作為hm74調節劑的呋塞米衍生物以及它們用於治療炎症的用途的製作方法

2023-06-15 02:21:31

專利名稱：作為hm74調節劑的呋塞米衍生物以及它們用於治療炎症的用途的製作方法
背景技術：
G蛋白偶聯受體(GPCRs)是涉及細胞信號傳遞的整合膜蛋白。GPCRs應答多種細胞外信號，包括神經遞質、激素、有氣味的東西和光，並能夠傳遞信號而在細胞內引起第二信使應答。許多治療藥物均以GPCRs為靶點，因為這些受體介導大量生理應答，包括炎症、血管舒張、心率、支氣管擴張，內分泌和蠕動。
許多疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、牛皮癬以及類風溼性關節炎(RA)，通常被認為具有涉及T輔助細胞、單核細胞-巨噬細胞和嗜酸性粒細胞的炎性病因。目前所用的皮質類固醇抗炎症療法在治療哮喘方面是有效的，但也伴有代謝和內分泌方面的副作用。對於通過肺或鼻黏膜吸收的吸入型製劑，情況可能也是如此。目前尚缺乏令人滿意的治療RA或COPD的口服療法。
人單核細胞的HM74的分子克隆預示HM74是一種趨化因子受體(Nomura等人，Int.Immunol.(1993)5(10)1239-1249)。HM74主要表達在骨髓、脾臟、扁桃體和氣管中。HM74的配體尚未知曉。
人體細胞含有一種相關的但又是獨特的受體HM74A。HM74和HM74A的胺基酸序列約95％同一的。但是，HM74A已被去孤兒化而HM74卻沒有。煙酸或尼克酸是HM74A的配體(Wise等人，J.Biol.Chem.2789869-9874，2003)。煙酸是HM74的一種較差的激活劑。
鼠基因組含有HM74A基因，但不含HM74基因。
在某些情況下，HM74和HM74A顯示了共調節作用。本發明的申請人採用Taqman-PCR發現，HM74和HM74A的表達在粒細胞內被TNFα誘導上調了50倍，在單核細胞內被LPS或TNFα誘導上調了10至20倍。HM74的表達在正常的人支氣管上皮細胞內也被TH2細胞因子、IL-4或IL-13(已知是哮喘病因的重要因素)誘導上調了4-5倍。HM74和HM74A的表達在人初級嗜酸性粒細胞內被IL-5上調。最後，在一種鼠實驗性哮喘模型中，肺的HM74A表達也被上調。
HM74和HM74A的有限組織分布及其調節提示了HM74和HM74A在炎性過程例如哮喘、RA和COPD中的作用。
鑑於GPCRs在疾病中的作用和通過調節GPCRs活性來治療疾病的能力，GPCR配體的發現和鑑定可供開發出新的用於治療其中涉及GPCR活性的疾病狀態的組合物和方法。本發明發現和鑑定了激活HM74的分子，並提供了將此發現用於發現和治療有關疾病的組合物和方法。
發明概述本發明涉及激活HM74但不激活HM74A的分子。
該分子具有以下結構 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中該環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
在本發明的另一方面，公開了鑑定HM74調節劑的方法。例如，所感興趣的方法包括以下步驟提供一種化學基團，提供表達HM74的細胞以及確定該化學基團是否調節HM74的信號傳遞活性，包括確定這種調節在存在或不存在本發明的激動劑時是否發生。在一個相關的方面，該化學基團可包括但不限於肽類、抗體、激動劑、反激動劑和拮抗劑。或者，在競爭性分析中可使用已知的調節劑來鑑定其它調節劑。
所研究的鹼取代的氨茴酸或呋塞米可激活HM74。那些化合物在表達HM74的細胞(例如人體細胞，如CHO細胞、293細胞和L1.2細胞)內引起選擇性的劑量響應性鈣動員。未被HM74編碼序列轉化的對照細胞則未顯示這種鈣響應現象。所研究的化合物還在酵母報導基因分析中激活HM74並在轉染L1.2細胞內引起趨化現象。
所研究的化合物通常是激動劑。因此，所研究的化合物可作為候選藥物來研究。所研究的化合物還可用於鑑定激活、結合和/或調節HM74的其它分子，例如通過競爭性分析來鑑定。
本發明的另一方面包括治療組合物，這類組合物包括核酸、抗體、多肽、激動劑、反激動劑和拮抗劑。此外，本發明的方法還包括通過給需要治療的患者施用這類治療組合物來治療疾病狀態和調節HM74信號傳遞活性的方法。
通過參考下文的發明詳述和附圖
，本發明的這些和其它方面將變得顯而易見。此外，下文列出了多篇更詳細描述某些步驟或組合物的參考文獻。這些參考文獻在此各自引入本文作為參考，如同它們各自被單獨引入。
發明詳述本發明基於發現了激活HM74的分子。
HM74編碼序列是已知的(Nomura等人，出處同上)。本發明提供了獲取、製備和使用HM74的方法。只要HM74的已知功能活性不受到有害的影響，HM74編碼序列和胺基酸的變化是可接受的。
此化合物調節HM74活性且是HM74的激動劑，因此是治療以炎症為特徵的疾病例如哮喘的候選藥物。
此化合物還可用於篩選HM74的拮抗劑。例如，使表達HM74的細胞接觸測試化合物，然後再接觸本發明的激動劑。然後確定測試化合物對例如鈣動員的作用，以確定測試化合物是否降低本發明的激動劑所誘導的鈣動員水平。
其它鑑定例如激動劑和反激動劑的分析也被認為落入本發明的範圍。
適宜的這類化合物包括氨磺醯氨茴酸，例如具有以下結構的那些 其中R是氫；或C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中該環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
在本發明的另一方面，公開了鑑定HM74調節劑的方法。例如，所感興趣的方法包括以下步驟提供一種化學基團，提供表達HM74的細胞以及確定該化學基團是否調節HM74的信號傳遞活性，包括確定這種調節在存在或不存在本發明的激動劑時是否發生。在一個相關的方面，該化學基團可包括但不限於肽類、抗體、激動劑、反激動劑和拮抗劑。或者，在競爭性分析中可使用已知的調節劑來鑑定其它調節劑。
術語「烷基」指直鏈或支鏈的烴基。其代表性的實例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基和己基。該烴可含有一條或一條以上的不飽和雙鍵或三鍵，例如烯烴和炔烴。
術語「烷氧基」指與氧原子結合的烷基。其實例為甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。
「芳基」是芳香烴環。其實例包括苯基和萘基。
「雜原子」通常是與分子內典型原子不同的原子。因此，對於烴而言，任何不是碳或氫的原子均是雜原子。常見的生物學可接受的雜原子包括氧、硫和氮。
術語「雜芳基」指其中一個或一個以上碳原子被雜原子代替的芳基。其實例為吡啶基、咪唑基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、嘧啶基、噠嗪基、吲哚基、喹啉基、二氮雜萘基和異唑基。
術語「環烷基」指環烴。其實例為環丙基、環丁基、環戊基和環己基。
「雜環」是其中一個或一個以上碳原子被雜原子替換的環烷基。其實例為吡咯烷基、哌啶基和哌嗪基。
術語「雜烷基」是其中一個或一個以上碳原子被雜原子替換的烷基。醚就是一種雜烷基。
術語「取代」指具有一個或一個以上取代基的基本有機基團。因此，原子或基團取代分子內的其它原子或基團。代表性的取代基包括滷素、C1-C8烷基、-CN、-NO2、烷氧基、羥基、硫化物、硫酸酯基、氨磺醯、氨基和醯氨基。
「支鏈」指在一個或一個以上位點含有一個或一個以上支鏈的結構。支鏈可以是如上所定義的R基團或側基。
術語「環」指一個環狀結構、若干環狀結構中的一個環狀結構或者若干個環狀結構，其中若干個環中的兩個或兩個以上的環可以稠合，其中若干個環中的一個或一個以上的環可以是芳香環、可含有雜原子、可以被取代或者是它們的組合情形。環可以是雙環或多環。環可含有長度不等的橋基。
「滷素」例如是氯、氟或溴。
術語「側基」指與另一結構連接的原子或分子。因此，側基可以是以上所定義的R基團、烷基、鏈烯基、芳基和環烷基等等。
術語「橋基」指兩個結構之間的連接基。例如可含有雜原子、可以被取代、可以是支鏈的或者是它們的組合情形的非環狀烴(如烷基、鏈烯基等)可連接兩個環烴，例如芳基或環烷基。橋基還可位於環狀結構的內部，連接該環狀結構的至少兩個原子。分子內橋基可含有0、1、2、3、4或更多個原子。分子內橋基可以是直鏈的、支鏈的或是被取代的。
所研究的特定化合物是如下定義的那些1)當R是氫且Q是氧或硫時，則W不是氫，或者一個或兩個Z基團不是氫；2)當兩個Z基團、W和R是氫且Q是氧時，則X和Y被合併在環狀結構內。
所研究的化合物含有這樣的官能團，所述官能團可衍生形成本領域已知的前藥，例如為了提高生物利用度。因此，本發明涉及所研究的活性化合物的變體，它們在給藥後被代謝為生物活性形式。這類生物活性藥物前體又稱為生物可逆的載體、潛在藥物、給藥系統或前藥。(「BioreversibleCarriers in Drug Design」E.B.Roche編輯，Pergamon，NY，1987；「Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems」，Higuchi Stella編輯，美國化學會，DC，1975)藥物的化學修飾是針對藥效學的某些特定方面，例如如何提高必須穿過脂質屏障的極性化合物的利用度，如何穩定通常在體內易降解的化合物等等。
製造前藥的其它原因包括生物活性藥物的毒性、缺乏特異性、不穩定性、在吸收部位被代謝、吸收過快、患者順應性(例如味道差或注射部位疼痛)、醫生接受程度差或配方問題。
一種常見的修飾是酯化，它並不限於羧基的衍生化。製造這類衍生物例如胺、亞胺、含硫取代基以及醯胺的化學理論是現成的。
對於酯類，可以添加多種取代基，包括直鏈的、環狀的或支鏈的烴，它可被取代、可含有一條或一條以上的雙鍵或三鍵、可含有環狀結構，烴的主鏈可含有一個或一個以上的雜原子，例如氮、硫或氧，等等。
當考慮構建R基團的酯時，應考慮的另一因素是酶切的敏感性。因此，立體電荷和構象因素對生物利用度而言是決定性的。例如，支鏈烷基可對酯酶活性位點的可接近性產生立體位阻，從而降低水解速率。這種情況既可以是不大合乎希望的(生物利用度被延遲)，也可以是合乎希望的(生物利用度被延長)。
在其它情況下，希望提高藥物的水溶性。可達到此目標的取代基的實例包括丁二酸鹽、硫酸鹽、半丁二酸鹽、磷酸鹽、胺基酸、醋酸鹽、胺等。
醯胺、二醯亞胺、碳酸鹽、乙內醯脲(hydrantoin)等化合物中的氮原子可以被衍生化。適於與氮反應的基團包括羥甲基，或通常而言是羥烷基，以及包括醯氧烷基和醯基。
羰基也是衍生化的位點。衍生物的實例包括席夫鹼、喔星、縮酮、縮醛、唑烷、噻唑烷和烯醇酯。
雖然以上所討論的衍生物含有與藥物以共價鍵連接的取代基，取代基也可以以其它方式與藥物連接，例如氫鍵、範德華力、靜電力、疏水作用等等。
衍生化的另一手段是利用那些通過非酶催化的機理從前藥上除去的取代基。其實例包括含有以下的前藥(2-氧代-1，3-二氧雜環戊烯-4-基)甲基酯、曼尼希鹼、唑烷、催化分子內水解的含有鹼性側鏈的酯類，以及經歷分子內親核環消除反應的酯或醯胺。對於含有苯酚、醇和胺的藥物，環化機理是可得到的。[「Prodrug Design」(前藥設計)Testa Mayer，在「Encyclopedia of Pharmaceutical Technology」(製藥工藝百科全書)，第2版.V.3，Swarbrick Boylan編輯，Marcel Dekker，2002]。
因此，本發明考慮了利用已知的合成方法對所研究的化合物進行任何進一步的修飾，以獲得這樣的化合物，它們一旦使用即在體內反應或起作用以得到調節HM74活性的化合物。
本文中的術語「等效胺基酸殘基」指當把兩個或兩個以上的序列匹配進行分析時、在蛋白質序列內佔據基本相同位置的胺基酸。本發明的優選HM74多肽具有與野生型HM74的胺基酸序列足夠同一的胺基酸序列。「野生型」指存在於指定種群內的最普遍的形式或等位基因，無論是在局部或較大範圍內。本文所用的術語「足夠同一」指第一個胺基酸或核苷酸序列含有足夠或最少數量的與第二個胺基酸或核苷酸序列等同或相當的(例如帶有相似側鏈)胺基酸殘基或核苷酸，從而使得第一和第二個胺基酸或核苷酸序列具有共同的結構域和/或共同的功能活性。例如，含有具有與HM74活性至少96％同一性的共同結構域的胺基酸序列在本文中被定義為足夠同一。
如本文可互換使用的「HM74活性」、「HM74的生物活性」或「HM74的功能活性」指按照標準技術在體內或體外所測定的由HM74蛋白、多肽或核酸分子施加在HM74表達細胞上的活性。HM74活性可以是直接活性，例如與第二種蛋白關聯或作用於其上的酶活性；也可以是間接活性，例如通過HM74與第二種蛋白的相互作用來介導的細胞信號傳遞活性。在優選的實施方案中，HM74活性至少包括以下活性中的一種或多種(i)與HM74信號傳遞途徑中的蛋白質相互作用的能力；(ii)與HM74配體相互作用的能力；(iii)當被激活時改變宿主細胞的能力；(iv)當結合本發明的分子時被激活；以及(v)與細胞內的目標蛋白相互作用的能力。
本發明的一個方面涉及在HM74被激活時顯示應答的細胞內表達HM74。如本文所用的術語「核酸分子」旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及採用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。此核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。
「被分離」核酸分子指與核酸天然來源中存在的其它核酸分子分離的核酸分子。優選「被分離」核酸不含有這樣的序列其在核酸所來自的生物體的基因組DNA中天然位於編碼HM74的核酸的兩側(即位於核酸的5′端和3′端的序列)。被分離HM74核酸分子可含有少於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述序列在核酸所來自的細胞的基因組DNA內天然位於可讀框核酸分子的兩側。而且，「被分離」核酸分子(如cDNA分子)當以重組技術產生時可基本不含其它細胞物質或培養基；或者當以化學方式合成時可基本不含化學前體或其它化學物質。
本發明的核酸分子，例如編碼HM74的核酸分子，可採用標準的分子生物學技術和序列(Nomura等人，同上文)被分離出。利用全部或部分的HM74序列，HM74核酸分子可採用標準的雜交和克隆技術來分離(例如Sambrook等人編輯，「Molecular CloningA Laboratory Manual，」第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)。
本發明的核酸分子可按照標準PCR擴增技術、採用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板和適宜的低聚核苷酸引物來擴增。如此擴增的核酸可被克隆進適宜的載體並以DNA序列分析法來鑑定。此外，與HM74核苷酸序列對應的低聚核苷酸可通過標準合成技術製備，例如採用自動化DNA合成儀。
而且，本發明的核酸分子可以只包括編碼HM74的核酸序列的一部分，例如，編碼當配體與之結合時將產生可檢測細胞內事件的胞外域和/或胞內結構域的片段。優選可檢測的細胞內事件是當HM74在正常宿主細胞中被激活時所觀察到的事件。
編碼「HM74的生物活性部分」的核酸片段可通過以下步驟來製備分離HM74中編碼具有HM74生物活性的多肽的部分，表達HM74蛋白的被編碼部分(例如通過體外重組表達)以及評估HM74被編碼部分的活性。
本發明還包括這樣的核酸分子它們由於遺傳密碼的簡併性而不同於所公開的HM74的核苷酸序列，因此編碼與先前所公開的HM74蛋白基本上相同的HM74蛋白。
本領域技術人員將會理解，導致HM74胺基酸序列變化的DNA序列多態現象可存在於一個種群(例如人群)內。由於天然等位基因變異，這種HM74編碼序列的遺傳多態現象可存在於一個種群的個體中。等位基因是這樣一組基因，它在特定遺傳位點替代出現。如本文所用的術語「基因」和「重組基因」指包含編碼HM74蛋白、優選哺乳動物HM74蛋白的可讀框的核酸分子。如本文所用的術語「等位基因變體」指出現在HM74位點的核苷酸序列或者核苷酸序列編碼的多肽。可選等位基因可通過對大量不同個體中的有關基因進行測序來鑑定。這可通過使用用以鑑定不同個體的相同遺傳位點的雜交探針來容易地進行。作為天然等位基因變異的結果且不改變HM74功能活性的任何及所有這類核苷酸變體以及所得的HM74中胺基酸的多態現象或變異均包括在本發明的範圍內。
此外，編碼源自其它物種的HM74蛋白(HM74同系物)並具有不同於人HM74但具有基本相同活性的核苷酸序列的核酸分子也包括在本發明的範圍內。基於與本文所公開的人HM74核酸的同一性，採用人cDNA或其部分作為雜交探針，按照標準雜交技術在嚴格的雜交條件下分離對應於天然等位基因變體和本發明的HM74cDNA同系物的核酸分子。
如本文所用的術語「在嚴格條件下雜交」旨在描述這樣的雜交和洗滌條件，在這些條件下核苷酸序列通常保持雜交狀態。這樣的嚴格條件對本領域技術人員而言是已知的，可在「分子生物學的現有方案」(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)。嚴格雜交條件的非限制性優選實例是於約45℃在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進行雜交，隨後於50-65℃在0.2×SSC，0.1％SDS中洗滌一遍或多遍。優選本發明的在嚴格條件下雜交為HM74序列或其互補序列的被分離核酸分子是天然產生的核酸分子。如本文所用的「天然產生的」核酸分子指具有天然產生(例如編碼天然蛋白)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
除了可存在於種群中的HM74序列的天然產生的等位基因變體，本領域技術人員將會進一步理解，變化可通過突變引入核苷酸序列，從而導致被編碼HM74中胺基酸序列的變化，而基本不改變HM74蛋白的生物活性。因此，可以進行核苷酸的取代，使得在「非必需」胺基酸殘基上發生胺基酸的取代。「非必需」胺基酸殘基是這樣一種殘基，它可從HM74的野生型序列改變而來，而生物活性基本未改變。「必需」胺基酸殘基是重要生物活性所需的胺基酸殘基。例如，在各物種的HM74中未保守或僅半保守的胺基酸殘基對活性而言可能是非必需的，因此很可能成為改變的靶點。或者，在各物種的HM74蛋白中保守的胺基酸殘基對活性而言可能是必需的，因此不大可能成為改變的靶點。
因此，本發明的另一方面涉及編碼HM74蛋白的核酸分子，其中所述HM74蛋白的對活性而言非必需的胺基酸殘基中包含了變化。這樣的HM74蛋白不同於已知的胺基酸序列但保留了生物活性。在一項實施方案中，被分離核酸分子包括編碼這樣的蛋白的核苷酸序列所述蛋白包括與已知的HM74胺基酸序列至少96％、97％、98％、99％或100％同一的胺基酸序列。
通過在已知的HM74的核苷酸序列上引入一個或多個核苷酸的取代、添加或刪除以使得一個或多個核苷酸的取代、添加或刪除引入被編碼蛋白內，可產生這樣的被分離核酸分子，它編碼具有不同於已知HM74的序列的HM74蛋白。
突變可通過標準技術引入，例如定點突變和PCR介導的突變。優選在一個或多個預期非必需胺基酸殘基上進行保守胺基酸的取代。「保守胺基酸的取代」指胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基替換。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本領域已有所定義。該家族包括具有如下側鏈的胺基酸鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)，酸性側鏈(例如天冬氨酸和穀氨酸)，不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)，β-分支的側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)以及芳香側鏈(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和組氨酸)。因此，HM74內的預期非必需胺基酸殘基優選被其它來自同一側鏈家族的胺基酸殘基替換。或者，可以沿全部或部分HM74編碼序列隨機引入突變，例如通過飽和誘變來引入，可篩選所得突變體的HM74生物活性以鑑定保留活性的突變體。在誘變後，被編碼蛋白可被重組表達，蛋白質的活性可以被測定。
可用於產生所研究核酸的被修飾的核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤等。
影響HM74功能的一種方式是影響HM74的表達。因此，可以操縱轉錄水平以使HM74mRNA的水平較低或較高，從而使細胞表面的HM74表達水平較低或較高。實現這種操縱的一種方式是利用可調節的啟動子。該啟動子可通過例如同源重組被引入基因組內靠近HM74編碼序列的適宜位點。
因此，本發明的另一方面涉及抗HM74抗體。本文所用的術語「抗體」指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結合抗原如HM74的抗原結合位點的分子。特異性結合HM74的分子指結合HM74但基本不結合樣品(例如天然含有HM74的生物樣品)中其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括F(ab)和F(ab′)2片段，它們可通過用酶如胃蛋白酶處理抗體而產生。本發明提供了結合HM74的多克隆和單克隆抗體。本文所用的術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合」指這樣的抗體分子群體，它們僅含有一類能夠與HM74的特定表位發生免疫反應的獨特型或抗原結合位點的克隆。因此，單克隆抗體組合通常顯示出對特定HM74蛋白表位的單一結合親合力。
如本領域內所知的，可以製備出各種其它抗原結合形式的抗體，包括片段、嵌合抗體、重組抗體、人源化抗體等。
本發明的另一方面涉及含有編碼HM74(或其部分)的核酸分子的載體、優選是表達載體。如本文所用的術語「載體」指能夠運載與它相連的其它核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，它指其它DNA片段可以連接上去的環狀雙鏈DNA環。另一類型的載體是病毒載體，其中其它DNA片段可連接到該病毒的基因組內。某些載體在宿主細胞內能自主複製(例如具有細菌複製起始區的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在被引入宿主細胞時被整合到宿主細胞的基因組內，因此與宿主基因組一起被複製。而且，某些載體(表達載體)能夠指導與它們可操作性連接的基因的表達。一般而言，用於重組DNA技術的表達載體通常是質粒(載體)形式。但是，本發明還意在包括起等效作用的其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
本發明的重組表達載體包括本發明的核酸，它是適於在宿主細胞內表達核酸的形式。這意味著，重組表達載體包括以用於表達的宿主細胞為基礎所選擇的一種或多種調控序列，該調控序列與欲表達的核酸可操作地連接。在重組表達載體內，所謂「可操作地連接」旨在表示所考慮的核苷酸序列以便於該核苷酸序列表達(例如在體外轉錄/翻譯系統內或當載體被引入宿主細胞時在宿主細胞內表達)的方式與調控序列連接。術語「調控序列」意在包括啟動子、增強子以及其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。文獻中描述了這類調控序列，例如Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology Vol.185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。調控序列包括在許多類型的宿主細胞內指導核苷酸序列組成性表達的調控序列(例如組織特異性的調控序列)。本領域技術人員應理解表達載體的設計可取決於諸如欲轉化的宿主細胞的選擇、所希望的蛋白表達水平等因素。本發明的表達載體可導入宿主細胞，從而產生由如本文所述的核酸編碼的蛋白質或肽(例如HM74、HM74的突變體形式、融合蛋白等)。
本發明的重組表達載體可設計用於HM74在原核或真核細胞內的表達，這些細胞為例如細菌細胞，如大腸桿菌，昆蟲細胞(使用杆狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞。上文提到的Goeddel一文對於適合的宿主細胞作了進一步討論。或者，重組表達載體也可以在體外轉錄和翻譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。
在另一實施方案中，HM74表達載體是酵母表達載體。在酵母，例如釀酒酵母(S.cerevisiae)內表達的載體實例包括pYepSecl(Baldari等人，EMBO J.(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等人，Cell(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等人，Gene(1987)54113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)，以及pPicZ(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。
或者，可使用杆狀病毒表達載體使得HM74在昆蟲細胞中表達。可在經培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質的杆狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等人，Virology(1989)17031-39)。
在另一實施方案中，使用了哺乳動物表達載體使得本發明的核酸被表達在哺乳動物細胞裡。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed，Nature(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等人，EMBO J.(1987)6187-195)。當用於哺乳動物細胞裡時，表達載體的控制功能通常是由病毒調控元件提供的。例如，常用的啟動子是從多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿病毒40衍生而來的。關於其它原核細胞和真核細胞的適宜表達系統，參閱上文提及的Sambrook等人的第16章和第17章。
對於哺乳動物細胞的穩定轉化，已知取決於所用的表達載體和轉化技術，只有一小部分細胞可以將外源DNA整合進基因組。為了鑑別和選擇整合體，通常將編碼選擇標記(例如對抗生素的抗性)的基因與目的基因一起導入宿主細胞。優選的選擇標記包括那些賦予對某些藥物例如G418、潮黴素和甲氨蝶呤的抗藥性的選擇標記。編碼選擇標記的核酸可導入宿主細胞內與編碼HM74的載體相同的載體，或可導入不同的載體。用所導入核酸穩定地轉染的細胞可通過藥物選擇來鑑定(例如整合了選擇標記基因的細胞將存活，而其它的細胞則死亡)。
與HM74結合併激活HM74的調節劑為氨磺醯氨茴酸，又稱為呋塞米類化合物。
該分子具有以下結構 其中R是氫；或C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時，X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中該環是可以是支鏈的並可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的並可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的並可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的並可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
術語「烷氧基」指與結合氧原子的烷基。其實例為甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。
「芳基」是芳香烴。其實例包括苯基和萘基。
「雜原子」通常是與分子內典型原子不同的原子。因此，對於烴而言，任何不是碳或氫的原子均是雜原子。常見的生物學可接受的雜原子包括氧、硫和氮。
術語「雜芳基」指其中一個或一個以上碳原子被雜原子代替的芳基。其實例為吡啶基、咪唑基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、嘧啶基、噠嗪基、吲哚基、喹啉基、二氮雜萘基和異唑基。
術語「環烷基」指環烴。其實例為環丙基、環丁基、環戊基和環己基。
「雜環」是其中一個或一個以上碳原子被雜原子替換的環烷基。其實例為吡咯烷基、哌啶基和哌嗪基。
術語「雜烷基」是其中一個或一個以上碳原子被雜原子替換的烷基。醚就是一種雜烷基。
術語「取代的」指基本有機基團具有一個或一個以上取代基。因此，原子或基團取代分子內的其它原子或基團。代表性的取代基包括滷素、C1-C8烷基、-CN、-NO2、烷氧基、羥基、硫化物、硫酸酯基、氨磺醯、氨基和醯氨基。
所研究的特定化合物是如下定義的那些1)當R是氫且Q是氧或硫時，則W不是氫，或者一個或兩個Z基團不是氫；2)當兩個Z基團、W和R是氫且Q是氧時，則X和Y組合在環結構內。
能夠產生生物相容的鹽的氨茴酸陽離子是鈉、鉀或銨基類的陽離子。
所研究的氨磺醯氨茴酸可按照美國第4,406,895和5,739,361號專利所提供的方法來製備。於是，按照本文所教導的方法製備了亞硝酸鹽中間體，其水解而產生所研究的對應的羧酸。然後，該羧酸又轉化為對應的鹽。
此類呋塞米化合物就是通常所稱的利尿劑。因此，使用這類化合物來調節HM74的做法是新穎且出乎意料的。
所研究的呋塞米類化合物能激活HM74，但不能激活HM74A。
本發明的呋塞米類化合物HM74調節劑，可摻入各種適合於給藥方式的藥物組合物。這類藥物組合物通常含有該活性成分和可藥用載體。如本文所用的術語「可藥用載體」旨在包括適合於藥物施用的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質和試劑用於醫藥活性物質的做法是本領域內眾所周知的。除了那些常規的介質或試劑與活性化合物不兼容的情況，這類介質和試劑在組合物內的使用是所預期的。輔助的活性化合物也可摻入組合物內。
本發明的藥物組合物是按照預定的給藥途徑而配製的。給藥途徑的實例包括胃腸道外途徑，例如靜脈內、皮內、皮下、口腔(例如吸入)、經皮(局部)、經黏膜和直腸給藥。用於胃腸道外途徑、皮內或皮下給藥的溶液或懸浮液可包括以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如EDTA；緩衝劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及滲透壓調節劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或鹼，例如HCl或NaOH來調節。腸胃外製劑可密封於安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料製成的多劑量小瓶。
適合於注射用的藥物組合物包括用於實時製備無菌注射液或分散劑的無菌水溶液(若為水溶性)或分散劑以及無菌粉末。對於靜脈內給藥，適合的載體包括生理鹽水，抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物都必須無菌而且應具有一定的流動性以便於注射。組合物在製造和儲存條件下必須是穩定的，必須加以防腐以防止微生物例如細菌和真菌的汙染。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液體聚乙二醇等)及其適宜混合物的溶劑或分散介質。為了維持適宜的流動性，可使用包衣，例如卵磷脂；若在分散劑的情況下，則可通過維持所需的顆粒大小來維持流動性；以及使用表面活性劑。為了預防微生物的作用，可使用多種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)等。在許多情況下，優選的是在該組合物內加入等滲劑，例如糖，多元醇，如甘露醇和山梨糖醇，以及氯化鈉。可注射型組合物的延遲吸收，可通過在組合物內加入延遲吸收的試劑而達到，例如加入單硬酯酸鋁和明膠。
無菌可注射溶液的製備是將所需量的該活性化合物根據需要與上述一種成分或幾種成分的組合置入適宜的溶劑中，隨後過濾除菌。通常，分散劑的製備是將該活性化合物摻入無菌載體，後者含有基本的分散介質以及所需的上面列舉的其它成分。對於用於製備無菌注射液的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥法和冷凍乾燥法，此法從先前經滅菌過濾的溶液產生該活性成分的粉末，再加入任何其它所需的成分。
口服藥物組合物一般含有惰性稀釋劑或可食用的載體。組合物可被密封在明膠膠囊內或被壓製成片劑。為了口服治療給藥的目的，該活性化合物可與賦形劑一起成型並以片劑、錠劑或膠囊劑的形式使用。口服組合物也可用某種液態載體製備成糖漿或液體製劑而作為漱口液使用，其中，液態載體中的化合物是經口腔途徑施用，或者漱口後吐出，或者咽下。
藥學上兼容的粘合劑和/或佐劑材料可作為藥物組合物的組成部分加入。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等可含有以下任何成分或性質類似的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸、Primogel(羥乙酸澱粉鈉)或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠體二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。
對於吸入給藥方式，該化合物可從含有適宜推進劑(例如二氧化碳類的氣體)的加壓容器、分配器或噴霧器以氣霧劑噴霧的形式給藥。
系統性給藥也可通過經黏膜或經皮給藥的方式。對於經黏膜或經皮給藥，在製劑中使用了透過滲透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本領域內是眾所周知的，例如，用於經黏膜給藥的滲透劑包括洗滌劑、膽汁鹽，以及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜給藥可通過使用鼻腔噴霧或栓劑來完成。對於經皮給藥，如本領域內眾所周知的，可將活性化合物配入軟膏、藥膏、凝膠或乳膏。
該化合物也可製成栓劑的形式(例如使用常規的栓劑基料，如可可脂和其它甘油脂)，或製成保留灌腸劑的形式用於直腸遞送。
在一個實施方案中，該活性化合物與某種防止該化合物過快地從體內清除的載體一起製成藥劑，例如控制釋放的劑型，包括植入物和微膠囊遞送系統。可以使用生物降解、生物兼容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。
製備這類製劑的方法對於本領域技術人員將是顯而易見的。各種材料也可以通過商業途徑從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.等公司購得。脂質體懸浮液(其含有與單克隆抗體一起靶向作用於被感染細胞的脂質體)也可用作為可藥用載體。這些載體可按照本領域技術人員已知的方法製備，例如，按照美國第4,522,811號專利所述的方法製備。
為了給藥方便和劑量一致，以劑量單位形式配製口服或胃腸道外給藥的組合物是特別有利的。本文中所謂的劑量單位形式指適合作為待治療患者的單位用量且物理上獨立的單位，每個單位含有根據所需的藥物載體而算出的預定量活性化合物，以產生所希望的治療效果。取決於疾病的類型和嚴重性，給患者輸入約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1至20mg/kg)的活性成分是一種可供選擇的初始劑量，無論是一次或多次地分別給藥，還是連續地注入。典型的日劑量範圍可從約1μg/kg至100mg/kg或以上，取決於以上提到的各種因素。對於幾天或更長時間的重複性給藥，根據具體情況，應維持治療直至出現所希望的抑制疾病症狀的效果。但是，其它劑量方案也是有用的。治療的進展情況可以容易地通過常規的技術和分析予以監測。WO 94/04188專利公開了一個示範性給藥方案。本發明的單位劑量形式的規格受制於且直接依賴於該活性化合物的獨特性質和所欲達到的具體治療效果，以及用於治療患者的這種活性化合物在配製技術方面的固有局限性。
該藥物組合物可密封在容器、包裝袋或分配器內，並附上使用說明。
所研究的HM74調節劑可用於各種篩選分析和治療方法(例如治療和預防)。所研究的HM74調節劑可用於篩選其它調節HM74活性或表達的藥物或化合物，也可用於治療其特徵為炎症的疾病。所研究的調節劑還可用於因HM74蛋白的產生不足或過度、或所產生的HM74蛋白類型與野生型HM74蛋白相比活性下降或異常而引起的各種情況。本發明還涉及通過本文所述的篩選試驗所鑑定的新穎HM74調節劑及其在治療方面的應用。
本發明提供了一種鑑定調節劑的方法(本文中又稱為「篩選分析」)。該調節劑也就是與HM74蛋白結合或對例如HM74的表達或HM74的活性具有刺激或抑制作用的候選或測試化合物或試劑，或測試化合物或試劑(例如肽、肽模擬物、小分子、抗體或其它藥物)。
在一個實施方案中，本發明提供了分析方法，以篩選那些可結合HM74或可調節其活性的候選化合物或測試化合物。因此，這些篩選分析方法可用於鑑定其它調節HM74的呋塞米類化合物。這些調節劑也可用於競爭分析法以鑑定其它調節劑，例如HM74拮抗劑。
在一個實施方案中，分析是以細胞為基礎而進行的。在該分析中，使在細胞表面表達膜結合形式HM74的細胞與測試化合物接觸，然後測定該測試化合物激活HM74的能力。該細胞例如可以是酵母細胞或源自哺乳動物的細胞。可通過以下方式來測試該測試化合物激活HM74的能力例如，使該測試化合物與放射性同位素或酶標記偶聯；這種偶聯使得可通過檢測與HM74形成的複合體中的標記化合物或HM74的定位來測定該測試化合物與HM74的結合。例如，可以用125I、35S、14C或3H直接地或間接地標記測試化合物，該放射性同位素可通過射電輻射(radioemission)直接計數或通過閃爍計數而測出。或者，該測試化合物可用例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶等酶促標記，該酶促標記可通過測定適宜底物向產物的轉化來檢測。在優選的實施方案中，該分析包括使在細胞表面表達膜結合形式HM74的細胞與結合HM74的已知化合物以及測試化合物接觸，然後確定該測試化合物與該已知化合物競爭性與HM74相互作用的能力。
在另一實施方案中，分析是基於細胞的分析。該分析包括使在細胞表面表達膜結合形式HM74的細胞與測試化合物接觸，然後測定該測試化合物調節(例如刺激或抑制)HM74活性的能力。例如，可通過測定該測試化合物激活或抑制HM74的能力來確定該測試化合物調節HM74活性的能力。當激活的HM74與信號通路相關的胞內或胞膜靶分子相互作用時，這一點可能就很清楚了。如本文所用的「靶分子」是指實際上與HM74結合或相互作用的分子，例如表達HM74的細胞表面上的分子、另一細胞表面的分子、胞外環境中的分子、與細胞膜的內表面結合的分子或細胞質分子。HM74靶分子可以是非HM74分子。在一個實施方案中，HM74靶分子是信號轉導通路的組分，它促進胞外信號(例如由於化合物與HM74的結合而產生的信號)經過細胞膜轉導進入該細胞。又如，靶分子也可以是具有催化活性的另一中細胞間蛋白質或促進下遊信號分子與HM74結合的蛋白質。
測定HM74與HM74靶分子結合或與HM74靶分子相互作用的能力，可以通過上述的一種測定直接結合的方法來實現。在優選的實施方案中，測定HM74與HM74靶分子結合或與HM74靶分子相互作用的能力，可以通過測定這些靶分子的活性來實現。例如，靶分子的活性可以通過以下方式來測定檢測該靶分子對細胞第二信使(例如胞內Ca2+、甘油二酯、IP3等)的誘導，檢測該靶分子對適宜底物的催化活性/酶活性，檢測報導基因(例如與編碼可檢測標誌例如螢光素酶的核酸可操作地連接的HM74應答調節元件)的誘導，或檢測細胞的應答例如細胞分化或細胞增殖。
在另一實施方案中，本發明的分析是一種無細胞分析，包括使HM74與測試化合物接觸，並確定該測試化合物與HM74結合的能力。如上所述，該測試化合物與HM74的結合可直接地或間接地測定。在優選的實施方案中，該分析包括使HM74與本發明的一種已知化合物和測試化合物同時接觸，並確定該測試化合物影響上述已知化合物的HM74活性的能力。確定該測試化合物與HM74相互作用的能力，包括確定該測試化合物與上述已知化合物的結合相比優先與HM74結合的能力。
在另一實施方案中，該分析是一種無細胞分析，包括使HM74與測試化合物接觸，並確定該測試化合物調節(例如刺激或抑制)HM74的活性的能力。確定該測試化合物調節HM74活性的能力，可利用上述的一種測定直接結合的方法，通過確定被激活的HM74與HM74靶分子結合的能力而實現。在備選實施方案中，確定該測試化合物調節HM74活性的能力，可通過確定HM74進一步調節HM74靶分子的能力來實現。例如，可按如上所述的方法來確定該靶分子對適宜底物的催化/酶促活性。
在另一實施方案中，該無細胞分析包括將HM74與可結合HM74已知化合物與測試化合物接觸，並測定該測試化合物與HM74相互作用的能力，其中，確定該測試化合物與HM74相互作用的能力包括確定該HM74與HM74靶分子優先結合或優先調節HM74靶分子活性的能力。
受體可被非配體分子激活，這些非配體分子未必抑制配體的結合但可引起受體的結構變化，從而使得G蛋白結合，或受體的聚集、二聚化或群集，這可引起活化。
本發明的無細胞分析既適用於可溶形式的HM74，也適用於膜結合形式的HM74。就包括膜結合形式HM74的無細胞分析而言，使用某種增溶劑也許是可取的，從而可使膜結合形式的HM74保持在溶液中。這類增溶劑的實例包括非離子型洗滌劑，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基-N-甲基葡萄糖醯胺、癸醯基-N-甲基葡萄糖醯胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、異十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽。
在另一實施方案中，當HM74被表達在宿主細胞上時，它受到改變而處於恆定的激活狀態。改變HM74可以使受體無需與配體結合即具有活性。使受體激活的一種方法是改變HM74，使的在未與配體結合的情況下即與G蛋白相互作用。這種改變模擬該受體在與配體結合時發生的構象變化，使得受體能夠結合胞內G蛋白。WO 00/22129提供了這樣的一種方法。
WO 00/22129教導了位於TM6和IC3區域中產生組成性活性的特定胺基酸。將這些特定胺基酸導入HM74的各種方法是本領域中已知的，例如定點誘變、亞克隆等方法。然後，被改變的HM74分子被表達在宿主細胞內，產生具有組成性活性的HM74。
被激活的細胞於是暴露於疑為HM74激動劑、拮抗劑、逆激動劑等的分子，即可改變HM74活性的分子。在藥物開發過程中用已知的方法靶定改變G蛋白活性的分子用於治療與HM74代謝改變相關的疾病。
在本發明上述分析方法的許多實施方案中，可能需要固定HM74或靶分子以促進其中任一種或兩種蛋白質的複合形式與非複合形式的分離，並便於實現分析的自動化。測試化合物與HM74的結合，或在候選化合物存在或不存在的情況下HM74與靶分子的相互作用，可在任何適合於容納該反應物的容器內實現。這類容器的實例包括微量滴定板、試管和微離心管。在一個實施方案中，可以提供融合蛋白，它增加了一個結構域使得上述任一種或兩種蛋白均可與基質結合。例如，穀胱甘肽-S-轉移酶/HM74融合蛋白、或穀胱甘肽-S-轉移酶/靶融合蛋白可被吸附在穀胱甘肽Sepharose珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)、或穀胱甘肽衍生的微量滴定板上。然後，該複合體再與測試化合物和未被吸附的靶蛋白或HM74蛋白結合，該混合物在有利於複合體形成的條件(例如在鹽和pH的生理條件)下溫育。溫育完畢後，洗滌Sepharose珠或微量滴定板孔，以除去任何未結合的組分，並例如按照如上所述的方法直接或間接地測量複合體的形成。或者，可將該複合體從基質上解離下來，並使用標準技術測定HM74結合或活性的水平。
其它將蛋白質固定在基質上的技術也可用於本發明的篩選分析中。例如，可利用生物素和鏈黴抗生物素蛋白的綴合固定HM74，或其靶分子。生物素化的HM74或靶分子可以用本領域內眾所周知的技術(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，從生物素-NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)來製備，並固定在包被鏈黴抗生物素蛋白的96孔板(PierceChemicals)內。或者，可與HM74或靶分子反應但不幹擾HM74蛋白與靶分子結合的抗體可在該板的孔內衍生，未結合的靶分子或HM74被抗體綴合而被捕獲在孔內。檢測這類複合體的方法，除了上述用於被穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)固定的複合體的方法以外，還包括使用易與HM74或靶分子反應的抗體所進行的複合體免疫檢測法，以及依賴於檢測HM74或靶分子相關酶活性的酶聯分析。
在另一實施方案中，HM74表達的調節劑通過以下方法得到了鑑定將細胞與候選化合物接觸，並測定HM74 mRNA或蛋白質在細胞中的表達。在該候選化合物存在和不存在這兩種情況下，對HM74 mRNA或蛋白質的表達水平進行了比較。然後，在上述比較的基礎上，該候選化合物即可被鑑定為HM74表達的調節劑。例如，如果該候選化合物存在時HM74mRNA或蛋白質的表達水平高於(統計學上顯著地高於)該候選化合物不存在時的表達水平，則該候選化合物即可被鑑定為HM74 mRNA或蛋白質表達的刺激劑或激動劑。或者，如果該候選化合物存在時HM74 mRNA或蛋白質的表達水平低於(統計學上顯著地低於)該候選化合物不存在時的表達水平，則該候選化合物即被鑑定為HM74 mRNA或蛋白質表達的抑制劑或拮抗劑。如果在配體或激動劑存在時，或在組成性HM74中，HM74的活性下降到基線以下，則該候選化合物即可被鑑定為逆激動劑。HM74mRNA或蛋白質在細胞內的表達水平，可通過本文所述的檢測HM74mRNA或蛋白質的方法測定。
可以製備大量的純HM74，也可確定可能的功能區的構象的物理特徵，以用於合理的藥物設計。例如，該分子的IC3區域和EC結構域都是特別值得注意的區域。一旦識別了某一區域的形狀和離子構型，就可以設計與這些區域相互作用的候選藥物，然後在完整的細胞、動物和患者中進行試驗。可產生這種結構信息的方法包括X-射線晶體學、核磁共振、分子建模等等。該3-D結構還可導致其它已知蛋白中類似構象部位的識別，對於這些部位存在著針對某特定部位起作用的已知藥物。這些藥物或其衍生物，也許可用於HM74。
本發明還涉及通過上述篩選分析所鑑定的新穎試劑及其治療用途。
對於與HM74的表達或活性異常相關的疾病，本發明為具有該疾病風險(或易患病的)人員或已經患有該疾病的患者提供了預防和治療的方法。這類疾病包括但不限於炎性疾病，例如，哮喘、慢性阻塞性肺病和類風溼性關節炎。
本發明的一個方面提供了通過給患者施用調節HM74的表達或調節至少一種HM74活性的治療劑，預防與HM74的表達或活性異常相關的疾病或狀況的方法。對於具有因HM74的表達或活性異常所引起或所促成的疾病風險的受試者，可以通過例如本文所述的診斷或預測分析方法的一種或數種的組合來鑑別。可在以HM74異常為特徵的症狀表現前施用預防性治療劑，從而可預防疾病或失調，或者延緩其進程。取決於HM74異常的類型，可用HM74激動劑或HM74拮抗劑對患者進行治療。根據本文所述的篩選分析，可以確定合適的治療劑。
本發明的另一個方面涉及出於治療目的而調節HM74的表達或活性的方法。本發明的調節方法涉及讓細胞接觸可調節與細胞結合的HM74的一種或多種活性的試劑。調節HM74活性的試劑可以是本文所述的試劑，例如呋塞米、核酸或者蛋白質、HM74蛋白的天然存在的同源配體、肽、HM74肽模擬物或其它小分子。在一個實施方案中，該試劑能刺激HM74的一種或多種生物學活性。在另一實施方案中，該試劑能抑制HM74蛋白的一種或多種生物學活性。這種抑制性試劑的實例包括抗HM74抗體。這些調節方法可以在體外實現(例如將細胞與該試劑一起培養)，或備選地也可以在體內實現(例如對患者施用該試劑)。同樣地，本發明提供了對患有以HM74的異常表達或異常活性為特徵的疾病或失調的患者進行治療的治療方法。在一個實施方案中，該方法涉及施用調節(例如上調或下調)HM74的表達或活性的試劑(例如通過本文所述的篩選分析方法鑑定的試劑)或多種試劑的組合。
在HM74被異常下調的情況下和/或在HM74活性的提高可能產生有益效果的情況下，刺激HM74的活性是可取的。反之，在HM74被異常上調情況下和/或在HM74活性的降低很可能產生有益效果的情況下，抑制HM74的活性是可取的。
本發明將通過以下實施例進一步說明，但它們不應被解釋為是限制性的。本申請自始至終引用的所有文獻、專利和公開的專利申請均引入本文作為參考。
實施例1-表達HM74的哺乳動物細胞的製備編碼hHM74的cDNA被克隆入表達載體並轉染入哺乳動物細胞，例如CHO細胞或293細胞。
為了製備過表達HM74的哺乳動物細胞，將哺乳動物細胞接種於6孔35mm組織培養板中(每孔3×105個哺乳動物細胞(美國典型培養物保藏中心(ATCC)目錄號CRL-1573))，每孔加2ml含10％胎牛血清(Gibco/BRL公司，目錄號1600-044)的DMEM培養基(Gibco/BRL公司，目錄號11765-054)。
然後，將細胞置於CO2培養箱中37℃下培育，直至細胞為50-80％匯合。將所克隆的HM74cDNA核酸序列插入pcDNA3.1克隆載體中(Invitrogen公司，目錄號V790-20)。用100μl無血清F12 Ham培養基稀釋2μg DNA。另取25μl Lipofectamine試劑(Life Technologies公司，目錄號18324-020)，用100μl無血清F12 Ham培養基稀釋。然後將DNA溶液和Lipofectamine溶液緩緩混合，於室溫下培養45分鐘，以形成DNA-脂質複合體。
將細胞用2ml無血清F12 Ham培養基洗滌一次。對於每一次轉染(每塊6孔板上共6次轉染)，分別將0.8ml無血清F12 Ham培養基加入含有DNA-脂質複合體的溶液(總體積0.2毫升)中，並緩緩混勻。然後將所產生的混合物(以下稱為「轉染混合物」)覆蓋(0.8ml+0.2ml)在洗滌過的細胞上。不加抗細菌試劑。再將細胞與脂質-DNA複合體一起置於CO2培養箱中於37℃共同培養16小時以發生轉染。
培養結束後，保留該轉染混合物，並在細胞上覆蓋1ml含10％胎牛血清的F12 Ham培養基。轉染18小時後，吸出覆蓋在細胞上的培養基。然後用pH 2-4的PBS(Gibco/BRL公司，目錄號10010-023)洗滌細胞，棄去PBS再加入含5％血清的F12 Ham培養基(「選擇培養基」)。轉染後72小時後，用含有400μg/ml抗細菌劑遺傳黴素(Life Technologies公司，目錄號11811)的選擇培養基將細胞稀釋10倍。
實施例2-激動劑分析為了篩選人HM74的激動劑，可將HM74以人工方式偶聯Gq機制。Gq機制的激活可刺激Ca2+從細胞內部肌質網囊泡的釋放。Ca2+被釋放進細胞質後，可用Ca2+螯合染料檢測。用螢光成像板讀數器(FluorometricImaging Plate Reader)或FLIPR裝置(Molecular Devices公司)監測所產生的任何螢光變化。激動劑的活性通過螢光強度的增加得到反映。
表達HM74的CHO-Kl細胞預先工程化為表達某種無差別形式的Gq蛋白(Gα16)。為了製備這種細胞，購買了Gα16-偶聯的CHO細胞(MolecularDevices公司的LIVEWARETM細胞，目錄號RD-HGA16)，並遵循實施例1的方案，使得在這些細胞中表達HM74。
將細胞置於含10％胎牛血清、100IU/ml青黴素(Gibco/BRL公司，目錄號15140-148)、100μg/ml鏈黴素(目錄號15140-148，Gibco/BRL公司)、400μg/ml遺傳黴素(G418)(Gibco/BRL公司，目錄號10131-035)和200μg/ml zeocin(Invitrogen公司，目錄號R250-05)的F12 Ham培養基(Gibco/BRL公司，目錄號11765-054)內，並於37℃和5％CO2的條件下維持在對數生長期。在進行分析前一天，使用96/384孔多點加樣器(Multidrop device)(Labsystems公司，832型)將CHO-K1細胞按照12,500細胞/孔接種於每孔體積為50μl的384孔透明底分析板上(Greiner/Marsh公司，目錄號N58102)。將細胞置於37℃含5％CO2的加溼培養箱中培養(Forma Scientific公司3110型水夾套CO2培養箱)。
製備以下儲備液1M Hepes儲備液(pH 7.5)(Gibco/BRL公司，目錄號15630-080)；用1N NaOH配製的250mM羧苯磺胺儲備液(Sigma公司，目錄號P8761)；以及用DMSO(Sigma公司D2650)配製的1mM Fluo4-AM染料儲備液(Molecular Probes公司，目錄號Fl 4202)。反應緩衝液用1000ml的Hank′s平衡鹽溶液(Fisher/Mediatech公司，目錄號MT21023)、20ml的1M Hepes儲備液以及10ml的250mM羧苯磺胺儲備液配製。加樣緩衝液的配製將1.6ml的1mM Fluo 4-AM染料儲備液與0.32ml的普魯蘭尼克酸(pluronic acid)(Molecular Probes公司，目錄號P6866)混合，然後與400ml上述反應緩衝液以及4ml胎牛血清混合。
在進行分析前1小時，用96/384孔多點加樣器吸取新製備的加樣緩衝液，按每孔50μl加入384孔板中。將細胞置於37℃加溼培養箱中培養以達到最大染料吸收。在即將開始分析的前，用384孔EMBLA細胞洗滌器(Skatron公司，型號12386)於每孔加90μl反應緩衝液洗滌細胞2次。洗滌時吸頭至少高於板底10mm，每孔保留45μl緩衝液。
將FLIPRII儀器(Molecular Devices公司)上CCD攝像機(PrincetonInstruments公司)的光圈刻度(f-stop)調到2.0，曝光時間調到0.4秒。該攝像機是用於監測細胞板染料負荷的精確度。
在生理鹽緩衝液中以每孔約為10μM的濃度條件下，檢驗可能含有呋塞米類化合物的化合物庫。在加入化合物前10秒測量螢光的變化。加入化合物的後，第一分鐘每秒測量一次螢光，然後，每6秒鐘曝光一次，總的實驗分析時間為3分鐘。第10次掃描後，按5μl等份試樣加入100μM化合物儲備液，使細胞上最終的化合物濃度為10μM。記錄最初80次掃描的最大螢光變化值，作為激動劑活性的測量，並與以10μM ATP(Sigma公司A9062)誘導的最大螢光變化值進行比較。
經發現，多種呋塞米類化合物均可激活HM74。
實施例3-拮抗劑分析為了篩選人HM74的拮抗劑，可將HM74以人工方式偶聯到Gq機制。與實施例2一樣，可用FLIPR儀器監測螢光的變化。拮抗劑的活性通過螢光強度的減小得到反映。
如同實施例2所述，表達HM74的CHO-Kl細胞預先工程化為可表達無差別形式的Gq蛋白(Gα16)。將細胞置於含10％胎牛血清、100lU/ml青黴素(Gibco/BRL公司，目錄號15140-148)、100μg/ml鏈黴素(目錄號15140-148，Gibco/BRL公司)、400μg/ml遺傳黴素(G418)(Gibco/BRL公司，目錄號10131-035)和200μg/ml zeocin(Invitrogen公司，目錄號R250-05)的F12Ham培養基(Gibco/BRL公司，目錄號11765-054)內，並於37℃和5％CO2的條件下維持在對數生長期。在進行分析前一天，使用96/384孔多點加樣器將CHO-K1細胞按照12,500細胞/孔接種於每孔體積為50μl的384孔黑色透明底分析板上(Greiner/Marsh公司，目錄號N58102)。將細胞置於37℃含5％CO2的加溼培養箱中培養。
製備以下儲備液1M Hepes儲備液(pH 7.5)(Gibco/BRL公司，目錄號15630-080)；用1N NaOH配製的250mM羧苯磺胺儲備液(Sigma公司，目錄號P8761)；用DMSO(Sigma公司D2650)配製的1mM Fluo 4-AM染料儲備液(Molecular Probes公司，目錄號Fl4202)；以及配體或拮抗劑的儲備液。反應緩衝液用1000ml的Hank′s平衡鹽溶液(Fisher/Mediatech公司，目錄號MT21023)、20ml的1M Hepes儲備液以及10ml的250mM羧苯磺胺儲備液以及1mM CaCl2配製。加樣緩衝液的配製將80μl的1mM Fluo 4-AM染料儲備液與16μl普魯蘭尼克酸(pluronicacid)(Molecular Probes公司，目錄號P6866)混合，然後與20ml上述反應緩衝液以及0.2ml胎牛血清混合。
在進行分析前30分鐘，用96/384孔多點加樣器吸取新製備的加樣緩衝液，按每孔30μl加入384孔板中。將細胞置於37℃加溼CO2培養箱中培養以達到最大染色吸收。在即將開始分析的前，用384孔EMBLA細胞洗滌器於每孔加100μl反應緩衝液洗滌細胞3次。洗滌時吸頭至少高出板底40mm，每孔保留45μl緩衝液。
用Platemate 384移液器(Matrix公司)吸取5μl的100μM拮抗劑化合物儲備液加入細胞中。在培養過程中，該化合物濃度約為10μM。將細胞置於FLIPRII中，第一分鐘每秒測量一次培養板的螢光，然後，每6秒鐘曝光一次，總的實驗分析時間為3分鐘。在第10次掃描的後，加入拮抗劑或配體(10μM)。每次加樣後，384移液器加樣頭用20μl的0.01％DMSO水溶液洗滌10次。
在用候選拮抗劑檢驗，可以使M74細胞接觸或不接觸已鑑定的激動劑。
實施例4-受體結合分析為了製備包含HM74的細胞膜級分，在含有1mM EDTA的磷酸鹽緩衝鹽水(10ml)中培養後收集表達HM74的CHO細胞系。在重新懸浮於5ml緩衝液A(50mM Tris-HCl(pH 7.8)(Sigma公司T6791)、5mM MgCl2(Sigma公司M8266)以及1mM EGTA(Sigma公司0396))前，用含有1mMEDTA(10ml)的磷酸鹽緩衝鹽水再洗滌細胞3次。
然後，用組織勻漿器(Polytron公司，Kinemetica，PT 10/35型)將細胞打碎1分鐘。將所產生的勻漿用Sorvall Instruments公司的RC3B冷凍離心機以49,000Xg於4℃離心20分鐘。將所產生的沉澱物重新懸浮於25ml緩衝液A中，並重複離心步驟3次。最後一次離心後，將該沉澱物再次重新懸浮於5ml緩衝液A中，等分試樣並儲存於-70℃。
用細胞膜級分並以放射性標記的所研究的激動劑作為示蹤劑進行受體結合分析。分析在96孔板(Beckman儀器公司)中進行。該結合反應物為18μg的CHO細胞製備物，在放射性激動劑(0.01nM-25nM)存在的條件下，最終體積為0.2ml的含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma公司，目錄號34287)的緩衝液A組成(參閱Im等人，J.Biol.Chem.(2000)275(19)14281-14286)。在室溫下溫育該反應物1小時。通過用多通道收集器(Brandell)上的Whatman GF/C過濾器進行過濾而終止反應，該多通道收集器預先用0.3％聚乙烯亞胺(Sigma公司，目錄號P3143)和0.1％牛血清白蛋白(BSA)處理1小時。將混合物加入過濾器並培養1小時。過濾器用1ml pH值為7.6的冰冷50mM Tris-HCl溶液洗滌6次。基於對於每種示蹤劑濃度，通過放射性測定的總結合與非特異性結合(背景)間的差異計算特異結合。取8至16個濃度數據點，以確定在激動劑與受體間的平衡狀態下實現的激動劑與受體的結合(平衡結合參數)。在競爭性分析試驗中，將試驗性化合物加入該混合物，在與受體上放射性激動劑的結合競爭(競爭結合值)。繪製抑制曲線以確定實現結合的50％抑制所需的濃度(IC50)。
實施例5-小分子激動劑如上所述，使一系列呋塞米類分子接觸表達HM74的細胞。對靶分子進行標記以確定是否發生與HM74的結合。通過測定細胞洗滌後的標記程度來檢測這種結合。還通過二維凝膠電泳法分離HM74以及測定與該蛋白質相關的標記程度來確定這種結合。這種結合評估後，或獨立於這種結合評估，確定了候選激動劑激活HM74的能力。FLIPR分析用於評價當靶分子與HM74結合時胞內的鈣動員。如此鑑定了引起鈣動員的分子。
現在已經描述了本發明，技術人員將會知道，可以對本文的教導做出多種改變和修改，而不背離本文教導的本發明的精神和範圍。
本文中所引用的所有文獻均以其整體引用作為參考。
權利要求
1.在需要治療的患者體內調節HM74信號傳導活性或信號轉導的治療方法，其包括對所述患者施用具有以下結構的分子 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中所述環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
2.鑑定HM74激動劑的方法，其包括用表達HM74的細胞接觸潛在的激動劑，並確定在所述潛在的激動劑存在的情況下，相對於所述潛在的激動劑不存在的情況，HM74的信號傳遞活性是否增加，其中上述潛在的激動劑具有以下結構 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中所述環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
3.鑑定HM74逆激動劑的方法，其包括用表達HM74的細胞接觸潛在的逆激動劑，並確定在所述潛在的逆激動劑存在的情況下，HM74的活性相對於所述潛在的逆激動劑不存在的情況下HM74的活性是否下降，以及在激動劑存在的情況下是否下降，其中所述潛在的逆激動劑具有以下結構 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中所述環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
4.鑑定HM74拮抗劑的方法，其包括用表達HM74的細胞接觸潛在的拮抗劑，並確定在所述潛在的拮抗劑存在的情況下，相對於激動劑存在的情況下HM74的活性，HM74的信號傳遞活性是否下降，其中所述潛在的拮抗劑具有以下結構 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中所述環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
5.下式的化合物 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中所述環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
6.調節炎症的方法，其包括將需要治療的患者接觸炎症調節量的藥物組合物，該組合物包含下式的化合物 其中R是氫；或者是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合；Q和X各自是O、S或NR；Y是C1-C18烷基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18鏈烯基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C1-C18炔基，其可以是支鏈的、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；C3-C18芳基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或C5-C18環烷基，其可含有側基、可含有橋基、可含有雜原子或可以被取代或者是它們的組合情形；或它們的組合，其中當X是N時X和Y可被稠合進一個或一個以上的環，其中所述環是可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜環，可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18雜芳基，可以是支鏈的和可含有側基的被取代的C3-C18環烷基，或者可以是支鏈的和可含有側基的C3-C18芳基；以及Z各自是R。
全文摘要
對HM74受體有激動劑活性的呋塞米類分子，其具有以下結構式(I)；和它們治療炎性疾病的用途。
文檔編號C07D333/20GK1921845SQ200580005457
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月10日 優先權日2004年2月20日
發明者A·明尼希, T·孔茨韋勒, H·埃辛德雷羅, M·安格斯特羅, H-J·朗 申請人:安萬特藥物公司, 塞諾菲-安萬特德國有限公司