用於捲菸輔助材料安全性評價及其篩選的生物熱化學方法
2023-06-15 08:01:21
專利名稱：用於捲菸輔助材料安全性評價及其篩選的生物熱化學方法
技術領域：
本發明涉及捲菸減害效果和安全領域，具體地指一種用於捲菸輔助材料安全性評價及其篩選的生物熱化學方法。
背景技術：
近幾十年食品安全問題的受關注度可謂達到空前的狀態，菸草雖然絕大多數情況不被直接食用，但很多國家依然把菸草劃為食品類或準食品類，作為「特殊食品」其安全性越來越受關注，檢測程序和方法也越來越嚴格。C0RESTA (國際菸草科學研究合作中心)成立了相關的菸草煙氣體外毒性測試工作組，其主要任務是根據國際認可的體外毒性測試準則並加以修改，以適應菸草煙氣的性質和獨特特性，同時確定標準測試方法。體外毒性測試並非危害的直接測定，但完全可以確保測試產品不會增加潛在的危害，毒理學數據可以在一定程度為捲菸產品安全性評價提供理論依據和信息。然而，對於新型的煙用輔助材料的安全性和功能性評價，即使是常規的檢測往往也需要耗費非常大的人力物力，測試成本高、 時間周期長、效率低等問題暴露了出來。隨著煙用輔助材料的快速增多、要求更加嚴格，行業急需要一些新的高速準確的方法來協助，對煙用輔助材料進行初步篩選，縮小範圍，降低成本，提高效率。
所有的化學、物理和生命過程都伴隨著熱效應。對這些熱效應進行精確的測定，並作合理的分析，這就成熱化學的精髓。隨著科學和技術的不斷發展，儀器設備的不斷改進， 特別是現代微量熱技術的發展，熱化學越來越多地滲透到其它領域，從而形成了許多新興的交叉學科。其中最具特色的生物熱化學逐漸被人們認識和重視起來。
生物體內的化學反應的熱效應一般都很小，而且是在等溫狀態下進行的。現代等溫微量熱技術就是在此基礎上發展起來的方法。從生命科學的基本研究內容看，可涉及生物的生長發育、生理生化、物質和能量代謝過程。
量熱法(Calorimetry)是生物熱化學的重要研究方法，它用於生物體系變化過程的熱效應研究有許多獨到之處。恆溫量熱儀的工作原理可簡述為放入測量池的樣品，因某一過程的進行而產生一定的熱效應，從而使其自身的溫度發生改變。測量池周圍有一個維持在恆溫狀態的散熱裝置。如樣品和散熱片之間存在一定的溫差，熱量就從樣品流向散熱片，溫差的大小與熱量流動的速率呈正比。高靈敏度的熱電元件分布在反應容器的周圍，可測出樣品與環境之間的溫差並轉化為一定的電壓，經過放大後輸出。如果樣品的反應終止， 那麼它就與環境保持在相同的溫度，不再有熱效應輸出，熱電元件所產生的電壓為零。在量熱測定過程中不需添加任何試劑，這樣就不會引入對生物體系正常活動和代謝有影響的因素，而且還可以有目的地加入某一物質，以研究該物質對生物體活動的影響。此外，量熱法可用於任何複雜的體系,如混沌的、高分散體系,對被研究體系的溶劑性質、光譜性質及電化學性質沒有任何限制，只要有熱效應即可應用，因此，可用於直接研究離體的組織和懸浮液。樣品用量少，而且在量熱實驗後，對研究體系沒有任何破壞，還可以進行後續生化分析。 雖然量熱法缺乏特異性，但研究對象本身具有特異性，所以用這種非特異的方法可以得到一些有意義的結果。量熱法可以用於生命系統中的各種特異過程，如生物機體內各個水平上的生長代謝過程、酶促反應、生物大分子間以及生物大分子與小分子間的相互作用等。當然，量熱法也有其不足之處，即不能追蹤某一特定個別中間產物的消長過程和宏觀體系中的個體情況，只能顯示各種過程熱效應的總和，但研究者可以結合其他手段，如各種電子顯微技術、光譜和波譜等進行解析，取長補短。生物量熱技術和理論日趨完善，現已基本形成了生物熱化學和生物化學熱力學等交叉學科。並且，生物量熱技術已滲透到生命科學的各個領域，在生物化學、臨床醫學、環境科學、農業生態、食品科學等方面獲得廣泛應用。
微量熱法(Microcalorimetry)具有高度自動化、實時在線、微量化(mg待測樣品就可完成實驗)、靈敏度高(低至nW的熱量)、重現性好，而且不會破壞樣品的特點，運用於研究生物體系有諸多的優勢。微量熱法能直接測定微生物或細胞，甚至細胞器對各種外來物質的敏感度；可定量研究外源物與微生物、細胞或細胞器間的作用，獲得影響程度、藥效、 抑菌率和毒性等方面的信息；結合其他實驗方法，還可以研究外源物對實驗對象的影響機制。這對外源物的安全性評估，指導藥物或添加劑的合成、篩選及應用均具有較強的理論意義。利用生物量熱技術的這些特點和優勢，能夠較好的擔當起對煙用輔助材料進行初篩選的重任。在煙用輔助材料進行一系列繁瑣的生物安全性評價之前，利用微量熱法，可以快速、準確的將絕大部分對細胞(具有代表性的模式細胞或微生物)正常代謝有著顯著影響的輔材篩選出來。這樣可以大幅降低後期實驗成本、人力和時間，起到事半功倍的效果。發明內容
本發明的目的是針對現在的輔助材料體外毒理學檢測方法存在成本高、周期長、 效率較低的缺陷，提供了一種用於捲菸輔助材料安全性評價及其篩選的生物熱化學方法。 用於新型捲菸加入物篩選和安全性評價。在實施現有的標準毒理學檢測評價方法之前，將煙用輔助材料按影響程度進行分類，將有顯著毒性或破壞性的材料以及達不到效果的材料直接排除掉，避免人力和物力上的浪費。
為解決上述技術問題，本發明提供了一種捲菸輔助材料的安全性評價及篩選的生物熱化學方法，包括以下步驟
⑴大腸桿菌LB培養基用於培養及測試，LB培養基配方為5g酵母粉，10 g蛋白腖，5gNaCl溶於IL 二次蒸餾水中，調節pH至7. 4，在120°C、I. 034X 105Pa高壓滅菌處理20 min，待用；
⑵金黃色葡萄球菌LB培養基用於培養及測試；
⑶白色假絲酵母菌LB培養基用於培養及測試；
⑷熱帶假絲酵母菌LB培養基用於培養及測試；
(5)釀酒酵母菌YPDA培養基用於培養及測試，YPDA培養基配方為20g蛋白腖、IOg 酵母抽提物、2g葡萄糖用適量二次蒸餾水溶解，再加入15ml的O. 2%腺嘌呤溶液，定容到 1L，120°C高壓滅菌15min，室溫貯存，待用；
(6)枯草芽孢桿菌LB培養基用於培養及測試；
(7)蘇雲金芽胞桿菌LB培養基用於培養及測試；
(8)植物乳桿菌乳酸菌培養基用於其培養和測試；培養基配方為將7. 5g酵母粉、7.5g蛋白腖、IOg葡萄糖、2gKH2P04、0. 5ml吐溫80溶於900ml 二次蒸餾水，再加入IOOml番茄汁，混勻後低溫貯存，待用；
⑶嗜鹽古生菌嗜鹽古生菌培養基用於培養及測試，嗜鹽古生菌培養基配方為 250gNaCl，2gK2S04，30gMgCl2 · 6H20，2g酵母提取物，2. 5g水解乳蛋白，溶於IL 二次蒸餾水中，待用；
(10)四膜蟲四膜蟲培養基用於培養及測試，四膜蟲培養基配方為15g蛋白腖、5g酵母粉、Ig葡萄糖溶解於IL蒸餾水中，pH值調至7. (Γ7. 5，高壓滅菌後待用；
(11)成纖維細胞成纖維細胞培養基用於培養及測試，成纖維細胞培養基配方為 MEM基礎培養基，加入10%胎牛血清和(TO. 4g -Γ1的非必需胺基酸；ΜΕΜ培養基基本成分為 O. 20g · Γ1 無水 CaCl2、0. 0977g .171 無水 MgS04、0. 40g · L-1 KCl、6· 8g · Γ1 NaCl、0· 122g .171 NaH2PO4,0^0. OOlg · Γ1 酒石酸膽鹼、(Π). OOlg · Γ1 葉酸、(TO. 002g · Γ1 肌醇、(TO. OOlg · Γ1 煙醯胺、0 0· OOlg · L-1D-泛酸鈣、(TO. OOlg · L-1鹽酸吡哆辛、0 0· OOOlg · L-1核黃素、 0 0· OOlg · L-1 鹽酸硫胺、Ig · L-1 葡萄糖、(To. OOlg · L-1 丁二酸、(H). OOlg · L-1 丁二酸鈉、 O. Ollg · L-1芬紅、(TO. OOOl g · L-1卡那黴素以及O.1 O. 3 g · L—1必需胺基酸；
(12)上皮細胞上皮細胞培養基用於培養及測試，上皮細胞培養基配方為MEM基礎培養基，加入10%胎牛血清和(Γι%的非必需胺基酸；
(13)線粒體線粒體提取液配方為0. 22mol · L—1甘露醇，0. 07mol · T1M蔗糖， 0. 02mol · L—1羥乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，0. 002mol .L—1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 Tris-HCl,0. OOlmol · Γ1乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA. 2Na，pH為7. 0 7. 4 ;線粒體測試液配方為0. 22mol · L—1甘露醇,0. 07mol · L—1鹿糖,0. Olmol · L—1三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽 Tris-HCl,0. OOlmol · L 乙二胺四乙酸二鈉鹽 EDTA. 2Na, pH 為 7. 0 7· 4 ；
2)捲菸煙氣凝聚物收集預處理按標準吸菸機操作方法；將煙氣捕集後，以水、 質量分數為5、0%乙醇溶液或者質量分數為1(T50%N, N-二甲基甲醯胺溶液為萃取液,進行振蕩或超聲波萃取10 60min,過濾後待用；
3)將步驟I)中的每l(T500ul的模式研究對象菌液加入5ml對應的液體培養基中；
4)將步驟2)的濃溶液或懸濁液分成0μ 1、5μ 1、10μ 1、20μ 1、50μ 1、100μ I、200 μ I濃度梯度，並將不同濃度梯度的濃溶液或懸濁液加入步驟3)中液體培養基中，振蕩均勻後，
5)將步驟4)中振蕩均勻的液體培養基放置於量熱儀TAM air或TAM3中，設定溫度為2(T40°C恆溫，
6)待溫度達到設定值且穩定後，將培養液導入微量熱儀的檢測室，開始採集數據；
7)根據採集數據進行作圖、擬合和計算，獲得相關的生長產熱曲線及熱動力學參數，其參數包括代謝過程的生長速率常數k、最大產熱功率Pm、總放熱量Q、傳代時間te、最大熱功率對應的時間tm、出峰時間t p和抑制率I、半抑制濃度IC5tl ；
8)比較相關的生長產熱曲線及熱動力學參數相關的生長產熱曲線及熱動力學參數，分析加入不同材料對模式研究對象正常代謝的影響及其差異，獲得有關捲菸輔助材料安全性的初步評估，可對眾多的輔助材料進行篩選；分析有無加入新型材料的煙支，其煙氣對模式研究對象代謝指標的影響差異性，可評價捲菸輔助材料是否具有顯著的降焦減害的效果。
作為優選方案，所述成纖維細胞的培養基配方中的非必需胺基酸為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意幾種；MEM培養基中必需胺基酸為賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和組氨酸中的任意幾種。
圖1為在37°C條件下大腸桿菌生長代謝熱譜圖，
圖中，1.空白，2.捲菸，3.參比捲菸。
具體實施方式
為了更好地解釋本發明 ，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限於以下實施例。
實施例I
對於一種新型煙用二氧化鈦參雜富勒烯減害材料進行生物效應的初步鑑定，將其編號為CB02。這種新型富勒烯材料對煙氣中的有害成分有著非常好的淨化作用。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌為模式研究生物，利用TAM3微量熱檢測儀對它們的代謝過程進行實時監控。我們採集了加入這種材料之後的煙支的主流煙氣，同時用未加入這種材料的同種煙支的煙氣進行對比。將捕集了主流煙氣的劍橋濾片分別放入編號的廣口錐形瓶中，加入定量的IOml蒸餾水浸泡並振蕩30min。過濾後，從各錐形瓶中均準確取出 100 μ I濾液對應編號加入到已經接種過微生物的5ml培養基中。每種微生物的3瓶培養基分別是加入了 CB02捲菸產生的主流煙氣收集液、參比捲菸的主流煙氣收集液和空白培養基。用流動泵將培養基泵入微量熱儀的樣品室，恆溫37°C，我們得到了微生物的生長代謝曲線(大腸桿菌生長代謝曲線如圖所示)。通過對數據的分析和處理，得出了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色假絲酵母菌代謝過程的一系列物理化學參數，列於表I。k是生長速率； PmS最大放熱功率；Q是整個代謝過程的總放熱量；te是傳代時間。由數據看出，加入CB02 的捲菸主流煙氣收集液對三種微生物正常代謝基本沒有構成顯著影響，其影響要遠遠小於參比捲菸。而參比捲菸的主流煙氣收集液使微生物生長速率k減慢，最大放熱功率Pm明顯降低，總放熱量Q下降，傳代時間te延長。結果表明，在捲菸中加入CB02材料可以降低捲菸主流煙氣的有害程度。
表I三種微生物代謝過程的相關物理化學參數
研『先對象樣品空白大腸桿菌CB02 A金黃色Jr、 Sw"*CB02β萄球菌空白_u箐而I白色假絲CB02酵母菌參比
實施例2
對於四種新型煙用功能性碳納米管複合材料的濾嘴進行過濾效果分析。前兩種多為壁碳納米管，直徑分別為5 nm、10 nm ;後兩種為單壁碳納米管,直徑分別為2nm、lnm。這四種濾嘴在理論上對煙氣都有不同程度的吸附作用和選擇性效果，分別給他們編號為1#、 2#、3#和4#。利用微量熱技術可以對這四種濾嘴的過濾能力進行快速、準確的比較，評價他們的過濾能力。對效果明顯較差的濾嘴進行篩選和排除，無需進行中試或者工業化應用等評估，節約了大量的資金和時間。實驗利用同樣牌號的菸絲，並將該牌號的捲菸作為參比捲菸。以釀酒酵母菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜鹽古菌和四膜蟲為模式研究生物，利用 TAM air等溫微量熱檢測儀對樣品捲菸和參比捲菸主流煙氣作用影響下模式研究生物代謝過程進行實時監控。通過對採集到的數據的分析整理，獲得微生物代謝過程各相關物理化學指標。吸菸機抽吸各樣品捲菸和參比捲菸，並用10ml20%的乙醇溶液捕集其主流煙氣，經過30min振蕩後，過濾並封存待用。將多種模式研究生物分別轉入5ml液體培養基中，再向培養液中加入處理過的主流煙氣捕集液，轉入安瓿瓶。振蕩均勻後，將安瓿瓶放入TAM air 等溫熱活性檢測儀的樣品室，恆溫30°C (釀酒酵母菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和四膜蟲) 或37°C (嗜鹽古生菌)進行實時監測。採集到的數據經過處理，可以獲得相關物理化學參數(表2)。k是生長速率；Pm為最大放熱功率；Q是整個代謝過程的總放熱量。空白是未加入任何煙氣捕集液的模式研究生物代謝參數。分析數據可知，1#捕集液對模式研究生物的代謝存在較小的抑制作用，各項參數均表現出比參比捲菸的抑制性弱，說明過濾有害成分的效果超過了參比捲菸原裝濾嘴；2#捕集液表現出比參比捲菸捕集液更高的抑制作用，說明過濾有害成分的效果不及參比捲菸原裝濾嘴，因此該新型濾嘴不可取;3#捕集液的各項參數表現出其抑制能力最低，遠低於參比捲菸，過濾效果最佳；4#捕集液的各項參數與參比捲菸捕集液極其相近，具體效果還需進行進一步的分析。綜上，可以認為碳納米管直徑在 2^5nm的過濾效果較佳,其中以5nm管徑的多壁碳納米管效果最佳。
表2微生物代謝過程的相關物理化學參數
k (min'1) 0.0391 0.03820.03660.02520,02460,02290,0543(105300,0507Pmim)79.027666.8028.53 27.68H /T46.5345'6441.17Qmal (J) 0.342 0.335 0.290 0.139 0.13 1 0.125 0,161 0.146 0.122/g (min)I 9 ΠΠM mrnta / /13.0813,6權利要求
1. 一種捲菸輔助材料的安全性評價及篩選的生物熱化學方法，包括以下步驟⑴大腸桿菌LB培養基用於培養及測試，LB培養基配方為5g酵母粉，10 g蛋白腖， 5gNaCl溶於1L二次蒸餾水中，調節pH至7. 4，在120°C、1. 034X 105Pa高壓滅菌處理20min， 待用；⑵金黃色葡萄球菌LB培養基用於培養及測試；⑶白色假絲酵母菌LB培養基用於培養及測試；⑷熱帶假絲酵母菌LB培養基用於培養及測試；(5)釀酒酵母菌YPDA培養基用於培養及測試，YPDA培養基配方為20g蛋白腖、10g酵 母抽提物、2g葡萄糖用適量二次蒸餾水溶解，再加入15ml的0. 2%腺嘌呤溶液，定容到1 L， 120°C高壓滅菌15min，室溫貯存，待用；(6)枯草芽孢桿菌LB培養基用於培養及測試；⑴蘇雲金芽胞桿菌LB培養基用於培養及測試；⑶植物乳桿菌乳酸菌培養基用於其培養和測試，培養基配方為將7. 5g酵母粉、7. 5g 蛋白腖、10g葡萄糖、2gKH2P04、0. 5ml吐溫80溶於900ml 二次蒸餾水，再加入100ml番茄汁， 混勻後低溫貯存，待用；⑶嗜鹽古生菌嗜鹽古生菌培養基用於培養及測試，嗜鹽古生菌培養基配方為 250gNaCl，2gK2S04，30gMgCl2 6H20，2g酵母提取物，2. 5g水解乳蛋白，溶於1L 二次蒸餾水 中，待用；_四膜蟲四膜蟲培養基用於培養及測試，四膜蟲培養基配方為15g蛋白腖、5g酵母 粉、lg葡萄糖溶解於1L蒸餾水中，pH值調至7. (T7. 5，高壓滅菌後待用；(11)成纖維細胞成纖維細胞培養基用於培養及測試，成纖維細胞培養基配方為MEM 基礎培養基，加入10%胎牛血清和(TO. 4g L—1的非必需胺基酸；MEM培養基基本成分為 0. 20g L-1 無水 CaCl2、0. 0977g I71 無水 MgS04、0. 40g I71 KC1、6. 8g I71 NaCl、0. 122g *L_1 NaH2P04、0 0. OOlg I71 酒石酸膽鹼、(H). OOlg I71 葉酸、(TO. 002g I71 肌醇、(TO. OOlg I71 煙醯胺、(To. OOlg L^D-泛酸鈣、(To. OOlg L-1鹽酸吡哆辛、(To. OOOlg L-1核黃素、 (To. OOlg L-1 鹽酸硫胺、lg L-1 葡萄糖、(To. OOlg L-1 丁二酸、(To. OOlg L-1 丁二酸鈉、 0. 01 lg L-1芬紅、(To. OOOlg L-1卡那黴素以及0. ro. 3 g L—1必需胺基酸；(12)上皮細胞上皮細胞培養基用於培養及測試，上皮細胞培養基配方為MEM基礎培養 基，加入10%胎牛血清和(Tl%的非必需胺基酸；似線粒體線粒體提取液配方為0. 22mol -r1甘露醇，0. 07mol -L^M蔗糖，0. 02mol七1 羥乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，0. 002mol .L—1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris_HCl， 0. OOlmol T1乙二胺四乙酸二鈉鹽EDTA. 2Na, pH為7. 0 7. 4 ;線粒體測試液配方為 0. 22mol .L—1甘露醇，0. 07mol L—1蔗糖，0. Olmol L—1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl， 0. OOlmol L h 乙二胺四乙酸二鈉鹽 EDTA. 2Na, pH 為 7. 0 7. 4 ；2)捲菸煙氣凝聚物收集預處理按標準吸菸機操作方法；將煙氣捕集後，以水、質量分 數為5、0%乙醇溶液或者質量分數為1(T50%N, N-二甲基甲醯胺溶液為萃取液，進行振蕩或 超聲波萃取10 60min,過濾後待用；3)將步驟1)中的每l(T500ul的模式研究對象菌液加入5ml對應的液體培養基中；4)將步驟2)的濃溶液或懸濁液分成0111、5111、10111、20111、50111、100111、200111濃度梯度，並將不同濃度梯度的濃溶液或懸濁液加入步驟3)中液體培養基中，振蕩均勻後， 5)將步驟4)中振蕩均勻的液體培養基放置於量熱儀TAMair或TAM3中，設定溫度為20 40で恆溫，6)待溫度達到設定值且穩定後，將培養液導入微量熱儀的檢測室，開始採集數據； 7)根據採集數據進行作圖、擬合和計算，獲得相關的生長產熱曲線及熱動力學參數，其參數包括代謝過程的生長速率常數k、最大產熱功率Pm、總放熱量Q、傳代時間te、最大熱功率對應的時間tm、出峰時間tp和抑制率I、半抑制濃度IC5tl ； 8)比較相關的生長產熱曲線及熱動力學參數相關的生長產熱曲線及熱動力學參數，分析加入不同材料對模式研究對象正常代謝的影響及其差異，獲得有關捲菸輔助材料安全性的初步評估，可對眾多的輔助材料進行篩選；分析有無加入新型材料的煙支，其煙氣對模式研究對象代謝指標的影響差異性，可評價捲菸輔助材料是否具有顯著的降焦減害的效果。
2.根據權利要求I所述的捲菸香精香料安全性篩選的生物熱化學方法，其特徵在於所述成纖維細胞的培養基配方中的非必需胺基酸為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意幾種；MEM培養基中必需胺基酸為賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和組氨酸中的任意幾種。
全文摘要
本發明公開一種用於捲菸輔助材料安全性評價及其篩選的生物熱化學方法。本方法採取體外宏觀微量熱實驗，通過等溫熱活性檢測儀對已經過處理的微觀研究對象整個代謝過程進行實時監測，利用採集模塊收集過程中的熱量變化，計算出相關物理化學參數。本發明操作簡單、成本極低、實驗周期短、效率高、結果準確可靠，還能實時觀測整個代謝過程，開創了一種初步鑑定捲菸減害效果以及添加物篩選的新方法，為後面的進一步分析評價提供了重要的參考依據，並且在提高了效率的同時大大降低了成本。
文檔編號G01N25/48GK102980913SQ20121045233
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者李冉, 宋旭豔, 魏敏, 羅誠浩, 陳義坤 申請人:湖北中煙工業有限責任公司