一種廣譜β-內醯胺酶螢光底物及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-15 16:52:01

一種廣譜β-內醯胺酶螢光底物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種可供檢測個體中細菌耐藥性的螢光檢測方法中所用的廣譜β-內醯胺酶螢光底物，其結構如下所示：實驗結果表明，本發明提供的螢光底物C-2可準確的定性檢測出不同樣品中的抗頭孢菌素的細菌，可用於臨床或其他檢測領域製備相應的診斷試劑或診斷試劑盒，具有廣泛的應用空間和實用價值。
【專利說明】一種廣譜β_內醯胺酶螢光底物及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物合成領域，具體地說是涉及一種可用於檢測廣譜β內醯胺抗生素治療的細菌耐藥性的螢光底物及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]自從人類在上世紀20年代首次發現以青黴素為代表的β_內醯胺類抗生素以來，它們已經成為治療細菌感染的一線藥物，挽救了無數人的生命。同其它類別的抗生素相比，β -內醯胺類抗生素具有療效高，毒性低的特性。但是，細菌也在不斷的進化各種抗藥機制。目前，抗藥性細菌感染已經成為全球性的問題。特別是在中國，印度，已經其他一些國家，由於存在著濫用抗生素的現象，出現超級抗藥性細菌，從而導致無藥可治的可能性是不容忽視的。
[0003]細菌對抗β -內醯胺類抗生素的最主要機制是通過β -內醯胺酶實現的。它們可以有效的分解內醯胺類抗生素。為抵消這些酶的作用，在臨床上可以採取了兩種方法。第一，共同使用β_內醯胺類藥物和β_內醯胺酶抑制劑。一些處方藥利用這一策略，包括(氨苄青黴素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉維酸鉀)。第二是開發不被普通β_內醯胺酶降解的藥物，比如許多第三和第四代的廣譜頭孢菌素。然而，抗生素的發展和抗藥性細菌的出現是一個矛和盾的關係。目前，許多在臨床上檢測到的細菌已經具有了分解第三和第四代的頭孢菌素的能力。這主要是由廣譜內醯胺酶所造成的。
[0004]由於細菌耐藥性的發展與誤用/濫用抗生素是緊密相關的，為延長廣譜抗生素的有效使用期，在臨床上治療細菌感染應該儘可能的做到對症下藥，避免使用無必要的廣譜抗生素。為了實現這一目標，快速，靈敏，和準確診斷細菌菌株對各種內醯胺類藥物的藥敏程度是必須的步驟。
[0005]在西方發達國家，抗生素的使用受到嚴格控制。但在中國，印度，以及發展中國家，抗生素被大大濫用和誤用，其後果是抗藥性細菌的不斷出現。2009年在印度出現的新德裡金屬內醯胺酶，NDM-1，是一個典型的例子。這個蛋白質酶可以水解目前所有的β-內醯胺類抗生素。換句話說，含有NDM-1的細菌可以抵禦任何β-內醯胺類抗生素。同時，由於全球的交通便利，在一地得到的抗藥性細菌可以很容易的傳播到世界各地，從而造成大規模的微生物感染。
[0006]為儘可能的延緩抗藥性細菌的出現和延長現有抗生素的使用壽命，防止抗生素的濫用和誤用是一個有力的手段。這要求在臨床治療細菌感染過程中，能夠儘快確定細菌對不同抗生素的抗藥和敏感程度，以防止過分使用，或者無效使用抗生素。另外，在治療敗血症病人時，由於及早使用正確的抗生素和病人的生存率直接掛鈎，這也需要儘快確定細菌對不同抗生素的抗藥和敏感程度。
[0007]β -內醯胺類抗生素被廣泛應用在臨床和畜牧業中用來治療細菌感染。特別是第三四代頭孢菌素是一線抗生素藥物。但是，廣譜內醯胺酶的出現使得三四代頭孢菌素不再是治療細菌感染的萬能妙藥。在臨床上迫切需要一種快速的能夠確定細菌是否對三四代頭孢菌素具有抗藥性的分析方法。利用β-內醯胺酶的螢光底物來檢測β-內醯胺酶的存在是一個普遍的分析方法。事實上，目前許多現有的螢光β-內醯胺酶的底物可以做到高靈敏度和實時的對β-內醯胺酶進行檢測。然而，所以這些分子都不具有選擇性，即不可能區分普通和廣譜β-內醯胺酶。
[0008]由於含有普通內醯胺酶的細菌對第三四代廣譜頭孢菌素敏感，而含有廣譜β_內醯胺酶的細菌對第三四代廣譜頭孢菌素具有抗藥性。我們希望能夠有一種快捷的方法來區分這兩類細菌，從而可以儘快確定臨床細菌感染是否可以用第三四代廣譜頭孢菌素來治療。
[0009]目前，國內外用來檢測細菌抗藥性的方法可以分成3大類。
[0010]第一類是基於傳統的微生物培養技術，又可以分為液體培養基和固態培養基的方法。液體培養基方法可以準確測定一種抗生素的最低抑菌濃度。但是，當待測抗生素品種較多時，此方法工作量大，所以已經逐漸被固態培養基方法所取代。固態培養基方法又可以分為若干類，主要有紙片擴散法，E-test，等等。比如，在紙片擴散中，不同的抗生素藥片被放置在固態培養基表面。當細菌在培養基表面生長時，如果對某種抗生素敏感，這在此藥片周圍形成一個清晰的環狀無菌帶。其大小受細菌對抗生素的敏感程度所決定。如果細菌對此抗生素有抗藥性，這不會形成此無菌帶。這類基於微生物培養技術的方法目前是細菌抗藥性檢測的主流方法。但是，由於細菌生長需要時間，此類方法至少需要48-72小時。對於生長緩慢的細菌，比如結核分支桿菌，需要的時間更長，因此對於需要儘快知道細菌抗藥性的情況，例如敗血症病人的治療， 這類方法無法及時提供選擇抗生素的必要信息。
[0011]第二類方法是基於聚合酶鏈反應的基因方法。病人樣品可以用針對β -內醯胺酶基因的特定探針進行基因擴增，然後來檢測得到抗藥性的基因變異。此類方法快速，靈敏。但是，由於此類方法不是功能性測定，所以只能用來檢測已知的耐藥機制，而不能確定以往未知的全新抗藥機理。
[0012]第三類方法是直接測定β -內醯胺酶的降解β -內醯胺類抗生素的功能。目前有多種內醯胺酶的螢光底物可以選擇。這類底物本身沒有螢光，但是，當它們被內醯胺酶分解後，會有螢光產品出現。通過觀測螢光強度變化，可以確定內醯胺酶的存在。但是，現有內醯胺酶底物無法區分普通和廣譜內醯胺酶。所以並不能夠起到指導抗生素選擇的作用。
[0013]概括而言，雖然目前的相關技術在它們的適用領域中有無可取代的位置，但在特定的應用中，特別是在處理治療敗血症病人的過程中，它們也有著種種局限。所以，一種可以快速區分普通和廣譜β_內醯胺酶的檢驗方法是迫切需要的。在國內外尚無同類產品。類似產品有日本Kanto Chemical公司生產的Cica-β-test試劑。Cica-β-test試劑也可以用來檢測細菌是否對三四代頭孢菌素具有抗藥性。但是，由於Cica-β -test試劑檢測依賴於顏色變化(陽性樣品的顏色從黃色變到紅色)，靈敏度至少要比本產品的螢光檢測法低一個數量級。另外一個類似產品是美國Life Technologies公司生產的GeneBLAze試劑。GeneBLAze試劑也是基於螢光檢測，但是，此試劑只能用來無差別的檢測所有的β-內醯胺酶的存在，而不能特異性的檢測能夠降解三四代頭孢菌的廣譜內醯胺酶。此外，GeneBLAze試劑只是一個研究用產品，用來進行一些真核細胞的光學顯像實驗，而不是在臨床上用於檢測細菌抗藥性。
【發明內容】

[0014]早期的青黴素以及一二代的頭孢菌素能夠被普通β -內醯胺酶所分解，所以含有普通內醯胺酶的細菌對它們具有抗藥性。但是，在只有普通內醯胺酶存在的情況下，第三和第四代頭孢菌素是穩定的。這主要是因為第三和第四代頭孢菌素的內醯胺環上有一個特殊的取代基，對普通β -內醯胺酶有巨大的位阻作用，所以普通β -內醯胺酶不能有效的分解三四代頭孢菌素。換句話說，只含有普通內醯胺酶的細菌對三四代頭孢菌素敏感。然而，廣譜內醯胺酶，包括金屬內醯胺酶以及由普通內醯胺酶突變而來的超廣譜β內醯胺酶，不受此取代基的影響，因而可以有效的降解三四代頭孢菌素。
[0015]以往的β -內醯胺酶的螢光底物不具有在三四代頭孢菌素上的特殊取代基，所以它們可以同時被普通和廣譜β -內醯胺酶所分解。因此它們可以檢測所有的β -內醯胺酶，但是無法區分這兩類的內醯胺酶。
[0016]解決上述技術問題可通過設計併合成一種全新的內醯胺酶的螢光底物，此底物的化學結構包含了在三四代頭孢菌素上的特殊取代基。所以，它對普通內醯胺酶穩定，但是可以被廣譜內醯胺酶所降解，從而得到可以觀察到的螢光信號變化。因此，在臨床上使用時，可以特定檢測到含有廣譜內醯胺酶的抗藥性細菌。
[0017]根據此想法和思路，發明人通過反覆的實驗研究與分析和理論探索，已成功得到預期的研究結果和應用產品細菌耐藥性螢光檢測試劑盒。
[0018]本發明的目的之一是提供一種新的廣譜β -內醯胺酶螢光底物，其具體結構式如下所示的化合物或所述化合物的對映體、消旋體或非對映異構體:
[0019]
【權利要求】
1.一種廣譜β-內醯胺酶螢光底物，其特徵在於:所述廣譜β-內醯胺酶螢光底物的具體結構式如下所示的化合物或所述化合物的對映體、消旋體或非對映異構體:
2.一種製備權利要求1所述廣譜β_內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於，包括如下具體步驟A~Ε、Β~E、C~E或D~Ε,具體化學反應式如下所示:
3.根據權利要求2所述的製備廣譜β-內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於:步驟A操作為:以頭孢噻肟鈉為原料在酸性條件下溶解，加入二苯基重氮甲烷，調節pH值到9後，萃取提取；洗滌有機層，乾燥，除去溶劑；經矽膠柱分離純化，收集組分除去溶劑後得到化合物I ; 步驟B操作為:將2-(1Η-苯並三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-羥基-苯並三唑、二異丙基乙胺、加入化合物I和三苯甲基甘氨酸混合溶解，攪拌，反應完成後，將反應液提取，洗滌有機層濃縮後，經矽膠柱分離純化，收集組分除去溶劑後得到化合物2 ; 步驟C操作為:三異丙基矽烷和三氟乙酸加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，攪拌，除去溶劑後洗滌，然後溶解在乙腈和磷酸鈉緩衝液中，加入從新鮮桔皮中提取的乙醯酯酶後，混合物攪拌，除去乙醯酯酶，濾液濃縮，調PH值至3.5左右，緩慢加入Ph2CN2和乙腈，攪拌，調整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取兩次，有機層加入三苯甲基甘氨酸的羥基琥珀酼亞胺脂，並用高效液相色譜法來監測反應進程，反應完成後，混合物用鹽水洗滌三次後，濃縮除去溶劑後重新溶解於二氯甲烷中，繼續加入4-硝基苯基氯和吡啶，攪拌，反應結束後，經矽膠柱分離純化，收集組分除去溶劑後得到化合物3 ； 步驟D操作為:化合物4溶解於含有二異丙基乙胺的二甲基甲醯胺中，然後加入化合物3，混合物在0° C下攪拌用膠柱純化分離洗脫，得到化合物5 ； 步驟E操作為:三異丙基矽烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，攪拌，除去溶劑，用二氯甲烷洗滌3次後重新溶解在二甲基亞碸中，然後加入化合物6和二異丙基乙胺，攪拌，反應結束後，通過製備高效液相色譜純化，用島津高效液相色譜法在540nm波長檢測，收集組分得到化合物7，即所述的β -內醯胺酶螢光底物。
4.根據權利要求3所述的製備廣譜β-內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於，所述步驟A具體反應為:以頭孢噻肟鈉為原料加入I毫摩爾的鹽酸和甲苯磺酸溶解在乙腈和水溶液中，加入二苯基重氮甲烷，在0° C下混合攪拌直到特徵的紫色消失；在混合物中加入氫氧化鈉溶液調節PH值到9後，用乙酸乙酯萃取提取；有機層先後用水和飽和鹽水洗滌，乾燥，在用旋轉蒸發儀除去溶劑；富集物用30%正己烷-乙酸乙酯在50克的矽膠柱上進行分離純化，收集組分乾燥。
5.根據權利要求3所述的製備廣譜β-內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於，所述步驟B具體反應為:在乙腈溶液中添加2-(1!1-苯並三唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-羥基-苯並三唑和二異丙基乙胺，然後在-20° C下加入化合物I和三苯甲基甘氨酸，混合物在-20° C下攪拌，然後自然升溫到0° C，並繼續反應，反應完成後，將反應液倒入含冰水和2Μ HCl的混合液中，用100毫升的二氯甲烷提取，有機層用飽和鹽水洗兩次，乾燥，然後旋轉蒸發濃縮得到淡黃色固體，所述淡黃色固體經矽膠柱以15%乙酸乙酯-正己烷洗脫純化，收集組分用乾燥。
6.根據權利要求3所述的製備廣譜β-內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於，所述步驟C具體反應為:三異丙基矽烷和三氟乙酸在-20° C分別加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，混合物在0° C下攪拌，除去溶劑後以乾燥乙醚洗滌三次，然後溶解在乙腈和磷酸鈉緩衝液(pH值=6.5)中，繼續加入從新鮮桔皮中提取的乙醯酯酶後，混合物攪拌過夜，加入丙酮沉澱乙醯酯酶，得到的黃色濾液濃縮，用稀鹽酸(0.8摩爾/升)酸化至pH值3.5左右，緩慢加入Ph2CN2和乙腈，攪拌0.5小時後，溶液調整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取兩次，有機層加入三苯甲基甘氨酸的羥基琥珀酼亞胺脂，並用高效液相色譜法來監測反應進程，反應完成後，混合物用鹽水洗滌三次後，濃縮除去溶劑；黃色油狀產物被重新溶解於二氯甲烷中，繼續加入4-硝基苯基氯和吡啶，混合物在-20° C下攪拌，反應結束後，將產物加載到矽膠柱上用25%丙酮一正己烷洗脫純化，收集組分旋乾燥。
7.根據權利要求3所述的製備廣譜β-內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於，所述步驟D具體反應為:化合物4溶解在含有二異丙基乙胺的二甲基甲醯胺中，然後加入化合物3，混合物在0° C下攪拌用膠柱純化，並用25%丙酮一正己烷洗脫後收集。
8.根據權利要求3所述的製備廣譜β-內醯胺酶螢光底物的方法，其特徵在於，所述步驟E具體反應為:三異丙基矽烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，攪拌，除去溶劑，用二氯甲烷洗滌3次後重新溶解在二甲基亞碸中，然後加入化合物6和二異丙基乙胺，在0° C下攪拌，反應結束後，通過製備高效液相色譜純化，用島津高效液相色譜法在540nm波長檢測，收集組分冷凍乾燥。
9.一種權利要求1所述的廣譜β -內醯胺酶螢光底物的應用，其特徵在於:所述是廣譜β_內醯胺酶螢光底物用於製備檢測個體耐藥性的診斷檢測試劑或診斷檢測試劑盒。
10.根據權利要求8所述的廣譜β-內醯胺酶螢光底物的應用，其特徵在於:所述的診斷檢測試劑或診斷檢測試劑盒`於檢測β_內醯胺類抗生素的個體耐藥性。
【文檔編號】C07K5/062GK103509083SQ201210219507
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月28日 優先權日:2012年6月28日
【發明者】王鬱生 申請人:王鬱生