隨後使用BADEIIADEIFD偶聯第三胺基酸，隨後使用BADEIIADEIFD偶聯第四胺基酸，隨後為了最後的去保護和清洗而進行BIDDcc。可以利用微波肽合成器，即Liberty(CEM公司(Corporation),Matthews,NC)進行肽合成。將該合成器程序設計為通過改良預加載的0.25mmol循環而雙偶聯和加帽。使用微波編輯器對微波功率方法進行編程，從而在Fmoc去保護、胺基酸偶聯和用乙酐加帽過程中使用。這種類型的微波控制容許創建這樣的方法，即將反應控制在一組溫度和進行一組時間段。Liberty自動地調節遞送到反應中的功率的量，從而將溫度保持在設置點。在循環編輯器中選擇胺基酸添加和最終去保護的默認循環，並在形成肽時對其進行自動的加載。利用Fmoc-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)，以0.25mmol規模進行合成。將樹脂加入到裝有10mLDMF的30mL反應容器中。利用DMF溶液中的20%哌啶進行Fmoc的去保護。對於每個胺基酸偶聯，將Fmoc保護的胺基酸溶於DMF中，以製成0.2M溶液，並將其加入到反應容器中。利用0.5MHOBT/HBTU和2MDIEA/NMP進行所有的偶聯反應。任何不完全的偶聯反應與新鮮配製的活化胺基酸再偶聯或通過用DMF中25%乙酐處理肽樹脂而被加帽。利用微波，在70。C，在50瓦功率和氮起泡條件下，進行各個去保護、偶聯和加帽反應300秒。對於每個胺基酸偶聯，使用了下列0.25mmol偶聯循環tableseeoriginaldocumentpage19為了合成在此出現的化合物，在流程圖1中顯示了優選的合成程序。流程圖1Fmoc-Rink-MBHA-樹脂1)哌啶/DMF2)Fmoc-AA(P)31/DIC,'BOP或HBTUFmoc-AA(P)31-Rink-MBHA-樹脂2重複以上步驟1和2Ac-AA(P)1-M(P)2-AA(P)3-AA(P)4-AA(P)5-AA(P)6-AA(P)7-AA(P)8-AA(P)g-AA(P)10-AA(P)"-AA(P)12"AA(P)13-AA(P)14-AA(P)15-AA(P"6-AA(P)17-AA(P)1B-M(P)19-AA(P)2。-AA(P)21-AA(P)22-AA(P)23-AA(P)24-AA(P—-AA(P)26-AA446046的(ES)十-LCMSm/e計算值為3561.06，實際值為3560.0。實施例6:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:8)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是MeVal,R16是Gln，R18是Ala,R27是Lys且R28是Lysformulaseeoriginaldocumentpage26通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg:0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成40mg(3.6%)白色無定形粉末。C161H260N46O46的(ES)十-LCMSm/e計算值為3577.10，實際值為3576.8。實施例7:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser陽Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:9)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser,R5是Ser,R16是Gln，R18是Glu,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成126mg(11.4%)白色無定形粉末。C腦H256N46049的@8)+丄0^8m/e計算值為3609.06，實際值為3609.2。實施例8:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:10)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser,R5是Ser,R16是Gin,R18是Ala,R27是Leu且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成77mg(7.3%)白色無定形粉末。Cl58H253N45047的(ES)屮-LCMSm/e計算值為3536.00，實際值為3534.95。實施例9:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Lvs-Ala-Lvs-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lvs-Gly-Gly-Thr-NH[Ac-(SEQIDNO:ll)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser，R5是Ser,R16是Gin,R18是Lys，R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成79mg(7.5%)白色無定形粉末。C161H261N47047的(ES)十-LCMSm/e計算值為3608.11，實際值為3607.6。實施例10:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:12)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser，R5是Ser,R16是Ala,R18是Glu，R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成65mg(6%)白色無定形粉末。對Cl58H253N45048的(ES)+丄CMSm/e計算值為3552.00，實際值為3551.2。實施例11:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr-NH7[Ac-(SEQIDNO:13)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是Ser,R16是Gln，R18是Ala,R27是Leu且R28是Asn通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成109mg(10.6%)白色無定形粉末。(21561124^45048的(ES)十-LCMSm/e計算值為3521.93，實際值為3520.5。實施例12-:製備Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-LYS-Lys-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-LYS-Gly-Gly-Thr-NH[Ac-(SEQIDNO:14)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ala,R5是Ser，R16是Gin,R18是Ala,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成20mg(1.8%)白色無定形粉末。C158H254N46046的@8)+丄0/[8m/e計算值為3535,02，實際值為3533.4。實施例13:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lys-TYr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH7[Ac-(SEQIDNO:15)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是腿2,R2是Ser,R5是Ser,R16是Arg,R18是Ala,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg:0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成60mg(5.3%)白色無定形粉末。C159H258N48046的@8)+丄0\^111/6計算值為3579.08，實際值為3577.8。實施例14:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:16)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是Ser,R16是Arg，R18是Ala,R27是Leu且R28是Asn通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成40mg(3.7%)白色無定形粉末。C,57H25,N47047的(ES)十-LCMSm/e計算值為3549.99，實際值為3549.2。實施例15:製備Ac陽His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe陽Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH[Ac-(SEQIDN0:17)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是Ser,R16是Arg,R18是Glu,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg，0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成36mg(3.6%)白色無定形粉末。C16lH260N48O48的(ES)十-LCMSm/e計算值為3637.11，實際值為3636.4。實施例16:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Lvs-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH[Ac-(SEQIDNO:18)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是Ser,R16是Arg,R18是Lys，R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg:0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成51mg(4.4%)白色無定形粉末。C162H265N49046的(ES)十-LCMSm/e計算值為3636.17，實際值為3634.8。實施例17:製備Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH[Ac-(SEQIDNO:19)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ala,R5是Ser,R16是Arg,R18是Glu,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成27mg(2.7%)白色無定形粉末。C161H260N4SO』(ES)+-LCMSm/e計算值為3621.11，實際值為3620.4。實施例18:製備Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Lvs-Ala-Lys-Lvs-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Glv-Gly-Thr-NH[Ac-(SEQIDNO:20)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ala,R5是Ser,R16是Arg，R18是Lys,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成53.5mg(4.6%)白色無定形粉末。Cl62H265N49045的(ES)十-LCMSm/e計算值為3620.17，實際值為3618.8。實施例19:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:21)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是Ser,R16是Arg,R18是Glu,R27是Leu且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成33mg(3.3%)白色無定形粉末。C161H259N47048的(ES)十-LCMSm/e計算值為3622.10，實際值為3620.8。實施例20:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-NlG-Ala—Ala-Lys—Ly^zIildLltA5IkA^2—Leu-Leu-Lys—Gly-Gly-Thr—NH2[Ac-(SEQIDNO:22)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ser,R5是MeVal,R16是Gln，R18是Ala,R27是Leu且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg:0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成55mg(5.2%)白色無定形粉末。C16lH259N45046的(ES)十-LCMSm/e計算值為3562.09，實際值為3561.09。實施例21:製備Ac-His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-GIu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH7[Ac-(SEQIDNO:23)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ala,R5是MeVal,R16是Gin,R18是Ala,R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg，0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成49mg(4.5%)白色無定形粉末。Cl6lH260N46O45的(ES)+-LCMSm/e計算值為3561.10，實際值為3560.0。實施例22:製備Ac-His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:24)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser,R5是MeVal,R16是Arg，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-Rink-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成13.8mg(1.2%)白色無定形粉末。C162H264N48045的(ES)+-LCMSm/e計算值為3605,16，實際值為3604.0。實施例23:製備Ac-His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly醫Gly-Thr-NH.[Ac-(SEQIDNO:25)-NH2],即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2,R2是Ala，R5是MeVal,R16是Gin,R18是Ala,R27是Leu且R28是Lys通過按照實施例1中的程序，對Fmoc-RinJc-連接體-BHA樹脂(450mg,0.25mmol)進行固相合成和純化，從而生成30.2mg(2.8%)白色無定形粉末。C16lH259N47045的(ES)+-LCMSm/e計算值為3546.09，實際值為3544.8。實施例24:超-TlcAMP激動劑測定表達VPAC2受體的人T-淋巴細胞系超-Tl獲自美國典型培養物保藏(ATCC,CRL-1942),並將其以0.2-2x106細胞/ml的密度，保持在處於37°CC02培養箱中的生長培養基中。該生長培養基是增補了25mMHEPES緩衝液禾口10%月臺牛血清(GeminiBioproducts)的RPMI1640(Invitrogen)。為了評估VPAC2激動劑化合物活性，在RT下，用生長培養基清洗對數生長期的細胞一次，並將其以150W生長培養基中4乂104細胞/孔的密度接種到96-孔板中。然後，將生長培養基中處於合適濃度的50pl待測試化合物加入到指定的孔中。在RT下5分鐘後，通過向每個孔中加入25pl裂解試劑1A(cAMPBiotrakEIA系統，Amersham生物科學(AmershamBiosciences),RPN225)，而裂解細胞。將該96-孔板在RT下伴隨著搖動保持10分鐘，並然後保存在4°C直到分析cAMP(2小時內)。利用cAMPBiotrak酶免疫測定(EIA)試劑盒，按照製造商的說明書(AmershamBiosciences,RPN225)，在100pi各種細胞溶解產物中確定環狀AMP水平。通過將7-濃度劑量響應數據擬合到由GraphPadPrism程序(GraphPad軟體公司(GraphPadSoftware,Inc.))提供的S性劑量-響應等式中，來估算各種VPAC2激動劑化合物的活性(EC5o值)。表1tableseeoriginaldocumentpage33實施例25:肽針對嗜中性彈性蛋白酶的穩定性利用反相高壓液相色譜(RPHPLC)電噴離子化質譜(ESIMS)確定肽類似物的蛋白水解穩定性。用人嗜中性彈性蛋白酶培育肽類似物，並在合適的時間點，通過ESIMS確定未消化的類似物的量。一個實驗中可以包括多種肽類似物，只要它們能夠通過HPLC保留時間和/或通過分子量區別開。在全部實驗中使用Ac-HisAc-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH7作為對照並作為參考標準。同時使用多種肽類似物以及參考標準容許補償多個實驗間酶蛋白水解保真度的變化。使用針對各種未消化的肽獲得的整合離子電流進行定量。為了計算半衰期，設定了第一-級動力學行為，並將所有的計算都針對參考標準的半衰期進行規格化。在水中配製濃度為2.5mg/mL的肽儲液。除非在使用中，將全部儲液保存在-20。C。為了確定製備的儲液中的相對肽含量，對等分試樣進行反相HPLC，並且將觀察到的UV吸光率與來自參考標準的相似等分試樣進行比較。相應地調節肽類似物的濃度。為了進行蛋白水解消化，將肽溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，至濃度為O.lmg/mL。將多至6種的不同肽類似物混合為一個50)iL反應體積中。將參考標準加入所有實驗中，作為參考和內部標準。加入來自彈性蛋白酶儲液中的彈性蛋白酶(人嗜中性，Calbiochem,Cat#324681)，直至濃度為1-2pg/mL。選擇了不同量的酶，以補償肽類似物蛋白水解穩定性的不同。先前，在水中配製濃度為1mg/mL的彈性蛋白酶儲液。將酶儲液的小等分試樣保存在-20。C，從而通過限制解凍和冷凍循環的次數，更好地維持酶活性。在HPLC系統(Agilent1100系列)的自動取樣器中的自動取樣器管中，在環境溫度下，進行消化。關於時間段，以70分鐘的間隔，向反相HPLC柱(Phenomenex,LunaC18,3|i，IOOA,150x2.00mm)上注射5iiL等分試樣。關於起始時間點，在即將添加蛋白水解酶之前注射等分試樣。由一個實驗能夠記錄總共8個時間點，包括起始點。在具有5%-30%有機相的50分鐘梯度的反相柱上分離肽。水相是水中的0.05。/。(v/v)三氟乙酸，且有機相是乙腈中的0.045%(v/v)三氟乙酸。分別在214和280nm處記錄吸光率。將全部柱流出物引入到電噴離子化質譜(ABI4000QTrapLC/MS/MS系統)的渦輪V源中。在包括全部非降解的肽類似物的三重帶電離子的質量範圍內，以Q3MS模式獲得質譜。進行了努力，以確保肽類似物能夠通過色譜保留時間或通過分子量的不同而被明顯區分開。由整合的總離子電流計算各種未消化的肽類似物的相對量。選擇了2.5Da的窗口，並使用製造商的軟體整合各個離子電流。通過設定第一-級動力學行為計算各種肽類似物的總半衰期，並相對參考標準的半衰期進行規格化。表2tableseeoriginaldocumentpage35實施例26:化合物對雄性C57BL/6小鼠中由LPS-誘導的肺炎的作用氣^^/L屍S:在氣霧劑暴露於脂多糖(LPS,在無菌鹽水中500嗎/ml)之前，用媒介物或藥物預處理C57bl/6小鼠15-30分鐘。所述氣霧劑由Pari超尖端噴射噴霧器(PariUltranebjetnebulizer)生成，其出口與容納動物的小透明塑料室[HxWxD,10.7x25.7x11cm(4x10x4.5英寸)]相連。24小時後進行支氣管小泡灌洗(BAL)，以確定細胞炎性的強度。如下所述，進行BAL程序。潷/^^H屍S:在鼻內施用脂多糖(在無菌鹽水中0.05-0.3mg/kg;總體積5025nl/鼻孔)之前，用媒介物或藥物預處理小鼠。通過利用25-50pieppendorff吸移管向鼻孔遞送劑量溶液小滴，進行鼻內給藥。在如上所述LPS攻擊後3-24小時進行BAL，從而確定細胞炎性的強度。支氣,V、泡蘑應LPS暴露後24小時，用戊巴比妥(80-100mg/kg,i.p.)、氯胺酮/xyzaline(80-120mg/kg/2-4mg/kg,i.p.)或尿垸(1.5-2.4g/kg，i.p.)麻醉動物；並且通過小中線頸部切口(15-20mm)，暴露氣管，並插入20-口徑管狀接合器。用2x1ml不含Ca十+和Mg十+的無菌Hanks平衡鹽溶液(HBSS)灌洗肺。30秒後，針對每隻動物，通過輕輕吸取，收集灌洗液，並匯聚。然後在2000rpm，5°C，離心樣品10分鐘。吸出上清液，並且在通過加入5mlHBSS恢復對剩餘細胞的同滲容摩之前，使用0.5ml蒸餾水30秒，以將紅血細胞從產生的沉澱中溶解出來。在2000rpm，5°C，再離心樣品10分鐘，並吸出上清液。將生成的沉澱重新混懸在lmlHBSS中。通過利用血細胞計或coulter計數器從細胞混懸液等分試樣，通過錐蟲藍(SigmaChemical,St.Louis,MO)排除，確定總細胞數量。對於不同的細胞i十數，在Cytospin(5分鐘,1300rpm;ShandonSouthernInstruments,Sewickley,PA)中離心細胞混懸液的等分試樣，並用改良的瑞氏染液(Hema3染液試劑盒,FisherScientific)固定和染色切片。在光學顯微鏡下，使用標準的形態學標準分類至少300個細胞。針對嗜中性粒細胞和總細胞，表3中的數據表述為BAL細胞X104/動物，或LPS誘導的BAL流體嗜中性響應的百分比抑制。,表3tableseeoriginaldocumentpage37實施例27:化合物對小鼠中由乙醯甲膽鹼-誘導的支氣管痙攣的作用利用來自BUXCO電子公司(BUXCOElectronics,Inc.)(Troy,NY)的全身體積描記器(WBP)，測量有意識、自由移動小鼠的呼吸功能。WBP室容許在測量呼吸功能時，動物在該室內自由移動。同時使用8個室，這樣同時可以測量8隻小鼠。每個WBP室與偏流量調節器相連，從而在測試過程中提供流暢恆定的新鮮氣流。安裝在每個室上的傳感器檢測動物呼吸時的壓力變化。由MAXII張力計前置放大器放大壓力信號，並通過由所述系統(BUXCO電子公司(BUXCOElectronics,Inc.))提供的BiosystemXA軟體對其進行分析。測試前，通過經由注射埠注射正好lml空氣，校準每個室中的壓力變化，並相應地調節計算機信號。將小鼠置於WBP室中，並在測試前容許其適應10分鐘。測試是通過容許動物自由移動和呼吸15分鐘並同時測量下列參數進行的潮汐體積(ml)、呼吸速率(呼吸/分鐘)、分鐘體積(潮汐體積乘以呼吸速率，ml/min)、吸氣時間(秒)、呼氣時間(秒)、峰吸氣流(ml/秒)、和峰呼氣流(ml/秒)。在軟體資料庫中捕獲關於以上列出的每個參數的原始數據，並每分鐘平均一次，從而給出總共15個數據點/參數。報告了這15個數據點的平均值。積聚體積(ml)是累計值(非平均的)，並且代表15分鐘測試時間段全部潮汐體積之和。定製方案，以包括在致痙藥攻擊之前，之中，和之後的測量，從而確定Penh。通過以約5-10分鐘間隔給藥霧化氣霧劑(30-60秒暴露)獲得具體致痙藥(即，乙醯甲膽鹼(MCh)、乙醯膽鹼、等)的劑量-響應作用。在致痙藥攻擊前，如上所述，通過氣霧劑，用媒介物(H2中的2%DMSO)或溶於4ml媒介物的藥物處理小鼠(balb/c)20分鐘。在攻擊後5、30和60分鐘時確定Penh。將數據表示為相對於媒介物的Penh百分比抑制。表4tableseeoriginaldocumentpage38權利要求1.式I的環狀血管活性腸肽類似物X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-R16-Nle-R18-Ala-Lys-Lys21-Tyr-Leu-Asn-Asp25-Leu-R27-R28-Gly-Gly-Thr-Y[X-(SEQIDNO2)-Y]其中X是組氨酸N-末端氨基的氫，其可以任選地被能水解的氨基保護基團，最優選地，被乙醯基替代，Y是蘇氨酸C-末端羧基的羥基，其可以任選地被能水解的羧基保護基團，最優選地，被NH2替代，下劃線標識的殘基表示片段內第一(Lys21)和最後(Asp25)胺基酸的側鏈與側鏈共價連接，R2是Ser或Ala，R5是Thr，Ser，Asp，Gln，Pro或CαMeVal，R16是Gln，Ala，或Arg，R18是Ala，Lys或Glu，R27是Lys或Leu，除了當R5是CαMeVal且R16是Arg時，R27必須是Lys以外，R28是Lys或Asn，或其藥用鹽。2.權利要求1的化合物，其中R5是Ser或CaMeVal。3.權利要求2的化合物，其中R"是Lys。4.選自由下列各項組成的組中之一的化合物His-Ser匈-Ala-Thr-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu:Lys-Lys-Glv-Glv-Thr(SEQIDNO:3)，His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQIDNQ:4),His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asi-Leu-Lys-Lys-Glv-Glv-Thr(SEQIDNO:8)，His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Lys-Ala-Lys-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lvs-Gly-Glv-Thr(SEQIDNO:11),His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lvs-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly匿Gly-Ttir(SEQIDNO:19),His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-T.ys-Gly-Gly-TVir(SEQIDNO:23),禾卩His-Ala-Asp-AIa-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr畫Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-TvT-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu.-T,y.s-Gly-niy-Tlir(SEQIDNO:25)，5.權利要求1的化合物，所述化合物是X-(SEQIDNO:8)-Y。6.藥物組合物，包括權利要求1的化合物和至少一種藥用載體或賦形劑。7.治療肺部阻塞性病症的方法，包括通過吸入有效量的組合物對患有所述病症的人給藥，所述組合物包括權利要求1的化合物和至少一種藥用載體或賦形劑。8.權利要求l的化合物在製備用於治療肺部阻塞性病症的藥物中的應用。9.製備權利要求1的化合物的方法。10.以上所述的發明。全文摘要例如，通過吸入給藥式[X-(SEQIDNO2)-Y]的VPAC-2受體激動劑而治療肺部阻塞性病症，例如，COPD。文檔編號C07K14/435GK101484468SQ200780025494公開日2009年7月15日申請日期2007年6月26日優先權日2006年7月6日發明者戴維·羅伯特·博林,漢斯彼得·米歇爾,瓦吉哈·卡恩申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司