Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特異性肽抑制劑/激活劑的製作方法
2023-06-15 01:06:41
專利名稱：Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特異性肽抑制劑/激活劑的製作方法
Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特異性肽抑制劑/激活劑 相關申請的交叉引用
本申請要求2006年10月31日提交的美國臨時申請號60/855，482 的權益，將其公開內容引入本文作為參考。
關於聯邦政府資助的研究的申明
本發明在政府支持下做出並且根據國家心臟、肺和血液研究所(美 國公共衛生部，健康和人類服務部)授予的美國國立衛生研究院項目 HL-36573和HL-67963,政府在本發明中享有權利。
本發明的技術領域和工業實用性
所鑑定的肽可用作用於治療癌症和其他疾病的治療劑和/或作為 開發更好的治療劑的促進劑，在所述疾病中，Src和Src家族激酶或 者高度升高或者在遺傳上和/或功能上被降低。這些疾病狀態包括但不 限於，白血病、前列腺癌和乳腺癌、缺血/再灌注損傷、尿毒症心肌病、 高血壓、心臟纖維質生成和缺乏心肌收縮力。此外，如所鑑定的肽證 實的，可能利用新發現的Na+/K+-ATP酶/Src受體複合體作為靶標用 於開發新的受體激動劑和拮抗劑以及新的Src和Src家族激酶抑制劑 和激活劑。
背景技術：
強心類固醇(CTS)由一組特異結合Na+/K+-ATP酶的化學物質組 成。它們包括植物來源的毛地黃藥物(如地高辛和烏本苷)和脊推動 物來源的糖苷配基(如蟾蜍靈和海蟾蜍靈)。最近的研究已經將烏本 苷和海蟾蜍靈鑑定為內源類固醇，其產生和分泌受到多種生理和病理 學刺激，包括人類中的血管緊張肽II和腎上腺素的調控。這些類固醇可以激活蛋白質激酶和調控細胞生長、基因表達、細胞內鉤和活性氧
(R0S)濃度，從而在控制腎和心血管功能、保護缺血/再灌注損傷和 刺激或抑制細胞生長中起重要作用。
Src家族激酶是52-62 kDa膜結合的非受體酪氨酸激酶並且它們 應答多種細胞外配體而參與幾種酪氨酸磷酸化相關的信號通路。例如， Src含有至少三個重要的蛋白質相互作用結構域。SH3結構域結合到聚 脯氨酸基序並且SH2結構域與磷酸化的酪氨酸殘基相互作用。該激酶 結構域與核苷酸反應並磷酸化底物。蛋白質配體與SH3或SH2結構域 的結合可以激活Src。也報導結合Src的激酶結構域的蛋白質能夠調 控Src活性。
Na+/K+-ATP酶——細胞鈉泵的分子機器，屬於在進化上遠古的酶 家族，其將ATP的水解與膜離子轉運相偶聯。現在認為Na+/K+-ATP 酶具有雙重功能。它不僅將Na+和K+泵穿過細胞膜，而且通過不同激 活蛋白激酶將細胞外CTS信號傳遞到細胞內區室。
特別地，發明人發現Na+/K+-ATP酶與Src和Src家族激酶相互作 用形成功能性受體。烏本苷與該受體的結合激活Src，其又磷酸化多 種效應子，導致不同通路(包括Ras/Raf/ERKl/2和磷脂酶C/蛋白激 酶C級聯)的裝配和激活以及細胞內Ca'+和細胞R0S產生的增加。這 些信號通路的激活最終導致心臟和腎功能的改變，刺激細胞增殖和組 織纖維質生成，保護組織抵抗缺血/再灌注損傷和抑制癌細胞生長。這 些效應以組織/細胞特異性方式發生。
因為Src和Src家族激酶在細胞信號轉導中起重要作用，所以許
多研究人員參與尋找激酶特異性和通路特異性抑制劑。迄今為止，已 經開發了許多抑制劑，並且它們中的多數被開發為ATP類似物，其與 ATP竟爭對這些激酶的結合，導致對激酶活性的抑制。然而，缺乏通 路特異性是當前的Src抑制劑的主要缺點。因為Src和Src家族激酶
對於許多細胞功能是必須的，因此一般性抑制可以損害治療的總體益 處。過去，這已經通過這些抑制劑在動物研究中的嚴重副作用所證實。 此外，這些抑制劑中的一些顯示出對受體酪氨酸激酶的交叉活性。強心類固醇已經被用作治療充血性心力衰竭和其他心臟病的藥
物，因為它們增加細胞內Ca"從而增加收縮力。然而，這些化學品不 僅激活Na+/K+-ATP酶相關的細胞信號傳導通路，而且抑制^+/1[+-人丁？ 酶的離子泵功能。後者促進了它們的臨床副作用並且限制了這些藥物 的臨床應用。內源強心類固醇是調控腎臟和心血管功能的激素。已知 這些激素對新發現的Na+/K+-ATP酶/Src的過度刺激引起高血壓並在 腎臟上皮細胞中誘導異常細胞增殖以及誘導組織纖維質生成。
考慮到上述問題，清楚的是本領域中仍然需要開發通路(例如， Na+/K+-ATP酶)特異性Src抑制劑或激活劑的方法，所述抑制劑或激 活劑可以用於阻斷內源CTS激活的Src通路或者刺激Na+/K+-ATP酶相 關的Src以模擬CTS效應而不抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能。此外， 需要乾向新發現的Na+/K+-ATP酶/Src受體複合體以開發該受體的新 型激動劑或拮抗劑，從而使得Na+/K+-ATP酶/Src複合體的受體功能 可以;故刺激以治療疾病，如充血性心力衰竭和缺血/再灌注損傷，或者 被抑制以治療疾病，如組織纖維質生成和癌症。
還需要監測31:(;與^+/"47 酶的相互作用和激酶酶促活性的測
定法，所述測定法是靈敏的、容易使用，並且適應於高通量篩選方法。 還需要分離參與蛋白質-蛋白質相互作用的操作上確定的配體和 最佳地鑑定一組詳盡的參與配體結合的含有模塊結構域的蛋白質的方 法。
然而，如果這種方法可以得到，這種方法將可用於分離具有任何 目的功能結構域的功能形式的任何多肽。
此類一般性方法將具有巨大的實用性，因為可以鑑定相關蛋白的 完整家族，其中每個蛋白具有其自身形式的目的功能結構域。此類相 關蛋白質的知識將為我們理解多種生理學過程貢獻巨大，所述生理學 過程包括細胞生長或死亡、惡性腫瘤、腎臟/心血管功能和免疫反應，等等。
此類方法將也促進開發更有效的具有更少副作用的治療劑、診斷 劑或預防劑。根據本發明，提供了這樣的方法。 發明概述
一方面，本文提供了調控Src及其下遊信號傳導通路的方法，其 包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結合。
另一方面，本文提供了誘導烏本苷引起的信號轉導的受體，其包 含Na+/K+-ATP酶/Src或Src家族激酶的複合體。
另一方面，本文提供了靶標，其包含^+/"-ATP酶和Src或Src 家族激酶之間的相互作用位點。
另一方面，本文提供了藥物組合物，其用於調控涉及控制細胞生 長、運動性、活性氧類別(R0S)的產生、por-膠原合成和肌肉收縮的 多種信號傳導通路，所述組合物包含一種或多種Src和Src家族激酶 抑制劑或激活劑。在一些實施方案中，該組合物包含一種或多種肽或 肽片段，其抑制或刺激Na+/K+- ATP酶的信號傳導功能並且不抑制 Na+/K+- ATP酶的離子泵功能。而且，在一些實施方案中，所述抑制 劑不直接與ATP竟爭。
另 一方面，本文提供了包含Na+/K+-ATP酶或Src序列的Src抑制 劑或激活劑，其幹擾Src和Na+/K+- ATP酶之間的相互作用，通過與 ATP類似物不同的機理髮揮作用，並且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性 的。
另一方面，本文提供了治療組合物，其包含至少一種如本文所述 的肽Src抑制劑或激活劑。
另一方面，本文提供了開發小分子的方法，所述小分子模擬肽抑 製劑或激活劑，通過與ATP類似物不同的機理髮揮作用，並且是通路 (Na+/K+-ATP酶)特異性的。
另一方面，本文提供了包含^+/1^+41 酶的信號轉導物，其介導 與癌細胞生長、心臟纖維質生成、缺血/再灌注損傷、肌肉收縮或尿毒 症心肌病有關的一種或多種信號傳導通路。
另一方面，本文提供了包含在Src或Na+/K+-ATP酶oc 1亞基中發現的功能結構域的組合物，其中Na+/K+~ATP酶介導的對Src的抑制是 由於所述a亞基或其他P型ATP酶的a亞基的N結構域和Src激酶結 構域之間的相互作用。
另一方面，本文提供了包含ND1肽，或其片段的組合物。
另一方面，本文提供了來自ND1的肽，其足夠結合Src以及其他 Src家族激酶，包括但不限於Lyn,和抑制它們的活性。
另一方面，本文提供了來自Src激酶結構域(KDl)或來自其他Src 家族激酶的類似結構域的肽，其能夠與Na+/K+-ATP酶結合併通過竟爭 Src的結合基序而有效激活Na+/K+-ATP酶抑制的Src。
另 一方面，本文提供了用於激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性 Src或Src家族激酶的肽。
另一方面，本文提供了包含肽或其片段的Src抑制劑和/或激活 劑，所述肽或其片段靶向i)與Na+/K+-ATP酶或者Src特異相互作用 而不是竟爭ATP結合，和ii)提供Src活性的通路特異性調節的區域。
另一方面，本文提供了各Src家族激酶的同種型特異性Src抑制 劑和/或激活劑，所述激酶包括具有序列或其片段的激酶，其中使用也 結合該激酶結構域的Na+/K+-ATP酶的一個或多個cx亞基開發所述序 列或其片段。
另一方面，本文提供了小分子，其包含如本文所述的同種型特異 性Src抑制劑和/或激活劑。
另一方面，本文提供了用於大規模和高通量篩選的快速篩選測定 法，其包含Na+/K+-ATP酶和至少一種Src或Src家族激酶之間的相互 作用。
另一方面，本文提供了治療蛋白激酶相關的疾病狀態的方法，該 方法包括對需要其的受試者施用治療有效量的至少一種如本文所述的 組合物。
另一方面，本文提供了方法，其中所述疾病狀態涉及使用Src或 Src家族激酶作為效應物的非受體酪氨酸激酶或者受體酪氨酸激酶。 另一方面，本文提供了方法，其中所述疾病狀態涉及包括Src的細胞酪氨酸激酶。
另一方面，本文提供了方法，其中所述疾病狀態包括癌症或者腎 髒或心血管相關的疾病。
另一方面，本文提供了物質的組合物，其包含a)具有5到50 個胺基酸長度的肽，該肽包含選自任一種如本文所述的肽序列的基序 和b)第一種可檢測的部分，其中所述第一種可檢測的部分與該肽結 合。
另一方面，本文提供了組合物，其包含
圖19B中所示的序列[SEQ ID NO l]或者基於該序列開發。
另一方面，本文提供了組合物，其包含圖20B中所示的序列[SEQ ID NO 34]或者基於該序列開發。
另一方面，本文提供了組合物，其包含圖24A中所示的肽序列[SEQ ID NO 2]或者基於該肽序列開發。
另一方面，本文提供了組合物，其包含Na+/K+-ATP酶和Src或 Src家族激酶之間相互作用的結構信息或者基於該信息開發。
另一方面，本文提供了小分子Src抑制劑或激活劑，其被開發以 耙向Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用或基於該相 互作用開發。
另一方面，本文提供了 Src抑制劑或激活劑，其基於NA+/K+-ATP 酶或其他P-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用開發。
另一方面，本文提供了開發鑑定的Na+/K+-ATP酶/Src受體複合
體的激動劑或拮抗劑的方法。
另一方面，本文提供了組合物，其包含基於Na+/K+-ATP酶/Src
複合體開發的激動劑或拮抗劑。
另一方面，本文提供了治療組合物，其包含至少一種如本文所述
的激動劑或拮抗劑。
另 一方面，本文提供了在培養的細胞中操作細胞Na+/K+-ATP酶的 方法，其包括用A4 siRNA表達栽體轉染細胞，從而降低克隆的細胞中 Na/K-ATP酶的表達。另一方面，本文提供了至少部分沉默培養的細胞中內源Otl的表
達的方法，其包括用A4 siRM表達載體轉染細胞，從而降低克隆的細 胞中ocl的表達。
另 一方面，本文提供了耗盡內源Na+/K+-ATP酶而不需要使用烏本 苷以迫使表達轉染的化+/1(+47 酶的方法，其包括使用A4 siRNA以 沉默來自希望的物種(包括人和豬)的細胞中的al表達。
另一方面，本文提供了包含GST-NT (胺基酸殘基6-90) [SEQ ID NO 51]的表達載體。
另一方面，本文提供了包含GST-CD2(胺基酸殘基152-288 ) [SEQ ID NO 52]的表達栽體。
另一方面，本文提供了包含GST-CD3(胺基酸殘基350-785 ) [SEQ ID NO 53]的表達載體。
另一方面，本文提供了包含GST-H+ /K+-CD3 [SEQ ID NO 54]的 構建體。
另一方面，本文提供了包含GST-SERCA-CD3 [SEQ ID NO 55]的構 建體。
另一方面，本文提供了基於siRNA的測定法，其經配置以測定 ^+/+47 酶的量和性質的改變對基礎的和烏本苷刺激的Src活性的 影響。
另一方面，本文提供了用於測定外源的/突變的cxl的信號傳導功 能的a 1耗盡細胞，該細胞通過用oc 1表達栽體轉染敲減(knockdown) 的細胞來製備，所述載體中A4 siRNA靶向的序列被沉默突變，其中外 源al被敲入並且al的表達被恢復，不僅總的細胞^+/"-ATP酶蛋 白，而且Na+/K+-ATP酶活性都被恢復。
當按照附圖閱讀時，根據下面優選實施方案的詳述，本發明的多 種目標和優點將對於本領域技術人員變得顯而易見。
附圖簡述
圖IA和B. LLC-PK1細胞中Na+ZK+-ATP酶和Src之間的相互作用。圖1A.在1024 X 1024像素解析度下，1^0~ 0細胞中^+"+-人丁？ 酶(紅色)和Src (綠色)的共定位。左邊和中間的圖像分別顯示了 Na+/K+-ATP酶a 1和Src的膜定位，合併的圖像(右邊)顯示了這兩 種蛋白質的共定位。比例尺20 |am。
圖IB. LLC-PK1細胞中EYFP-大鼠al (黃色)和Src-ECFP (青 色)之間相互作用的螢光共振能量轉移(FRET)分析。加方框的區域 (R0I1)被光漂白並且就FRET進行分析。發明人也測量了沒有被光漂 白的環形區域(ROI 2)處的FRET。在來自6個獨立實驗的16個細胞 中進行了相同的實驗。比例尺8 pm。
圖2A-D.純化的豬腎化+/1+4丁？酶(PKE)與GST-Src的結合。 將純化的Na+/K+-ATP酶溶解在1% Triton X-100中。以100, 000 X g 離心後，將所示量的澄清的上清液與5 |ig GST-Src在0.5% Triton X-100存在下溫育30分鐘，接著用相同緩衝液洗滌四次。
圖2A和2B.考馬斯藍染色的GST-Src和純化的Na+/K+-ATP酶 (PKE)。
圖2C.來自三個獨立實驗的代表性蛋白質印跡，顯示了用抗 Na+/K+-ATP酶a 1抗體檢測的pulldown產物。
圖2D.進行與C中相同的pulldown測定法並將650 ng (總輸入 的三分之一)純化的^+/"4了？酶(PKE)酶直接作為輸入對照裝載。
圖3A-C.鑑定涉及與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src結構域
圖3A. Src結構的圖示。
圖3B. GST-Src、 GST-SH2、 GST-SH3、 GST-SH3SH2和GST激酶的 考馬斯藍染色。
圖3C. GST-Src、 GST-SH3SH2、 GST-激酶、GST-SH2，但非GST-SH3 結構域與Na+/K+-ATP酶的結合。純化的Na+/K+-ATP酶的等分試樣(2
Ug)用於每個結合測定法。相同的實驗重複三次。
圖4A-D.鑑定涉及與Src相互作用的Na+/K+-ATP酶結構域
圖4A.肘+/〖+41 酶的011亞基的圖示。NT， N-末端；CD2，胞質
結構域2; CD3，胞質結構域3; PD,磷酸化結構域；ND，核苷酸結合結構域；CT， C-末端。
圖4B.四個獨立實驗的代表性蛋白質印跡顯示了當使用200 ng Src時，純化的Src(缺少前84個胺基酸)與CD3結合，但是不與al 亞基的NT結合。
圖4C.蛋白質印跡，顯示Src被Na+/K+-ATP酶(Na/K)和 NA+/K+-ATP酶(H/K)的GST-CD3拉下(pull down)但是沒有被來自 1 mg LLC-PK1細胞裂解物的SERCA拉下。
圖4D.蛋白質印跡，顯示了 Na+/K+-ATP酶和Src之間的結構域 相互作用。將不同的GST-融合的Na+/K+-ATP酶結構域構建體與Src 的His標記的SH3SH2結構域或激酶結構域溫育，並通過蛋白質印跡分 析pull down產物。
圖5A-B. Na+/K+-ATP酶和GST-CD3對Src的調控
圖5A.將所示量的純化的Na+/K+-ATP酶(PKE)與重組Src (4.5 U)在PBS中溫育30分鐘，然後加入2mMATP/Mg2+並另外溫育5分鐘。 樣品在SDS-PAGE上分離後，用如所示的抗體探測膜。*與對照相比p < 0.05; **與對照相比p < 0.01。
圖5B.將GST (100 ng)或不同量的GST-CD3與重組Src (4. 5 U) 在PBS中溫育30分鐘。如A中分析Src的磷酸化。值為至少四次獨立 實驗的平均值土 SE。 *與對照相比p < 0.05。
圖6A-C.通過烏本苷刺激Na+/K+-ATP酶/Src複合體
圖6A.將預先形成的Na+/K+-ATP酶/Src複合體與不同濃度的烏 本苷在2 mM ATP/Mg2+存在下處理5分鐘，並使用如所示的位點特異 性抗體分析磷酸化的Src。值為至少四次獨立實驗的平均值土 SE。 ** 與對照相比p < 0. 01。
圖6B.用10 pM烏本苷處理Src或81:(;/^+/][+"^7 酶複合體， 並測量Src活性。"與對照相比p < 0.01。
圖6C.四次實驗的代表性蛋白質印跡，顯示了烏本苷和釩酸鹽對 Na+/K+-ATP酶/Src複合體的影響。重複與A中相似的實驗以評估釩酸 鹽(Van)或釩酸鹽加烏本普(Oua)對Src磷酸化的影響。圖7A-D.通過從Na+/K+-ATP酶釋放激酶結構域激活Src:
圖7A.對照實驗，顯示了 Src可以與Na+ZK+-ATP酶共同沉澱。在 0.5 ml PBS中用或不用5 pg Na+/K+-ATP酶溫育的Src (4.5 U)以 100, 000 X g離心30分鐘。將沉澱重懸浮在PBS中並進行如材料和方 法中所述的磷酸化測定。作為輸入對照，將4. 5USrc直接懸浮在PBS 中並測定pY418磷酸化。** p< 0.01。
圖7B.在PBS中將Src (4. 5 U)與5 n g純化的Na+/K+-ATP酶預 溫育然後暴露於IO jLiM烏本苷15分鐘。然後通過離心收集對照處理 的和烏本苷處理的Na+/K+-ATP酶/Src複合體，重懸浮在PBS中，並 將其進行如A中的磷酸化測定。兩個代表性蛋白質印跡在A和B中顯 示，值為至少三次獨立實驗的平均值土 SE。 ** p< 0.01。
圖7C.四次單獨實驗的代表性蛋白質印跡，顯示了烏本苷誘導激 酶結構域從Na+/K+-ATP酶的釋放。將GST-Src、 GST-SH3SH2或GST -激酶在室溫下於500 /i 1 PBS中與1 p g純化的Na+/K+- ATP酶溫 育30分鐘。然後在穀胱甘肽珠上拉下(pull down)複合體，洗滌三 次，重懸浮在500 ialPBS中，並暴露於IO pM烏本苷15分鐘。隨 後將小珠用PBS再洗滌三次，用抗-al抗體通過蛋白質印跡分析拉 下(pull down)的Na+/K+-ATP酶。
圖7D.三次獨立實驗的代表性蛋白質印跡，顯示了 GST-激酶結構 域融合蛋白對Src的激活。將GST、 GST-SH3SH2或GST-激酶(各5 ju g)與2 p g純化的Na+/K+-ATP酶在室溫下預溫育15分鐘。然後向混 合物加入重組Src (4.5 U)溫育額外的30分鐘。通過加入2 mM ATP/ Mg2+開始磷酸化反應並如A中測量Src pY418。
圖8A-C.烏本苷在活細胞中從Na+/K+-ATP酶解離Src激酶結構
域
圖8A. LLC-PK1細胞中烏本苷誘導的FRET信號改變的代表性跡線。
圖8B.用Src-Rluc和GFP- a 1共轉染293T細胞。用Rluc-GFP 融合蛋白轉染的293T細胞用作陽性對照，並將Rluc和GFP-Na+/K+-ATP酶共轉染的細胞用作陰性對照。
圖8C.烏本苷處理以依賴劑量的方式降低GFP-Na+/K+-ATP酶和 Src-Rluc之間的BRET信號。值為至少四次實驗的平均值± SE。 *p< 0. 05; ** p < 0. 01。
圖9A-D.烏本苷-激活的Na+/K+-ATP酶/Src砩酸化並募集下遊 效應物；
圖9 A.用l jaM烏本苷處理LLC-PK1細胞5分鐘，並用抗-a 1抗體免疫沉澱細胞裂解物並分析酪氨酸磷酸化的蛋白質。
圖9B.用100 nM烏本普處理SYF和SYF + Src細胞5分鐘並如 A中進行分析。在A和B中顯示了三次實驗的代表性蛋白質印跡。
圖9C.對Src的抑制阻斷了烏本苷誘導的Src向Na+/K+-ATP酶 信號複合體的募集。將LLC-PK1細胞用1 juM PP2或PP3預處理15 分鐘，然後暴露於1 |iM烏本苷5分鐘。免疫沉澱並分析細胞裂解物。 值為至少四次獨立實驗的平均值土 SE。 * p < 0.05。
圖9D.在2 mM ATP存在或不存在下，如以前所述的(Wang等人， 2004)分離胞膜窖並用100 nM烏本苷處理5分鐘。之後，胞膜窖在RIPA 緩衝液中裂解，並通過離心使裂解物澄清並用抗窖蛋白-l抗體免疫沉 澱。通過蛋白質印跡用al、 Src、和窖蛋白-1探測免疫沉澱物。顯示 了三個獨立實驗的代表性蛋白質印跡。
圖10.圖示顯示了所鑑定的Na+/K+-ATP酶和Src (A)之間的相 互作用和烏本苷怎樣調控^+/![+- ATP酶/Src受體複合體(B)。
圖1H-B.通過siRNA對內源Na+/K+-ATP酶的沉默
圖11A.通過SDS-PAGE分離來自不同細胞系的總細胞裂解物(30 jug/泳道)並通過蛋白質印跡分析Na+/K+-ATP酶的a 1亞基的表達。 顯示了代表性蛋白質印跡(見表2中的定量數據)。
圖11B.混合P-ll和PY-17細胞，共同培養24小時，然後如"實 驗步驟"中所述的用抗-al抗體(克隆CM64. 6)免疫染色。比例尺 代表5Q nm。
圖12A-B. AAC- 19細胞中Na+/K+-ATP酶的表達。圖12A.如"實驗步驟"中所述的用表達大鼠al的載體轉染PY-17 細胞產生克隆AAC-19。通過SDS-PAGE分離細胞裂解物(來自P-ll和 AAC-19的15 iug和來自PY-17的60 ja g )並通過蛋白質印跡分析。 印跡首先用識別豬和大鼠al亞基的抗體oc6F探測，然後剝離，用與 大鼠ocl特異反應的抗MSE再次探測。
圖12 B.混合P-ll和AAC-19細胞，共同培養24小時，然後如 "實驗步驟"中所述的用抗-al抗體(克隆C464. 6)免疫染色。比例 尺代表5G inm。
圖13.烏本苷(卯a)對Na+/K+-ATP酶活性的濃度依賴性作用。 如"實驗步驟"中所述的從P-ll和AAC-19細胞製備全細胞裂解物並 測定^+/1^+4了？酶活性。數據顯示為對照的百分比，並且每個點表示 為四次獨立實驗的平均值± S. E.。用GraphPad軟體進行曲線擬合分析。
圖14A-C. Na+/K+-ATP酶對Src活性的調控
圖14A和14B -通過SDS-PAGE分離來自不同細胞系的細胞裂解物 (30 pg/泳道)並通過抗-c-Src (B-12)或抗-Tyr(P)"8- Src抗體分 析。定量數據是來自四次獨立實驗的平均值土 S. E. 。 *，相當於對 P-ll的p < 0, 05。
圖14C.使培養的P-ll和TCN23-19細胞血清飢餓12h並使用抗 -Tyr(P)418-Src抗體免疫染色。如"實驗步驟"中所述的收集圖像。 比例尺代表50 pm。
圖15 A-D.無泵的Na+/K+-ATP酶對Src活性的調控
圖15A和15B，通過SDS-PAGE分離來自不同細胞系的細胞裂解物 (30 jig/泳道)並通過抗-c-Src (B-12)或抗,71:( )"8- Src抗體分 析。定量數據是來自四次獨立實驗的平均值土 S. E. 。 *，相當於對 P-ll的；？ < 0. 05。
圖15C. PY-17細胞用空載體(模擬物)、沉默突變的野生型大鼠 ocl (AAC)或D371E突變體瞬時轉染PY-17細胞。3化後，如所述的裂 解轉染的細胞並通過蛋白質印跡分析。顯示了代表性蛋白質印跡，相同的實驗重複四次。
圖15D.用表達EYFP-融合的ot 1 D371E突變體的載體 (pEYFP-D371E)瞬時轉染TCN23-19細胞。24h後，使細胞血清飢餓12h 並使用抗-Tyr(P)"s-Src抗體免疫染色。來自代表性實驗的圖像表明 突變pEYFP-D371E的表達降低了紅色(Tyr (P) "8-Src)螢光的強度(與 綠色和附近的非綠色細胞相比)。收集四次獨立實驗中來自40個不同 顯微鏡視野的Tyr(P)"8-Src的定量數據並表示為平均值± S. E. **， p < 0.01。比例尺代表22 jnm; W/0，無。
圖16 A-B. 3^和無泵化+/"-^7 酶之間的相互作用
圖16A和16B,用Src-ECFP和EYFP-大鼠al突變體(D371E)表達 栽體共轉染TCN23-19細胞。24h後，如"實驗步驟"中所述的進行FRET 分析。將加框的R0I-1(綠色)光漂白，並分析R0I-3 (黃色)膜區域的 FRET。選擇加框的R0I-2 (紫色)並用作非漂白對照。重複實驗三次， 並分析總共20個細胞。
圖16C.如A中用沉默突變的野生型大鼠ocl (^0或大鼠ocl無 泵突變體0^7H)表達載體瞬時轉染TCN23-19細胞。36h後，製備細 胞裂解物並用單克隆的抗-Src (克隆GD11)抗體進行免疫沉澱。使用 抗-NASE抗體(對於大鼠al)或抗-c-Src ( SRC2 )抗體通過蛋白質印 跡分析免疫沉澱物。相同的實驗重複三次，並顯示了代表性蛋白質印 跡。/ ，免疫沉澱。
圖17A-E.通過Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶對FAK磷酸化的
調控
圖17A.使培養的P-11和PY-17細胞血清飢餓U小時。然後用抗 磷酸酪氨酸抗體(4G10)免疫沉澱細胞裂解物，並通過抗-FAK抗體分析 免疫沉澱物。合併的定量數據來自三個獨立的實驗。
圖17B.通過SDS-PAGE分析來自不同細胞系的細胞裂解物並通過 抗-Tyr (P) 925-FAK和抗-Tyr (P) "8-Src抗體分析。剝離相同的膜並用抗 c-Src (B-12)抗體再次探測。顯示了三個獨立實驗的代表性印跡。
圖17C.通過抗-pERK1/2或抗-ERK1/2抗體分析細胞裂解物。從四個獨立實驗計算定量數據(平均值± S.E.)作為pERK/ERK的相對比 例。
圖17D.用1 nM PP2處理P-ll和PY-17細胞0， 5和2小時。通 過使用特異性抗體測量FAK和Src激活。顯示了代表性蛋白質印跡， 相同的實驗重複三次。
圖17E.用空載體(模擬物)或D371E突變體瞬時轉染PY-17細胞。 36小時後，裂解轉染的細胞並如所示用特異性抗體通過蛋白質印跡分 析。顯示了代表性蛋白質印跡，相同的實驗重複三次。/戶，免疫沉澱物； /A，免疫印跡。*，相對於P-ll的p < 0.05。
圖18A-D.烏本苷對Src和ERKl/2的作用
圖18A和18B.將細胞暴露於100 nM烏本苦5或15分鐘，並通 過蛋白質印跡分析細胞裂解物(50 jag/泳道)的活性Src或活性 ERK1/2。印跡首先用抗-Tyr(P)"8-Src或抗-pERK抗體探測，然後剝 離，並再次探測總的Src或ERK1/2以確保相等上樣。
圖18 C和18D.細胞用所示濃度的烏本苷處理5分鐘，如圖18A 和18B對總的細胞裂解物分析Tyr (P) "8-Src和總的Src或pERKl/2和 總的ERK1/2。顯示了代表性蛋白質印跡和組合的定量數據。相對於 P-ll細胞的對照條件計算來自三個獨立實驗的定量數據(pSrc/Src 或pERK/ERK的相對比例)(平均值士 S. E.)。*，相對於每種細胞系的 各自對照條件，；？ < 0.05， c加，對照。
圖19.與Src相互作用並抑制Src的Na+/K+-ATP酶中特定結構 域的進一步作圖
圖19 A. ^+/1[+-入了？酶al和CD3結構域圖解。
圖19B. ND1的胺基酸序列[SEQ ID NO 1〗
VFQANQ1.
圖19C.使用GST-標記的a 1截短和His-Src的體外結合測定法。
圖19D.序列，顯示了 ND1肽在不同物種和Na/K-ATP酶的不同同
厶號[SEQ ID NO: 2 一 33]從Swiss Prot資料庫得到。
圖20A-C.與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src中特定結構域的進一 步作圖
圖20A. Src和它的激酶結構域的示意性結構。 圖20B. KDl的胺基酸序列[SEQ ID: 34]
KLRHE!.
圖20C.使用GST標記的Src截短和純化的Na+/K+-ATP酶的體外 結合測定法。
圖21.活性測定證實NDl和KDl涉及Src的Na+/K+-ATP酶介導 的調控。
圖22A-B. NDl在活細胞中有效阻斷Src活性。 圖22A.用YFP-標記的NDl、 ND和CD3瞬時轉染LLC-PKl細胞24 小時。
圖22B.來自三次獨立實驗的定量數據。* p<0.05。
圖23. YFP-ND1抑制人前列腺癌細胞(DU145)生長。
圖24.來自NDl的抑制Src的20個胺基酸的肽(P-3)的作圖。
圖24 A. P-3的肽序列[SEQ ID 2]。
圖24B.當將純化的Src與P-3肽在37匸溫育20分鐘並加入2 mM ATP後溫育額外的5分鐘時得到的結果。
圖25.表1-人Na+/K+-ATP酶-al亞基特異性siRNA的靶標和 寡核苷酸序列，其中通過粗體字母標記靶序列。[SEQ ID NO. 35-"]。 (見圖25-表4)。
圖26.表2-用於不同細胞系的DNA構建體的相對otl亞基蛋白質
含量和組成。
圖27.表3-不同細胞系中的^+/"4了？酶活性。 圖28.肽penetratin (TAT)和antennapedia (AP)的螺旋的序列 [SEQ ID NO 47， 48]。圖29. TAT-P3和AP-P3抑制Src並阻斷DU 145細胞生長。 圖29A.顯示了TAT或AP標記的Src肽抑制劑(TAT-P3或AP-P3) 的序列[SEQ ID NO 49， 50〗。
圖29B顯示了新肽在體外抑制Src。
圖29C顯示FITC-綴合的TAT-P3乾向細胞膜。
圖29D顯示向DU 145細胞加入TAT-P3或AP-P3抑制了細胞生長。
圖30A-B顯示了具有SEQ ID NO 1-55的表。
優選實施方案詳述
Src和Src家族激酶是非受體酪氨酸激酶，其在涉及控制細胞生 長、運動和肌肉收縮的多種信號傳導通路的調控中起重要作用。此外， 我們最近的研究已經表明通過強心類固醇對Na/K-ATP酶-結合的Src 的激活保護心臟免於缺血/再灌注損失。它還抑制癌細胞生長和刺激成 纖維細胞中的膠原合成。因為Src家族激酶在許多類型的癌症中具有 高活性，所以製藥公司對於開發特異性Src和Src家族激酶抑制劑感 興趣。多數開發的抑制劑是直接與ATP竟爭的ATP類似物。
一方面，本發明涉及肽Src抑制劑，其包括結合併抑制Src的 Na+/K+-ATP酶。肽抑制劑不僅通過不同於ATP類似物的機理髮揮作用， 而且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。從而，這些肽可以用於開發 癌症和其他疾病的有效治療劑，在所述癌症和其他疾病中Src或 Na+/K+-ATP酶/Src活性是異常的。此外，本發明涉及包括Src片段的 肽Src激活劑，其結合併阻止^+/"41 酶對Src的抑制。像強心類 固醇一樣，這些肽激活劑可以激活^+/"41 酶結合的Src。與強心 類固醇相比，它們不抑制血+/1(+4了？酶的泵功能。從而，這些激活劑
用於開發充血性心力衰竭、局部缺血/再灌注損失(例如，心肌梗塞) 和其中Src或^+/{[+47 酶/81^活性異常的其他疾病的有效治療劑。 強心類固醇如烏本苷激活Src，導致許多不同類型細胞中的蛋白 質酪氨酸磷酸化。發明人現在已經發現Src和Na+/K+-ATP酶通過多個 結構域相互作用以形成功能性受體複合體。該相互作用有效保持Src處於失活狀態，表明Na+/K+-ATP酶是有效的Src抑制劑。
因為Na+/K+-ATP酶作為新發現的信號轉導物，介導若干信號通 路，所述通路涉及癌細胞生長、心臟纖維質生成、缺血/再灌注損失和 尿毒症心肌病，本發明人現在已經發現Na+/K+-ATP酶和Src之間此類 相互作用的千擾提供了這些疾病的有用的治療信息。
Src和Na+/K+-ATP酶ct 1亞基中功能結構域的詳細作圖揭示 Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制是由於ot亞基的N結構域，特別是 ND1肽和Src激酶結構域，特別是KD1肽之間的相互作用。
進一步分析揭示來自ND1的20個胺基酸的肽(P-3)足夠結合併抑 制Src活性以及其他Src家族激酶，如Lyn。此外，當細胞穿透肽(例 如，TAT或AP)附著到Src抑制性肽時，該新的肽完全能夠進入細胞 並抑制細胞Src活性。當在前列腺癌DU 145細胞中測試時，這些標記 的肽抑制劑有效阻斷DU145細胞增殖。發明人還發現來自Src激酶結 構域的KD1可以結合Na+/K+-ATP酶並且通過與結合基序竟爭Src而有 效激活Na+/K+-ATP酶-抑制的Src。
從而，發明人已經開發了可用於激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特 異性Src或Src家族激酶的肽。此外，發明人已經鑑定了相互作用位 點(即，ct亞基的ND1和Src的Ol之間)，其可以用作開發其他肽 和小分子抑制劑或激活劑的靶標，所述小分子抑制劑或激活劑是更有 效的、組織特異性的或者具有更高的藥效學或藥物代謝動力學性質。
另一方面，所述肽代表新類別的Src抑制劑和/或激活劑。因為這 些肽靶向與^+/](+4了？酶特異相互作用而不是一般性竟爭ATP結合的 區域，所以它們更特異並且具有與受體酪氨酸激酶更小的交叉反應性。 此外，這些肽提供了 Src活性的通路特異性調節，從而被更狹窄(特 異)地耙向。此外，結構-功能研究將產生各Src家族激酶的更有效 和特異的抑制劑/激活劑，因為每種激酶具有不同的KD1序列。因為
^+/1[+41 酶的其他01亞基也結合激酶結構域，所以可以開發同種型
特異性Src抑制劑。最後，使用該結構信息，現在可能開發具有更好 的藥效學和藥物代謝動力學性質的小分子。Src抑制劑肽的基於序列的分析或者所鑑定的相互作用結構域的 結晶可以揭示Src和Na+/K+-ATP酶之間的精確界面，這將允許開發抑 制或激活Src的新肽或小分子。使用所鑑定的相互作用(Na+/K+-ATP 酶/Src相互作用或ot亞基N結構域/ Src激酶結構域相互作用)，可 以開發快速篩選測定法用於大規模和高通量篩選其他的肽和小分子。 可以用遺傳方法或化學品或激素上調或下調細胞的Na+/K+-ATP酶，從 而抑制或激活細胞Src或Src家族激酶。
另一方面，所發現的Na+/K+-ATP酶/Src受體複合體作為開發該 受體的新的激動劑和拮抗劑的乾標。
實施例1
Src與Na+/K+-ATP酶的結合形成功能性信號傳導複合體 Na+/K+-ATP酶與Src相互作用從而形成功能性信號傳導複合物 材料和方法
從Calbiochem (San Diego， CA)得到一種Src激酶抑制劑PP2。 從New England Nuclear (Boston, MA)得到[y _32P] ATP。使用的抗 體和它們的來源如下單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(PY")、單克隆抗-Src 抗體(B12)、 山羊抗兔和山羊抗小鼠二級抗體從Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)得到。多克隆的抗-Src pY418抗體 和抗-Src pY529來自Biosource International (Camarillo， CA)。 單克隆抗His抗體來自InvUrogen (Carlsbad, CA)。純化的重組Src 和用於測定Src激酶活性的測定試劑盒、抗磷酸酪氨酸抗體和G蛋白 瓊月旨糖得自 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)。質粒 pGFP2-C、 pRluc-N和DeepBlueC購自Biosignal Packard (Montreal, Canada)。質粒pEYFP-Cl和pECFP-Nl購自Clontech (Palo Alto， CA)， pGEX-4T-1和pTrc-His來自Invitrogen。所有二級抗體都綴合到辣 根過氧化物酶；因此，使用化學發光對免疫反應性帶顯色(Pierce, Rockford， IL)。穀胱甘肽珠來自 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden) 。 Optitran硝酸纖維素膜得自Schleicher & Schuel 1 (Keene，NH)。
質粒構建體
進行缺少SH4結構域的雞c-Src和GST-Src突變體的製備(Ma等 人，2000)。基於豬腎^+/)(+-ATP酶cxl亞基的序列構建GST-NT (氨 基酸殘基6-90) [SEQIDN0 51]， GST-CD2 (胺基酸殘基152-288) [SEQ ID NO 52]和GST-CD3 (胺基酸殘基350-785) [SEQ ID NO 53]表達 載體(見圖3A)。
分別基於大鼠^+/""^1 酶cDNA和大鼠心臟SERCA 2a cDNA構 建GST-H+ /K+-CD3 [SEQ ID NO 54]和GST-SERCA-CD3 [SEQ ID NO 55]。 通過從GST-Src載體切除對應的Src cDM然後將它們插入pTrc-His A 載體產生His標記的Src構建體。通過將全長c-Src符合讀框地克隆 到pECFP-Nl或pRluc載體中構建用於螢光共振能量轉移(FRET)和生 物發光共振能量轉移(BRET)測定法的Src-ECFP和Src-Rluc。從 Pressley博士 (Texas Tech University)提供的表達載體切除大鼠 Na+/K+-ATP酶ocl cDNA並將其符合讀框地插入pEYFP-Cl中，並將 犬Na+/K+-ATP酶oc 1 cDNA克隆到pGFP2載體中。通過DM測序驗證 所有構建體。
細胞製備、培養和瞬時轉染
豬腎近端LLC-PK1、人胚腎293T細胞和小鼠成纖維細胞SYF和 SYF + Src細胞得自美國典型培養物保藏中心(Manassas, VA)並培養 在含有10。/。胎牛血清(FBS )和青黴素(100 U/ml) /鏈黴素(100 gg/ml) 的DMEM培養基中。使LLC-PH和293 T細胞血清飢餓2化，而SYF和 SYF + Src細胞培養在含有0. 5% FBS的培養基中24h並用於實驗。使 用Lipofectamine 2000，用多種質粒轉染細胞(Wang等人，2004)。 除非另外指出，在轉染後24小時進行實驗。
製備Src、 ^+/1(+41 酶、GST融合的蛋白和His標記的蛋白 如所述的(Ma等人，2000)從sf-9細胞純化沒有前85個胺基酸殘基的Src並用於最初的結合測定中以確保Src結合Na+/K+-ATP酶，但 是不結合純化的Na+/K+-ATP酶製備物中的脂類組分。在隨後的實驗 (例如，磷酸化和活性測定)中，4吏用來自Upstate Biotechnology 的純化的重組全長Src。使用Jorgensen方法(Xie等人，1996)從豬 腎外髓質純化^+/"-ATP酶並使用具有1200到1400 ,1 Pi/mg/h 的比活性的製備物。
在我們的實驗條件下，100 juM釩酸鹽或10 juM烏本苷引起純 化的豬腎Na+/K+-ATP酶的ATP酶活性的完全抑制。GST融合蛋白或His 標記的蛋白在大腸桿菌BL21中表達並在穀胱甘肽珠或鎳柱上純化。
免疫沉澱和GST pulldown
將細胞在含有1 %Nonidet P40、 0. 25%脫氧膽酸鈉、150mMNaCl、 1 mM EDTA、 1 mM苯甲基碌醯氟、1 mM原釩酸鈉、1 mM NaF、 10 ja g/ml抑酶肽、10 jag/ml抑酶醛肽和50mMTris-HCl (pH 7. 4)的RIPA 緩衝液中裂解。細胞裂解物通過在16,000 x g下離心U分鐘澄清， 並將上清液(l mg)用抗-al抗體免疫沉澱或者與不同的GST融合蛋 白溫育。然後通過G蛋白瓊脂糖或穀胱甘肽柱(Ma等人，2000; Haas 等人，2002)拉下(pull down)複合體並通過蛋白質印跡分析。
Src激酶活性
使用商業試劑盒測定Src激酶活性(Haas等人，2000)。為了確定 Na+/K+-ATP酶怎樣影響Src激酶活性，將純化的Src (4. 5 U)與5 n g純化的Na+/K+-ATP酶在Src測定緩衝液中於室溫下溫育30分鐘。 之後，將對照Src或Na+/K+-ATP酶結合的Src都暴露於10 juM烏本 苷並測定Src激酶活性。在其他實驗中，通過抗-pY"8抗體測量Src pY418以指示Src激活(Ma等人，2000)。為此，將純化的Src (4. 5 U) 與不同量的純化的Na+/K+-ATP酶或GST-Na+/K+ATP酶構建體在磷酸緩 衝鹽水(PBS)中於37匸下溫育30分鐘。之後，加入2 mM ATP/Mg2+。 反應在37T持續5分鐘並通過加入SDS樣品緩沖液終止。體外結合測定
將純化的Na+/K+-ATP酶溶解在1 % Triton X- 100 PBS中並以 lOO，OOOxg離心30分鐘。收集上清液用於結合測定。將GST-融合蛋 白(5 |i g)綴合在穀胱甘肽珠上並與500 nl PBS中溶解的 1^+/"4丁？酶在0.5% Triton X-100存在下於室溫溫育30分鐘。用 相同緩沖液洗滌所述珠四次。結合的Na+/K+-ATP酶在10% SDS-PAGE 上分離並通過蛋白質印跡檢測。類似地進行互換結合測定 (reciprocall binding assag),其中使用GST-Na十/K+-ATP酶構建 體(5 iag)和缺少前85個胺基酸的純化的Src(200 ng)或者His標記 的Src構建體(100 ng)。為了測試天然Na+/K+-ATP酶是否結合Src， 在不存在Triton X-100的情況下下重複上面的實驗。為了製備 Na+/K+-ATP酶/Src複合體，在不存在Triton X-100的情況下下將2-5 純化的Na+/K+-ATP酶與PBS中的4. 5 U Src (~10 ng)在室溫溫 育30分鐘。複合體直接用於所指出的實驗或者通過以100， 000 x g 離心30分鐘收集。對照實驗表明Na+ZK+ATP酶-結合的而不是游離的 Src可以通過離心共沉澱。
通過接納體光漂白進行FRET分析
使用上述pECFP-Nl和pE YFP-C1載體，將增強的青色螢光蛋白 (ECFP)融合到Src的C-末端，並且將增強的黃色螢光蛋白(EYFP)融合 到大鼠Na+/K+-ATP酶a 1亞基的N-末端。然後將Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1質粒共轉染到LLC-PK1細胞中。用ECFP/ EYFP或ECFP/EYFP-大鼠al轉染的細胞用作對照。24小時後，生長在蓋玻片上的細胞用 冰冷的甲醇在-20匸下固定15分鐘並用PBS溶液洗滌兩次。然後將蓋 玻片用於用Leica DMIRE2共焦顯微鏡(Wetzlar， Germany)進行FRET 測量。456 nm處和515 nm的雷射線用於激發螢光，並對於Src-ECFP 在465-509 nm和對於EYFP-大鼠ocl在530-570 nm處記錄發射強度。 選擇表達Src-ECFP和EYFP大鼠oc 1兩者的細胞進行FRET分析。選擇 目的膜區域(R0I1)並通過應用100°/。強度的515-nm雷射光漂白。所選的R0I1區域中在光漂白過程前後Src-ECFP和EYFP-大鼠ccl的發射 強度用於計算FRET效率。也計算非光漂白區(R0I2)的FRET效率並用 作對照。
活細胞中的FRET分析
將LLC-PK1細胞用Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1共轉染並培養在蓋 玻片上24小時。然後將蓋玻片封固在金屬腔中並用Leica DMIRE2共 焦顯微鏡分析。用456 nm和515訓的雷射線激發焚光，並對於 Src-ECFP在465-509 nm處和對於EYFP-大鼠a 1在530-570 nm處記 錄發射強度。選擇表達Src-ECFP和EYFP大鼠cc 1兩者的細胞並僅僅 通過456-nm雷射照射。僅僅表達Src-ECFP或EYFP-大鼠a 1的細胞用 於校正和測定雷射強度以及增益和補償設置。分別在465-509 nm (FBCPP) 和530-570 nm (FEYFP)下記錄所選膜區域中Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1 的發射強度。F磨/F,的比率反映FRET效率。通過50 s記錄後，將 相同的細胞暴露於烏本普並繼續記錄所指示的時間。
BRET分析
如Lowry等人(2002)所述的進行BRET測定。簡言之，用 GFP-Na+/K+-ATP酶和Src-Rluc或如所述的其他構建體轉染後24小 時，將細胞以一式三份接種在96孔微量培養板中。用所示濃度的烏本 苷處理後，將細胞暴露於相等體積的含有10 jaM DeepBlue C(Rluc 的底物)的BRET分析緩衝液中。使用具有微量培養板發光計檢測的 Fluoroskan Ascent FL (Ubsystems， Franklin, MA)立即獲得410 nm (對於Rluc)和515 nm (對於GFP)處的發射。如下計算BRET比率 (515 nm處的發射-515 nm處的背景)/( 410 nm處的發射-410 nm處 的背景)，其中在每個實驗中通過測量非轉染細胞樣品的信號評估背景 信號。
共定位分析將LLC-PK1細胞在蓋玻片上培養24小時，用PBS快速洗滌兩次， 然後用冰冷的曱醇固定15分鐘。細胞再次用PBS洗滌並用 SignalEnhancer (Molecular Probes)封閉。兔多克隆抗-Src抗體和 單克隆抗Na+/K+ATP酶抗體在3% BSA中混合併與蓋玻片在4t:過夜溫 育。用PBS洗滌後，加入Alexa fluor 546-綴合的抗小鼠抗體和Alexa fluor 488-綴合的抗兔抗體並在室溫溫育1小時。用PBS再次洗滌蓋 玻片三次。通過546 nm處的激發和566-620 nm處的發射顯示 Na+/K+-ATP酶。通過488 nm處的激發和505-535 nm處的發射顯示 Src。為了避免兩種螢光染料之間的幹擾，發明人使用了順序方法，其 特徵是通過Leica共焦顯微鏡測量兩種蛋白質的共定位，其中交替地 對細胞應用兩種、雷射光線488 nm和546 nm。用Leica Confocal Software (版本2. 5 build 1347 )進行共定位分析。
數據分析
數據以平均值± SE給出。使用學生t檢驗進行統計學分析，並 在p < 0. 05時認可顯著性。
結果
Na+/K+ -ATP酶與Src的相互作用
烏本苷結合Na+/K+-ATP酶激活了幾種不同細胞系中的Src激酶。 此外，Src可以與Na+/K+-ATP酶ct 1亞基共同免疫沉澱並且烏本苷以 時間和劑量依賴性方式調控該相互作用(Haas等人，2002)。
發明人現在認為信號傳導的^+/"-ATP酶可以與Src相互作用形 成信號傳導複合體。為了證實，將LLC-PK1細胞固定並通過單克隆抗 -ocl和多克隆抗-Src抗體雙染色。Na+/K+ ATP酶ot 1和Src在 LLC-PK1細胞中的質膜中共定位(圖IA)。
像素分析表明質膜中25.2 ± 1. 3%的Na+A+-ATP酶與Src共定 位。在過表達Src-ECFP的293T細胞中也觀察到這兩種蛋白質之間相 似的共定位。為了測試LLC-PK1細胞中Na+/K+-ATP酶和Src是否相互作用，發明人用Src-ECFP和EYFP-大鼠ctl轉染細胞。使用接納體光 漂白方案在轉染的細胞中進行螢光共振能量轉移(FRET)分析。選擇大 鼠ocl用於最初的FRET實驗是因為發明人有大鼠ctl特異性抗體，因 此發明人除了檢測YFP螢光外還可以使用蛋白質印跡證實轉染的ocl 的表達。數據表明能量從Src-ECFP轉移到EYFP-大鼠oc 1。
如圖1B中所示，EYFP-大鼠otl的光漂白導致Src-ECFP信號的增 強。從六次單獨實驗的共16個細胞測量的FRET效率為8. 1到18. 8 (13.2 ± 1.7)。相反，在用一對ECFP/EYFP或ECFP/EYFP-大鼠ot 1 轉染的細胞中沒有檢測到FRET。這些數據表明Na+/K+-ATP酶和Src 很接近，表明LLC-PK1細胞中這兩種蛋白質的直接相互作用。
為了得到直接結合證據，發明人首先用純化的豬腎化+/^^1 酶 (PKE)和GST-Src進行在體外結合測定。重要的是注意到純化的 Na+/K+-ATP酶是膜附著的製備物，其中ot 1和01亞基以1: 1摩爾比結 合併且佔製備物中90%以上的蛋白質含量(圖M和Jorgensen， 1974， 1988)。
如圖2C中所示，1 °/。 Triton X-100-增溶的Na+/K+-ATP酶以濃 度依賴性方式結合到GST-Src。當在結合測定中使用0.5 jag Na+/K+-ATP酶時，檢測到顯著量的al亞基。為了定量結合，進行如 圖2D中所示的實驗。數據表明當使用2 pg純化的化+/"41 酶時， GST-Src拉下(pull down)輸入的12 ± 2.4% (n = 3)。這些數據 提示Src和^+/1^^7 酶之間直接結合的可能性。為了控制該結合不 被Na+/K+-ATP酶的增溶誘導，發明人用純化的Na+/K+ATP酶不存在去 汙劑的情況下進行了上述實驗，表明Na+/K+-ATP酶和GST-Src之間相 似的相互作用。為了分析Src的哪些結構域與^+/"41 酶(關於結 構域結構見圖3A)相互作用，發明人表達並純化了 GST-SH2、 GST-SH3、 GST-SH3SH2和GST-激酶結構域融合蛋白(Ma等人，2000)。使用相同 的體外結合測定，發明人觀察到純化的Na+/K+-ATP酶結合到激酶結構 域、SH3SH2和SH2結構域，但是不結合SH3結構域(圖3C)。因為 GST-SH3SH2比GST-SH2拉下了更多的Na+/K+-ATP酶，所以該構建體用於隨後的實驗中。
儘管Src或其結構域構建體不可能通過它們與純化的酶製備物的 中間蛋白質組分的結合拉下Na+/K+-ATP酶，但是為了排除該可能性和 鑑定Na+/K+-ATP酶的哪些結構域涉及其與Src的相互作用，發明人制 備了 GST融合蛋白，其含有N-末端(GST-NT)、第二個胞質環(GST-CD2)、 和連接Na+/K+-ATP酶的a 1亞基的穿膜螺旋M4和M5的大的中央環 (GST-CD3;圖4A )，因為已知這些結構域與多種蛋白質相互作用。
如圖4B中所示，Src與GST-CD3和GST-CD2，但不與GST-NT相互 作用。為了進一步測試該結合是^+/""^7 酶特異的，發明人製備了 來自大鼠胃NA+/K+-ATP酶的CD3和大鼠心臟肌質網Ca2+-ATP酶2a (SERCA)的GST融合蛋白。數據顯示來自NA+/K+-ATP酶的GSFCD3而不 是SERCA從LLC-PK1細胞裂解物拉下Src (圖4C)。
為了對Na+/K+-ATP酶和Src之間的特異性結構域相互作用作圖， 發明人製備了 His標記的激酶結構域和SH3SH2結構域融合蛋白。使用 相同的結合測定，發明人發現GST-CD3與激酶結構域，但不與Src的 SH3SH2結構域相互作用。相反，CD2與SH3SH2，但不與激酶結構域相 互作用(圖4D)。總之，上面的結果表明化+/1^^1 酶可以通過011亞 基的CD2和CD3結構域直接與Src相互作用。
Na+/K+ATP酶對Src的調控
因為SH3SH2與調控蛋白的結合足夠激活Src，所以發明人測試了 Src與Na+/K+-ATP酶的結合是否導致Src激活。當將純化的重組Src 與不同量的純化的Na+/K+-ATP酶在ATP/Mg2+存在下在無去汙劑的PBS 溶液中溫育時，Src在Tyr418 (pY418)處的自磷酸化(表明Src激活) 以濃度依賴性方式降低(圖5A)。因為在IOO jaM釩酸鹽(其完全抑 制Na+/K+-ATP酶對ATP的水解)存在下重複實驗時發明人觀察到相同 結果，所以Na+/K+-ATP酶對Src的影響可能是由於這兩種蛋白質之間 的相互作用，但不是ATP的減少。為了進一步檢驗該假設，發明人測 定了 CD3對Src的作用。因為據報導維-奧二氏症候群蛋白質通過激酶結構域的結合抑制Src，所以發明人推斷CD3和激酶結構域之間的相 互作用可以足夠保持Src處於無活性狀態。實際上，如圖5B中所示， GST-CD3而不是GST作為純化的Na+/K+-ATP酶發揮作用，引起了 Src pY418的劑量依賴性抑制。
因為上面的數據提示^+/1(+47 酶可以結合31"(;並保持其處於無 活性狀態，所以發明人現在認為Na+/K+-ATP酶/Src複合體可以構成 烏本苷的功能複合體並且以與G蛋白偶聯的受體/G蛋白複合體相似的 方式起作用；即，烏本苷與該複合體的結合釋放捕獲的Src激酶結構 域，導致Src激活和隨後下遊效應物的酪氨酸磷酸化。為了測試，發 明人將重組Src與純化的Na+/K+-ATP酶在無去汙劑的PBS溶液中，在 烏本苷存在或不存在下溫育。蛋白質印跡分析表明烏本苷的家族以劑 量依賴型方式顯著增加了 pY418 (圖6A)。
為了證實pY418的改變與Src活性相關，發明人現在使用通過商 業通路可獲得的激酶測定試劑盒測量的Src介導的酪氨酸磷酸化。如 圖6B中所示，儘管^+/"47 酶保持31:(:處於無活性狀態，但是烏 本苷的加入恢復了激酶活性。發明人還確定了釩酸鹽是否影響該 ^+/"4丁？酶/31:(;複合體的活性。如圖6C中所示，儘管10-100 juM 釩酸鹽完全抑制了 ATP酶活性，但是其對SrcpY418沒有顯示出影響。 更重要的是，烏本苷仍然能夠在釩酸鹽存在下刺激Src的pY418。
為了測試烏本苷是否通過將Src從相互作用的Na+/K+-ATP酶解離 而激活Src，發明人將Src與純化的化+/"^^ 酶溫育。因為純化的 Na+/K+-ATP酶附著到膜，所以其可以通過以100， 000 X g離心30分 鍾沉澱。當Src結合到^+/〖+-人丁？酶時，離心足夠沉澱Src。蛋白質 印跡分析也表明共同沉澱的Src保持無活性狀態(圖7A)，其與圖5 中給出的發現相一致。因為僅僅^+/"41 酶結合的Src可以沉澱， 所以發明人推斷如果烏本苷將Src從Na+/K+-ATP酶解離，那麼所回收 的Src將在烏本苷處理的樣品中減少。
令人驚奇地，當離心前用烏本苷處理樣品後進行樣品分析時，發 明人發現烏本苷對與Na+/K+-ATP酶共同沉澱的總Src沒有影響，而是增加了 Src pY"8的量(圖7B)。因為發明人已經表明多種結構域涉及 Src與Na+/K+-ATP酶的相互作用，所以上面的發現導致我們檢測烏本 苷是否僅僅從相互作用的^+/"4了？酶解離單個(激酶)結構域。為 此，將1 jug純化的Na+/K+-ATP酶與GST-Src、 GST-SH3SH2或GST 激酶在無去汙劑的PBS溶液中溫育，並通過離心收集複合體。之後， 將複合體暴露於IO juM烏本苷。
如圖7C中所描繪的，烏本苷對全長Src或SH3SH2結構域與 Na+/K+-ATP酶的結合沒有影響，而是將激酶結構域從Na+/K+-ATP酶 解離出來，其符合圖5中給出的發現。烏本普對SH3SH2結構域與 Na+/K+-ATP酶的結合沒有影響這一事實顯然解釋了為什麼烏本苷沒 有改變Src與該酶的總體結合。為了進一步測試激酶結構域的釋放是 否足夠激活Src，發明人將GST —激酶融合蛋白與Na+/K+-ATP酶預溫 育，然後加入全長Src以竟爭激酶結構域結合位點。蛋白質印跡分析 表明GST激酶，而不是GST或GST-SH3SH2顯著增加了 Src pY418 (圖 7D)。總之，這些發現為如下觀點提供了強烈支持烏本苷通過釋放 Src的被捕獲的激酶結構域而激活Na+/K+-ATP酶/Src複合體。
烏本苷激活活細胞中Na+/K+-ATP酶/Src複合體並刺激酪氨酸激 酶磷酸化
如果烏本苷通過在活細胞中釋放激酶結構域而激活Na+/K+-ATP 酶/Src複合體，發明人現在認為烏本苷將增加激酶結構域和相互作用 的Na+/K+-ATP酶之間的距離，因為被釋放的激酶結構域將結合併磷酸 化其效應物。這將導致共表達的Src-ECFP和EYFP-大鼠a 1之間FRET 信號的減弱。為了測試，發明人進行了活細胞FRET以及BRET分析。
如圖8A中所示，456 nm處ECFP的激發引起對照細胞中ECFP譜 (在465和509 nm之間檢測為FECFP )和EYFP i瞽(在530和570 nm 之間檢測為FEYFP)的發射，表明Src-ECFP和EYFP-大鼠al之間潛 在的FRET。為了測試烏本苷是否刺激激酶結構域的釋放，將相同的細 胞暴露於烏本苷並測量ECFP和EYFP強度。如圖8A中所示， 一旦細胞 暴露於IOO mM烏本苷，那麼存在F,的依賴時間的減弱和F,的同時增加，表明烏本苷引起了 Src-ECFP和EYFP-大鼠otl之間FRET的減 弱。作為對照，在用ECFP和EYFP轉染的細胞中重複了相同的實驗， 並且沒有觀察到可檢測到的FRBT。
因為必須激發ECFP以進行FRET分析，所以在實驗期間發生光漂 白和光譜透膠，使得數據分析，特別是活細胞中的數據分析複雜化。 此外，因為烏本苷不敏感的大鼠ocl用於FRET分析，所以發明人想要 測試烏本苷敏感的otl是否類似於大鼠ocl發揮功能。因此，發明人使 用GFP犬cc 1和Src-Reni 1 la螢光素酶(Src-Rluc)進行BRET分析以確 證上面的發現。將兩種構建體都瞬時轉染到293 T細胞中並將GFP-融 合Rluc的構建體用作陽性對照。選擇人293T細胞用於BRET分析，因 為這些細胞在我們的實驗條件下更容易被瞬時轉染。
如圖8B中所示，共表達GFP-犬ocl和Src-Rluc產生了與陽性對 照相當的BRET比率，表明Src與活細胞中的Na+/K+-ATP酶相互作用。 重要的是，當轉染的細胞暴露於不同濃度的烏本苷時，烏本苷引起了 BRET比率的依賴劑量的降低。當使用10nM烏本苷時檢測到顯著降低 (圖8C)。這些數據與犬otl的已知烏本苷敏感性一致並且支持圖8A 中FRET分析的結果。
蛋白質酪氛酸磷酸化的增加對於烏本苷誘導的細胞功能改變是必 需的。儘管烏本苷對Src的激活導致Na+/K+-ATP酶結合的EGF受體和 ^-,7的反式激活，但是發明人沒有測試所鑑定的^+/1(+-ATP酶/Src
複合體的激活是否造成與所述信號傳導複合體結合的其他蛋白質的烏 本苷誘導的酪氨酸磷酸化。
為了測試，將LLC-PK1細胞暴露於1 "M烏本苷5分鐘。然後將 來自對照和處理的細胞的細胞裂解物用抗-al抗體免疫沉澱。當將 免疫沉澱物在SDS-PAGE上分離並用抗磷酸酪氨酸抗體探測磷酸酪氨 酸時，發明人觀察到烏本苷實際上刺激了多種Na+/K+-ATP酶結合的蛋 白質的酪氨酸磷酸化(圖9A)。為了證實Src是應答烏本苷而啟動蛋白 質酪氨酸磷酸化所需的，發明人在Src家族激酶敲除SYF細胞中重複 了相同的實驗。如圖9B中所示，烏本苷對蛋白質酪氨酸磷酸化的作用在SYF細胞 中完全消失。另一方面，當將Src敲回到SYF細胞(SYF + Src)中時， 烏本苷對蛋白質酪氨酸磷酸化的作用恢復，表明Src在啟動烏本苷激 活的蛋白質酪氨酸磷酸化中的基本作用。這進一步受到如下事實的支 持Src抑制劑PP2能夠阻斷SYF + Src細胞中烏本苷誘導的蛋白質 酪氨酸磷酸化。
因為發明人已經表明烏本苷刺激31^向肘+"+41 酶信號傳導復 合體的募集，所以發明人現在認為烏本苷首先激活Na+/K+-ATP酶結合 的Src並隨後導致EGFR、窖蛋白-1和其他效應物的酪氨酸磷酸化。這 些效應物又為募集額外Src和其他信號傳導蛋白至該信號複合體上提 供了結合位點。
為了測試，發明人在1 |iM PP2存在或不存在下，用l jiM烏本 苷處理LLC-PK1細胞5分鐘。然後通過抗-a 1抗體免疫沉澱細胞裂解 物。免疫沉澱物的蛋白質印跡分析表明烏本苷增加了對照細胞而不是 用PP2預處理的細胞中共沉澱的Src(圖9C)，支持了如下觀點Src 的最初激活是將額外的Src募集到複合體所必須的。對照實驗也表明 用PP3(Src抑制劑PP2的無活性類似物)預處理LLC-PK1細胞不能阻斷 烏本苷誘導的Src向Na+/K+-ATP酶的募集(圖9C)。
為了確證上面的發現，發明人還用來自LLC-PK1細胞的分離的胞 膜窖製備物進行了免疫沉澱實驗。發明人以前表明烏本苷以依賴Src
的方式增加了分離的胞膜窖製備物中蛋白質的酪氨酸磷酸化。它也刺 激了 Na+ZK+-ATP酶/窖蛋白-l /Src複合體的形成(Wang等人，2004)。 然而，因為ATP的加入是烏本苷激活分離的胞膜窖中Src所需的，發 明人認為如果Src激活和窖蛋白-1的酪氨酸磷酸化是Src的額外募集 所需的，那麼不存在ATP時，烏本苷不能刺激Src向窖蛋白-1複合體 的募集。實際上，這是當發明人在不存在ATP時重複上述實驗時所觀 察到的(圖9D)。總之，這些數據清楚地表明烏本苷通過首先激活Src 然後將包括31:(;在內的更多效應蛋白募集到信號^+/"41 酶而通過 Na+/K+-ATP酶傳遞信號。討論
發明人現在顯示了涉及Na+/K+-ATP酶/Src相互作用的已作圖的 結構域。發明人還闡明Na+/K+-ATP酶和Src可以通過所鑑定的蛋白質 結構域裝配成功能信號傳導複合體並且烏本苷與Na+/K+-ATP酶的結 合激活Src並引起下遊蛋白質酪氨酸磷酸化。該結論和其他結論在圖 IO和中總結並在下文討論。
作為強心類固醇受體的Na+/K+-ATP酶/Src複合體
因為Na+/K+-ATP酶的a 1亞基在其N-末端含有保守的富含脯氨酸 的基序(Yudowski等人，2000)，所以發明人最初認為烏本苷可能促進 Src的3113和^+/"4丁？酶之間的相互作用，導致Src的激活。另發 明人驚奇的是，GST pull down測定法表明SH3結構域不參與和 Na+/K+-ATP酶的直接相互作用。相反，SH2和Src的激酵結構域分別 與Na+/K+-ATP酶oc 1亞基的CD2和CD3結構域相互作用。此外，發 明人的結果表明Na+/K+-ATP酶和GST-CD3都抑制Src活性(圖5)。盡 管發明人不能排除與^+/1[+41 酶共同純化的其他31^調節劑涉及其 中的可能性，但是純化的CD3結構域單獨可以模擬Na+/K+-ATP酶的作 用這一事實強烈提示Na+/K+-ATP酶足夠失活Src。
Na+/K+-ATP酶和Src形成無活性Src複合體這一事實導致發明人 現在認為該受體複合體可以以類似於細胞因子受體的方式傳遞烏本苷 信號。儘管這些受體沒有內在的激酶活性，但是與Src的偶聯允許它 們激活下遊的蛋白質酪氨酸磷酸化。本文描述的一些實例支持該觀點。
首先，烏本苷誘導的Na+/K+-ATP酶的構象改變足夠釋放Src的激 酶結構域(圖7)。有趣的是，SERCA的一種抑制劑，毒胡蘿蔔內酯能夠 將CD3帶到膜附近。如果烏本苷可以對CD3發揮類似效果，那麼這可 以解釋烏本苷怎樣從血+/1[+41 酶釋放激酶結構域。另一方面，因為 烏本苷對SH3SH2結構域與CD2的結合沒有影響，所以該結構域可以作 為鉸鏈發揮功能，保持激活的Src結合到信號Na+/K+-ATP酶用於特異性和穩健的信號傳遞。
其次，通過加入GST-激酶結構域融合蛋白拮抗Src激酶結構域與 ^+/"41 酶的結合如烏本苷那樣發揮作用並且刺激了 Src pY418。
第三，所觀察到的烏本苷對Src的作用(圖6)不是由於對ATP酶 活性的抑制，因為在完全抑制ATP酶活性的濃度下，釩酸鹽沒有顯示 出對Src的作用。
此外，不水解ATP的GSTCD3也可以抑制Src激活。類似地，所述 發現也反對離子強度改變涉及烏本苷誘導的對Src的激活，因為這些 實驗在試管中在相同的離子條件下進行。
最後，FRET和BRET分析都表明烏本苷在活細胞中確實釋放激酶 結構域(圖8)。重要的是注意到烏本苷對Na+/K+-ATP酶/Src-激酶 結構域相互作用的影響是劑量依賴式的並且與烏本苷與Na+/K+-ATP 酶結合的已知的劑量反應曲線良好相關(Haas等人，2002)。
簡言之，發明人已經闡明烏本苷引起的信號轉導的新的機理。因 為Src家族激酶是高度保守的，所以發明人認為信號傳導Na+/K+ ATP 酶可以與Src家族的其他成員相互作用。此外，哺乳動物細胞以組織 特異性方式表達至少四種不同類型的亞基，並且現在認為不同的同種 型也可以以組織特異性方式與Src相互作用。至此，有趣的是注意到 Src也與NA+/K+ ATP酶的CD3結構域相互作用(圖4C)，提示NA+/K+ ATP 酶在Src活性調節中的潛在功能。
發明人還認為這些P-ATP酶也可以作為Src效應物，因為最近的 研究已經提出了這些P-ATP酶的Src介導的酪氨酸磷酸化(Kanagawa 等人，2000; Masaki等人，2000; Ferrandi等人，2004)。
發現的重要性
Na+/K+-ATP酶在保持哺乳動物細胞中跨細胞膜的Na+和K+離子濃 度中的基本功能是公知的。強心類固醇的結合位點在整個真核生物種 系發生中如此保守這一事實表明這些類固醇在Na+/K+-ATP酶功能的 調控中必定起重要作用。因為直到幾年前，離子泵是^+/"41 酶的唯一已知的功能，所以本領域充分接受強心類固醇必定通過抑制ATP 酶活性傳遞信號，儘管沒有此類信號轉導的激素先例。該作用模式已 經導致本領域許多人質疑內源性強心類固醇的重要性，因為它們在正 常生理條件下以亞納摩爾濃度循環，並且僅僅可以結合到1-2%的細胞 表面Na+/K+-ATP酶。因為多數哺乳動物細胞每個細胞含有1百萬 Na+/K+-ATP酶分子，所以強心類固醇僅僅作為Na+/K+-ATP酶的泵功 能抑制劑是非常無效的，因為它們必須針對細胞的大泵能力起作用。 另 一方面，如果結合位點對於調控Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能是保 守的，那麼強心類固醇將作為真正的激動劑發揮功能。如通過我們的 共定位分析估計的，-25%的^+/1(+47 酶具有與Src相互作用的能力。 烏本苷對1-2%的這些受體的激活將產生每個細胞幾千活性分子。基於 HeLa細胞中EGF信號傳導的發現和信號放大原理，這將足夠通過激酶 級聯產生強烈信號，特別是如杲信號傳導事件在膜微結構域如胞膜窖 中發生。與這相一致的是，最近的研究已經表明在培養的細胞和動物 模型中，生理學濃度(例如0.1-1 nM)的烏本苷能夠激活Src和ERK (Aydemir-Koksoy等人，2001; Ferrandi等人，2004)。
在藥理學上，發明人已經闡明在分離的心臟製備物以及在培養的 肌細胞中通過激活Src和ERK完成烏本苷誘導的收縮力(Mohammadi等 人，2003)。此外，Src和ERK的抑制阻斷了心肌細胞中細胞內Ca2+ 的烏本苷誘導的增加(Tian等人，2001)。
從而，本文的實施例揭示了心臟中洋地黃誘導的收縮力的可能的 分子機理。本文的實施例也表明這可以用於開發可以刺激Na+/K+-ATP
酶的信號傳導功能而不影響離子泵功能的化學品或肽。此外，本文的 發明人還提供了對所述分子機理的認識，其中膜轉運蛋白通過所述分 子機理使用Src形成功能信號複合體。因為許多膜轉運蛋白和離子通 道與Na+/K+-ATP酶一樣經歷底物或者配體依賴性構象改變，所以這些 發現提出了關於其他膜轉運蛋白是否也涉及信號轉導從而構成另一組 重要的受體和信號轉導物的重要生物學問題。至此，發明人指出 ^+/1[+41 酶的CD3在許多不同的P型ATP酶中是高度保守的並且現在認為其他P類型的ATP酶(例如，圖4C中所示的NA+/K+-ATP酶)也 涉及Src的調控。發明人也指出一些最近的報導表明Src與許多其他 膜離子通道相互作用並調控這些通道(Yu等人，1997; Sobko等人， 1998; Tiran等人，2003)。
實施例II
使用11酞幹擾測定法對31^相互作用的^+/1[+41 酶的功能表徵
^+/"47 酶和3"形成信號傳導受體複合體。這裡，發明人現 在展示了 Na+/K+-ATP酶的量和性質的改變怎樣影響基礎Src活性和烏 本苷誘導的信號轉導。通過用表達al特異性小幹擾RNA的載體轉染 LLC-PK1細胞產生了一些al亞基敲減細胞系。儘管otl敲減導致 ^+/1(+、1 酶活性的顯著降低，但是它提高了基礎3]^活性和一種51^ 效應物縣著斑激酶的酪氨酸磷酸化。同時，它還消除了 Src和ERK1/2 的烏本苷誘導的激活。當通過大鼠al挽救敲減的細胞時，恢復了 1^+/1^+4了？酶活性和基礎Src活性。此外，烏本苷能夠以高得多的濃 度刺激挽救細胞中的Src和ERK1/2,與豬和大鼠a 1之間烏本苷敏感 性的所確立的差異相一致。最後螢光共振能量轉移分析和免疫共沉澱 測定表明泵缺失的大鼠al (D371E)突變體也可以結合Src。該突變體 的表達恢復了基礎Src活性和黏著斑激酶酪氨酸磷酸化。總之，發明 人現在認為LLC-PK1細胞含有Src相互作用的Na+/K+-ATP酶庫，其不 僅調控Src活性而且作為烏本苷激活蛋白激酶的受體。
Src的激活對於許多細胞活性(包括細胞內鈣的調控、基因表達 和細胞生長)的烏本苷誘導的改變是必需的，並且發明人已經檢查了 Na+/K+-ATP酶是否直接與Src相互作用以形成功能性信號傳導受體。
使用體外穀胱甘肽S轉移酶pull down測定法，發明人現在鑑定 了 ^+/1[+47 酶ctl亞基的第二個和第三個細胞內結構域分別與Src SH2和激酶結構域相互作用。在功能上，這些相互作用保持Src處於 無活性狀態，並且烏本苷與該無活性的Na+/K+-ATP酶 Src複合體的 結合釋放並隨後激活所結合的Src。這些新的實例表明細胞內Src相互作用的化+/1[+-ATP酶現在被認為在基礎Src活性的調控中起重要作
為了測試，發明人開發了基於siRNA的測定法，其允許我們確定 ^+/&+41 酶的量和性質的改變對基礎的和烏本苷刺激的Src活性的 影響。
材料和方法
最高純度的化學品購自Sigma。 GeneSuppressor載體購自 BioCarta (San Diego， CA)。細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、 Lipofectamine 2000和P艮制酶購自Invitrogen。 EYFP表達載體 (pEYFP)和ECFP表達栽體(pECFP)來自Clontech。 QuikChange誘變試 劑盒購自Stratagene (La Jolla， CA) 。 0ptUran硝化纖維素膜來自 Schleicher & Schuell。增強的化學發光SuperSignal試劑盒購自 Pierce。 Image-iT FX信號增強劑、Ant if ade試劑盒、Alexa Fluor 488-綴合的抗小鼠/兔IgG和Alexa Fluor 546-綴合的抗小鼠/兔IgG來自 Molecular Probes (Eugene, OR)。抗-Src (克隆GDll)單克隆抗體、 抗-^+/"47 酶oc 1多克隆和單克隆(克隆"64. 6)抗體、抗磷酸酪 氨酸(克隆4G10)抗體，和G蛋白-瓊脂糖來自Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY)。 單克隆抗-Tyr (P) 418-Src 和抗 -Tyr(P) 529-Src抗體來自BIOSOURCE (Camarillo， CA)。多克隆抗-FAK 和抗-Tyr(P) 925FAK抗體來自Cell Signaling (Danvers， MA)。單克 隆抗-cxl抗體 (a6F)來自 University of Iowa的Developmental Studies Hybridoma Bank。抗-c-Src (B-12)單克隆抗體、抗c-Src (SRC2)多克隆抗體、抗-ERK (C-16)多克隆抗體、抗-pERK (E-4)單 克隆抗體和所有二級辣根過氧化物酶綴合的抗體都來自Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)。多克隆大鼠al特異性抗體 (抗MSE)由Thomas Press ley博士 (Texas Tech University, Lubbock, TX)提供。細胞培養
LLC-PK1細胞和人胚腎293 T細胞來自美國典型培養物保藏中心 並保持在5。/flC02-溼潤培養箱中含有10%胎牛血清、100單位/ml青黴 素和100 )ag/ml鏈黴素的Dulbecco改良的Eagle培養基中。
siRNA表達載體的構建
使用GeneSuppressor構建試劑盒構建siRNA。簡言之，使用人ct 1 cDNA (GenBankTM檢索號NM-000701)作為才莫板合成四對寡核普酸 (A1-A4)(細節見表l)，並通過將兩個互補的寡核苷酸退火製備插入 片段。然後將退火的插入片段克隆入用Sail和Xbal消化的 pSuppressorTM-U6載體中。通過核苷酸測序證實陽性克隆。
位點定向誘變
Pressley博士提供了大鼠al表達載體pRc/ CMV-ocl AAC(12)。 為了使得大鼠cxl的表達對A4 siRNA不敏感，使用QuikChange誘變 試劑盒將al siRM靼向的序列從2530ggtcgtctgatcttt (GenBankTM 檢索號NM-012504)沉默突變為2530ggcaggctaatattc。產生Sspl (aat/att)限制酶位點以方便克隆篩選。通過DNA測序證實陽性突變體 (pRc/CMV-al AACml或縮寫為AAC)然後用於該研究中。通過用 pRc/CMV a lAACml作為模板將1126gacaag突變為1126gagaag產生泵 缺失的突變體(D371E) (13)。
產生穩定的a1亞基敲減和敲入細胞系
<吏用Lipofectamine 2000，用不同的siRNA表達栽體以及pEYFP 瞬時轉染人胚腎293T細胞。48小時後，首先檢查細胞的EYFP表達用 於評估轉染效率然後收集細胞用於通過蛋白質印跡分析內源ocl含 量。為了產生穩定細胞系，用A4 siRNA表達載體(pSuppressor-A4 siRNA)(見圖25-表l)和噪呤黴素選擇標記物(pBade-puro)轉染一批 LLC-PK1細胞。
圖25顯示了表1,人Na/KATP酶-ccl亞基特異性siRNA的靶標和 寡核苷酸序列，其中靶序列用粗體字母標記[SEQ ID NO. 35-46]。另一批細胞用pEYFP以及pSuppressor-A4 siRNA和pBade-puro 共轉染使得共表達的EYFP可以用作標記物來挑選克隆。共同選擇空載 體(pSuppressor)或Al siRM-轉染的細胞並用作對照。轉染後24小 時用嘌呤黴素(l jug/ml)選擇細胞。克隆並擴增嘌呤黴素抗性菌落。 為了挽救^+/"41 酶敲減細胞，細胞用pRc/CMV-cxl AACml轉染。 用3 juM烏本苷啟動選擇，因為未轉染的細胞對烏本苷非常敏感。大 約1周後，分離烏本苷抗性菌落並且在烏本苷不存在下擴增成穩定細 胞系。不使用G418是因為這些細胞抗G418,從而需要3 mg/ml才能 殺死未被轉染的細胞。敲減的細胞對殺稻瘟素(15 ng/ml)也是敏感 的，發明人也使用該試劑進行其他選擇。
免疫沉澱和免疫印跡分析
將細胞用PBS洗滌，溶解在修改的冰冷的放射免疫沉澱測定緩衝 液中，並進行免疫沉澱或蛋白質印跡分析。使用增強的化學發光試劑 盒檢測蛋白質信號並使用Bio-Rad GS-670成像密度計進行定量。
Na+/K+-ATP酶活性測定
測定^+/1[+47 酶酶促活性。簡言之，用Tris-EGTA緩衝液(pH 7. 2)從培養物收集細胞並簡短超聲處理。然後室溫下用0.1 mg /mg 蛋白質濃度的阿拉霹素處理細胞裂解物30分鐘。通過測定32P從 [，y-32P]ATP的最初釋放測量ATP酶活性，並在含有100 mM NaCl、 25 mMKCl、 3mMMgCl2、 lmMEGTA、 2mMATP、 5 mM Na&和50 mM Tris-HCl (pH 7. 4)的反應混合物(1 ml)中進行反應。Na+/K+-ATP酶活性計算為 不存在烏本苷和存在1 mM烏本苷時測量的活性之間的差異。為了測 定烏本苷濃度曲線，將阿拉黴素處理的細胞裂解物與不同濃度的烏本 苷預溫育15分鐘，然後加入ATP以開始反應。
共焦焚光顯微術
培養在蓋玻片上的細胞用PBS洗滌兩次並用在-20匸預冷的甲醇 固定15分鐘。然後將固定的細胞用PBS洗滌三次並在室溫下用200 u1 Inmge-iT FX信號增強劑封閉30分鐘。再次洗滌細胞並用含有1% 牛血清白蛋白的PBS中的一級抗體在室溫下溫育1小時。用PBS洗滌 三次後，細胞用相應的Alexa Fluor綴合的二級抗體溫育。使用Leica DMIRE2共焦顯孩i鏡(Leica， Mannheim, Germany)進行圖《象顯示。Leica 共焦軟體用於數據分析。
通過接納體光漂白進行FRET分析
將ECFP融合到Src的C末端，並將EYFP融合到大鼠Na+/K+-ATP 酶ctl或其突變體的N-末端。使用接納體光漂白方案，在用Src-ECFP 和EYFP -大鼠ctl表達載體共轉染的細胞中進行FRBT分析。簡言之， 24小時培養後，將蓋玻片上的細胞用-20X:下預冷的甲醇固定15分鐘， 並用PBS溶液洗滌兩次。通過應用高強度的515 nM雷射將EYFP-大鼠 (xl光漂白，並在EYFP光漂白之前(Dpre)和之後(Dpost)記錄456 nM 雷射激發的ECFP發射。然後通過(Dpost-Dpre) /Dpre的比率計算FRET 效率。用Src-ECFP和EYFP或EYFP-ocl和ECFP表達載體轉染的細胞 用作對照，在這些對照細胞中沒有觀察到可檢測到的FRET。
數據分析
數據以平均值土 S. E給出。用學生t檢驗進行統計學分析，並 且在p < 0. 05時認可顯著性。
結果
通過基於siRNA的測定法操作細胞Na+/K+-ATP酶含量 如圖25中的表1所示，選擇了共四對otl特異性siRNA。人胚腎 293T細胞中的瞬時轉染測定法表明A4 siRNA的表達導致人al亞基表 達的超過40%的降低，而其他的導致0 (Al siRM)到209/。 (A2和A3 siRNA)的減弱。因為如通過共表達的EYFP所指示的，轉染效率為約 50%，所以發明人推斷A4 siRM在沉默內源Na+ZK+-ATP酶的表達中 是有效的。因此，將LLC-PK1細胞用 A4 siRNA表達載體(pSuppres sor-A4 s iRNA)與噪呤黴素選擇標記(pBade-puro)與或不與 pEYFP進行轉染，如"實驗步驟"中所述。兩輪選擇後，發明人收集 了 20個穩定的轉染體。使用單克隆(a6F)抗體的蛋白質印跡分析表明 這些克隆中al亞基的表達與用空載體(pSuppressor)轉染並選擇的 對照P-ll細胞相比顯著降低。相反，從用Al siRM轉染的LLC-PK1 細胞中得到的細胞克隆(例如Al)以與P-ll細胞中相當的水平表達 otl (見圖26，表2)。
圖26顯示了表2，相對ocl亞基蛋白質含量和用於不同細胞系中 的DNA構建體的組成。
本文的發明人已經擴增並進一步表徵了 3種表達A4 siRNA-的克 隆。如圖11A中所示，al亞基的表達在A4-ll、 TCN23-19和PY-17 細胞中顯著降低。在這些細胞系中，通過使用共表達的EYFP作為標記 物克隆的PY-17細胞表達最低水平的^+/"—1 酶。
圖26中的表2顯示了發明人產生的這些和其他細胞系中ocl相 對量的定量數據。因為使用從豬腎製備的純化的Na+/K+-ATP酶進行的 對照蛋白質印跡表明僅僅可能進行合理的定量測定，其比較ocl的量 中小於6倍差異的兩個樣品(數據未顯示)，所以發明人通過比較A4-11 與對照P-ll，然後比較TCN23-19和PY-17與A4-11測量了這些細胞 中al的相對量。為了證實上面的蛋白質印跡數據，發明人還用不同 的抗Na+/K+-ATP酶a 1單克隆抗體(克隆C464. 6)和抗-Na十/K+-ATP 酶otl多克隆抗體探測了印跡，顯示與圖1U中基本相同的結果。此 外，當用抗Na+/K+-ATP酶al抗體(克隆(M64. O免疫染色共培養 的P-ll和PY-17細胞時，發明人發現綠色PY-17細胞沒有顯示出a 1 的可檢測的表達，而對照P-ll細胞的質膜被該抗體清楚地標記(圖 IIB)。為了確保ocl亞基的敲減不誘導其他同種型的表達，發明人就 a2和ct3分析了細胞裂解物並且在上面的細胞系中沒有發現可檢測 到的信號。
此外，當測量細胞裂解物中的烏本苷敏感的ATP酶活性時，與對 照P-ll細胞相比在PY-17細胞中注意到顯著(80% )降低(見圖2"7，表3)。
圖27顯示了表3，在細胞系P-11， PY-17和AAC-19中的 Na+/K+-ATP酶活性。
PY-17細胞具有非常低的內源Na+/K+-ATP酶並且當細胞通過敲入 內源a 1進行挽救時，可用於研究Na+/K+-ATP酶的結構 一 功能性質。 為了證實，發明人首先進行了大鼠ocl cDNA的沉默突變以改變siRNA 靶向的序列。發明人然後用突變的大鼠otl表達載體(pRc/CMV al AACml)轉染PY-17細胞並產生了 一些穩定的轉染物。克隆AAC-19的進 一步分析表明與P-ll和PY-17，不同這些細胞不像表達大鼠ctl (圖 12A)。
當使用單克隆抗體(a6F)分析相同印跡的總ccl時，發明人發現 AAC-19細胞表達與對照P-ll細胞中相當的量的al(圖12A)。通過用 抗-ctl (克隆C464. 6)抗體免疫染色共同培養的P-ll和AAC-19細胞 進一步證實了該結杲。如圖12B中所述，綠色AAC-19和對照P-ll細 胞顯示出質膜中相似水平的Na+/K+-ATP酶。對照實驗也表明不存在烏 本苷時，大鼠al在該細胞系中穩定表達至少20代。大鼠al向PY-17 細胞的功能性敲入能夠恢復^+/"41 酶活性(見圖27-表3)。而 且，它偏移了烏本苷對ATP酶活性的劑量反應曲線，並使得挽救的細 胞對烏本苷的敏感性降低。實際上，挽救的細胞與僅僅表達ctl同種 型的大鼠細胞系的行為一樣(圖13)。重要的是注意到PY-17與對照 P-ll細胞一樣對烏本苷敏感，並且10 juM烏本苷引起Na+/K+-ATP 酶的完全抑制。
Na+/K+-ATP酶對基礎Src活性的調控
體外研究表明^+/1[+41 酶直接結合3]:0並保持其處於無活性狀 態。本文的發明人現在認為該調控模式在活細胞中起作用並且細胞內 血+/1[+47 酶的降低將減小該相互作用，導致基礎Src活性升高。為 了測試，發明人測量了來自上面細胞系的細胞裂解物中Src的磷酸化 (Tyr(P)418-Src)，其指示Src的激活。如圖14A中所述，內源化+/"41 酶的敲減沒有改變總Src的表 達。然而，活性Src的水平在A4-11、 TCN23-19和PY-17細胞中顯著 降低。有趣的是，Src活性的升高似乎與這些細胞中表達的Na+/K+-ATP 酶的量反相關(圖14B)。
通過用抗-Tyr (P) 418-Src抗體免疫染色細胞進一步證實了這些 發現，表明TCN23-19細胞含有比P-ll細胞更多的活性Src(圖14C)。 重要的是注意到兩個對照細胞系P-ll和Al細胞之間活性Src的量沒 有差異。
為了測試當補充Na+/K+-ATP酶時，由於Na+/K+-ATP酶的表達降 低引起的Src活性的升高是可逆轉的，發明人測定了 AAC-19細胞中總 的Src和活性Src。如圖12A-B中所示，AAC-19細胞來自大鼠oc 1-轉 染的PY-17細胞並且表達與對照P-ll細胞中相當的量的Na+/K+-ATP 酶。儘管大鼠a 1的敲入不改變AAC-19細胞中總的Src，但是它降低 活性Src水平至對照P-ll細胞中所看到的水平(圖15 A和15B)。
如圖27中表3所示，PY-17細胞中Na+/K+-ATP酶活性降低80% 。 當在22^+ (0.5 juCi/ml)培養基中溫育細胞60分鐘以完全平衡可交 換的細胞內Na+與"Na+(15)後測量細胞內Na+時，發明人發現PY-17細 胞中穩態細胞內Na+約為P-11細胞中的兩倍。為了確保AAC-19細胞中 觀察到的Src活性的改變不是由於功能性Na+/K+-ATP酶的恢復和隨後 細胞內Na+的減少，發明人測試了大鼠otl的泵缺失突變體的敲入對於 所觀察到的Na+/K+-ATP酶和Src之間的相互作用是否足夠，PY-17細 胞用沉默突變的野生型大鼠ctl (pRc/CMV ocl AACffll)或大鼠al泵 缺失突變體(D371E)瞬時轉染。
如圖15C中所示，大鼠al或突變體的表達減少了 PY-17細胞中 的活性Src。為了進一步證實，發明人還用EYFP融合的大鼠al突變 表達載體(pEYFP-D371E)瞬時轉染TCN23-19細胞並免疫染色活性Src。 如圖15D中所示，表達大鼠ocl突變體的細胞與未轉染的TCN23-19細 胞相比具有低得多的活性Src。這些數據表明泵缺失的Na+/K+-ATP酶 突變體仍然能夠與Src相互作用並調控Src。為了進一步證實，發明人在用EYFP-大鼠a 1突變體(D371E)和Src-ECFP表達載體瞬時轉染 的TCN23-19細胞中進行了 FRET分析。
如圖16A中所示，泵缺失突變體被靶向至質膜。當通過接納體光 漂白方案測量這些轉染的細胞中的FRET時，清楚了證明了能量從 SrcECFP向EYFP-D371E的轉移(圖16B)。從三個獨立實驗中的共20 個細胞測量的FRET效率為10. 4到15. 6 (13. 2 ± 1.4)。這些數據表 明泵缺失Na+/K+-ATP酶像野生型ocl (10)—樣作用並且可以與Src 相互作用而形成信號傳導複合體。該結論進一步得到免疫共沉澱測定 法的支持，其表明大鼠ocl突變體可以被抗-Src抗體共沉澱(圖16C)。
FAK是已知的Src效應物，其在細胞遷移和增殖的調控中起重要 作用。Src的激活刺激FAK Tyr"s的磷酸化，其隨後也導致RDK1/2的 激活。為了檢查基礎Src活性的升高是否可以導致Src效應物的激活， 發明人測量了 otl敲減細胞中FaK的酪氨酸磷酸化。如圖17 A中所示， 細胞裂解物被抗磷酸酪氨酸抗體免疫沉澱，並且使用抗FAK抗體探測 免疫沉澱物。數據清楚地表明al敲減能夠增加酪氨酸磷酸化的FAK 的量。特別地，當探測細胞裂解物的Tyr(P) 925-FAK時，發明人發現 A4-11和PY-17細胞中Tyr(P) 925-FAK的顯著升高(圖17B)。有趣的 是，當測量總的ERK1/2和pERK1/2時，發明人發現PY-17細胞中活性 ERK 1/2的量的適度增加(圖170。這符合Tyr(P)"5-FAK的已知的功 能(19， 20)。該Tyr(P)9"的增加對Src抑制劑PP2敏感(圖17D)。重 要的是注意到FAK磷酸化與PP2處理的敲減細胞中活性Src水平良好 相關。總之，這些數據表明由於al敲減引起升高的Src活性可以刺 激Src效應物的酪氨酸磷酸化。這得到如下觀察的進一步支持泵缺 失突變體(D371E)的表達不僅恢復了基礎Src活性，而且降低了 PY-17 細胞中FAK Tyr化磷酸化(圖17E)。
Na+/K+-ATP酶的敲減消除了 Src和ERK1/2的烏本苷誘導的激活
因為^+/"—7 酶.Src複合體作為烏本苷的功能性受體以誘導 Src激活和ERK1/2的隨後刺激，所以上面的實施例導致發明人測試 Na+/K+-ATP酶的敲減是否影響烏本苷激活的信號轉導。如圖18A中所示，儘管烏本苷激活了 P-11細胞中的Src，但是烏 本苷的該效應在PY-17細胞中基本上被消除，而在A4-11細胞中觀察 到顯著降低。為了確定該抑制不是由於受體信號轉導的非特異性缺陷， 發明人也測量了 EGF對Src的作用。發明人發現表皮生長因子能夠刺 激P-ll和PY-17細胞中的SrcTyr(P)"8 (P-ll中2. 5 士 0. 3倍增加 對比PY-17中1. 7 ± 0. 2倍增加，n = 3)。與對於Src的發現相一 致，發明人也不能檢測PY-17細胞中ERKl/2磷酸化的任何烏本苷誘導 的改變(圖18B)。
相反，表皮生長因子能夠刺激PY-17細胞中的ERK1/2。這些數據 支持如下觀點Na+/K+-ATP酶實際上是烏本苷誘導的信號轉導的受 體。該觀點進一步得到圖18C和18D中給出的發現的支持，表明大鼠 a 1的敲入不僅恢復了烏本苷應答而且使AAC-19細胞中的劑量反應曲 線偏向右邊。
討論
在該實施例中，發明人不僅介紹了有效的且al特異性RNA千擾 測定法，而且提供了挽救^+/"41 酶耗盡的細胞的方案。這些方法 使得我們可能闡明細胞Na+/K+-ATP酶調控Src和其效應物FAK並且 Na+/K+-ATP酶.Src複合體作為烏本苷的唯一受體而激活活細胞中的 Src和隨後激活ERK1/2。
通過RNA幹擾測定法操作細胞內Na+/K+-ATP酶含量 RNA幹擾是最初在1998年在秀麗隱杆線蟲(Cse/7or力sM/〃s e/ega/2s)中發現的細胞機理，並且指通過雙鏈RNA觸發的內源mRNA 的降解進行的轉錄後基因沉默。其現在已經被開發為人工沉默多種生 物系統(包括培養的細胞和完整生物)中特定基因的有力工具。使用 Paul等人(2002)開發的策略和瞬時轉染測定法，發明人鑑定A4 siRNA 對於沉默ccl表達是有效的。從而，發明人用A4 siRNA表達載體轉染 豬LLC-PK1細胞並克隆了幾個穩定的細胞系。蛋白質印跡分析和免疫 染色測定表明克隆的細胞系中ocl的表達被顯著降低(圖11和l2和圖26-表2)。例如，PY-17細胞中otl為對照P-ll細胞中的僅僅約 8%。功能分析揭示al的耗盡導致PY-17細胞中烏本苷-敏感性ATP 酶活性降低80% (圖27-表3)。發明人現在開發了沉默培養的細胞 中內源ct 1的表達的有效方案。
為了測試al耗盡的細胞是否可以用於研究內源/突變al的信號 傳導功能，發明人用大鼠al表達載體轉染了 PY-17細胞，所述表達 載體中，A4 siRNA靶向的序列被沉默突變。通過利用與大鼠ocl特異 反應的抗體的可用性優點，發明人在本文中闡明內源大鼠al可以被 敲入並且大鼠otl的表達不僅恢復了總的細胞^+/1(+4了？酶蛋白質而 且恢復了 ^+/"41 酶活性。而且，大鼠ocl挽救的細胞(AAC-19)顯 示出與僅僅表達Na+/K+-ATP酶ocl亞基的大鼠細胞系相同的烏本苷 敏感性(圖13)。總之，這些數據表明發明人已經開發了操作細胞 Na+/K+-ATP酶的有效方案。
該方案與廣泛使用的烏本苷選擇方案相比，為在烏本苷敏感細胞 系中表達突變Na+/K+-ATP酶方面提供了額外的優點(23-26)。
首先，本方案使得可能耗盡內源化+/""^7 酶，允許發明人研究 Na+/K+-ATP酶表達的降低對細胞功能的影響。
其次，本方案不需要使用烏本苷以強迫表達轉染的Na+/K+-ATP 酶。在考慮最近的研究中這是重要的，所述研究表明烏本苷刺激 Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能並且誘導該酶的胞吞作用。
第三，本方案可用於測定具有極低(小於10% )的內源Na+/K+-ATP 酶的細胞中的內源/突變Na+/K+-ATP酶。
第四，所鑑定的A4 siRNA可用於沉默來自不同於人和豬的物種的 細胞中的ocl表達，因為A4 siRNA靶向的人al cDNA序列(核苷酸 2293到核普酸2312) [SEQ ID N0: 38]在從魚類到人的所有鑑定的a 1
亞基(但不是其他同種型)中是保守的。
第五，用不同同種型的Lp挽救PY-17細胞，Na+/K+-ATP酶提供
了揭露同種型特異性信號傳導功能的通路。Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶庫
Na+/K+-ATP酶存在於具有Src的胞膜窖中。FRET分析表明信號傳 導Na+/K+-ATP酶和Src可能相互作用並形成功能性受體複合體。體外 結合測定法表明otl亞基和Src可以通過多個結構域直接相互作用並 且該相互作用保持Src處於無活性狀態。發明人現在認為存在 Na+/K+-ATP酶的Src相互作用庫，其不僅調控基礎Src活性，而且作 為烏本苷的受體以刺激多種效應物的依賴Src的酪氨酸磷酸化。
首先，因為信號傳導Na+/K+-ATP酶結合Src並保持其處於無活性 狀態，所以發明人現在認為內源Na+/K+-ATP酶的減少將耗盡 Na+/K+-ATP酶的Src相互作用庫，從而導致Src激活。實際上，如圖 14中所示，oil敲減細胞含有比對照P-ll細胞更高活性Src。重要的 是提到ctl敲減確實引起PY-17細胞中細胞內Na+濃度的顯著升高。然 而，當通過fura-2測量細胞內Ca2+時，PY-17細胞中的穩態Ca"與P-ll 細胞中的相當。從而，Src活性的增加不可能是由於細胞內Na+或Ca2+ 的改變。
其次，當通過大鼠ocl挽救ocl敲減的PY-17細胞時，發明人觀察 到大鼠al的敲入足夠耗盡Src相互作用的血+/1[+^1 酶庫，導致基 礎Src活性的恢復。
第三，因為當前所述的體外結合測定法表明al的第三個細胞內 結構域與Src相互作用並抑制Src活性，發明人現在認為大鼠ocl的 泵缺失突變體應該能夠結合併抑制活細胞中的Src。實際上，發明人 發現將大鼠a 1突變體D371E敲入PY-17細胞也能夠耗盡Na+/K+-ATP 酶的該Src相互作用庫並減少活性Src的量(圖15)。
另外，FRET分析和免疫共沉澱測定法表明泵缺失突變體可以與活 細胞中的Src相互作用(圖16)。因為泵缺失突變體的表達不降低PY-17 細胞內的細胞內Na+濃度，所以這些數據也表明Na+ZK+-ATP酶可以獨 立於細胞內Na+濃度的改變與Src相互作用並調控Src。
FAK涉及細胞增殖、細胞存活和細胞遷移的調節。它也是Src的 效應物之一。活性Src與FAK的結合導致FAK的完全激活和FAK Tyr925的酪氨酸磷酸化，其導致一些下遊信號傳導分子的裝配，其中包括
￡110/2的激活。發明人發現細胞^+/1[+41 酶的耗盡不僅激活了 Src， 而且刺激了 FAK的酪氨酸磷酸化。PP2對Src的抑制或者泵缺失ocl 突變體的敲入減少了 PY-17細胞中的Tyr(P) 925-FAK (圖17)。相一致 的是，發明人也觀察到烏本苷刺激了對照LLC-PK1細胞中的Src和隨 後刺激了 FAK。這些發現是重要的。首先，它們支持如下觀點 化+/1(+41 酶是蛋白激酶的重要調控物。其次，Na+/K+-ATP酶對Src 和3^效應物？人1(的調控作用依賴於^+/1[+41 酶與蛋白質相互作用 而不依賴泵送離子的能力。第三，al耗盡誘導的Src激活能夠產生 下遊通路。發明人也注意到FAK在細胞運動性的調控中起關鍵作用並 且上皮細胞中ctl的耗盡影響緊密連接的形成和細胞運動性。從而， 發明人現在認為al耗盡和隨後FAK的激活在細胞遷移的調控中的作 用是重要的。
烏本苷誘導的信號轉導似乎通過Src的激活啟動。因為烏本苷使 用Na+/K+-ATP酶.Src複合體作為功能性受體，所以發明人現在認為 Src的烏本苷誘導的激活應該與Src -相互作用的Na+/K+-ATP酶庫的 大小相關。實際上，發明人發現烏本苷對Src激活的作用與Na+/K+-ATP 酶的細胞水平反相關。儘管烏本苷誘導A4-11細胞中Src的適度激活， 但是它不能激活PY-17細胞中的Src。因為需要Src將烏本苷信號傳 遞到許多下遊效應物，所以本文的實施例進一步表明a/K-ATP酶'Src 複合體是烏本苷引起蛋白質信號級聯的唯一受體。這得到下面觀察的 進一步支持。首先，用大鼠al挽救PY-17細胞恢復了烏本苷對Src 和ERKl/2的作用。其次，因為所挽救的細胞表達烏本苷不敏感的大鼠 ocl，所以需要高得多的烏本苷濃度來刺激AAC-19細胞中的Src和隨 後刺激ERK 1/2 (圖18)。第三，發明人已經開發了用於操作細胞 Na+/K+-ATP酶的有用的方案，其允許進一步表徵Na+/K+-ATP酶的信 號傳導性質。第四，這些新的發現表明舷+/"41 酶是重要的受體， 其能夠通過蛋白激酶傳遞烏本苷信號。第五，因為Src活躍地參與細 胞生長的控制，本文的發明人現在表明需要再次檢查Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制和烏本苷引發的對Src激活是否在癌症生物學中起 重要作用的問題。
實施例III
在圖19A-D中顯示了與Src相互作用並抑制Src的Na+/K+-ATP 酶中特定結構域的進一步作圖。結果顯示含有57個胺基酸的ND1結合 Src。圖19A顯示了 ^+/1(+4丁？酶al和CD3結構域的方案。圖19B 顯示 了 ND1的胺基酸序列[SEQIDNO. 1]
VFQANQ1,
圖19C顯示了使用GST標記的ctl截短物和His-Src的體外結合 測定法。
圖19D顯示了該肽在不同物種和不同同種型的Na/K-ATP酶中是保 守的[SEQ ID NO. 2-33]。
實施例IV
圖20A-C中顯示了與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src中的特定結構 域的進一步作圖。結果表明含有54個胺基酸的KDl結合Na+/K+-ATP 酶。圖20A顯示了 Src和其激酶結構域的示意性結構。圖20B顯示了 來自Src的KDl肽與Na+/K+-ATP酶結合。[SEQ ID NO: 34]
KLRHE1.
圖20C顯示了使用GST標記的Src截短物和純化的Na+/K+-ATP 酶的體外結合測定法。
實施例V
活性測定法證實ND1和KDl參與Src的Na+/K+-ATP酶介導的調控。 圖21顯示Na+/K+-ATP酶的GST-ND1抑制Src活性並且該抑制效果可 以被Src的GST-KD1竟爭。
圖22A-B顯示ND1有效阻斷活細胞中的Src活性。ND1、 ND和CD3降低LLC-PK1細胞中的Src磷酸化。圖22A顯示LLC-PK1細胞用YFP-標記的ND1、 ND和CD3瞬時轉染2卩小時。細胞然後在RIPA緩沖液中 裂解並探測pY418。也將YFP瞬時轉染到LLC-PK1細胞中作為對照。 圖22B顯示了來自三個實驗的定量數據。* p<0. 05。
實施例VI
ND1也抑制前列腺癌細胞(DU145)生長。圖23顯示YFP-ND1終止 人前列腺癌細胞(DU145)生長。用Lipofectamine 2000將2. 0 ju g pYFP-Cl或pYFP-Cl-NDl質粒轉染到LLC-PK1細胞中。48小時後，用 臺盼藍染色來計數細胞數。
實施例VII
鑑定P3作為有效的Src抑制劑ND1的作圖已經鑑定了來自ND1 的20個胺基酸的肽(P-3)抑制Src。圖24A-B表明來自ND1的肽3顯 著抑制Src活性。圖24A顯示了 P3肽序列[SEQ ID NO: 2]. (SATWLALSRIAGLCNRAVFQ)
圖24B顯示了當純化的Src與P-3肽在37C溫育20分鐘並加入2 mMATP額外溫育5分鐘時的結果。通過加入5X上樣緩衝液終止反應。 探測pY418來測量Src激活。
圖28顯示了增強大分子的細胞膜滲透性的肽(TAT和AP )的序列。
TAT或AP與P3的綴合使得細胞膜可滲透圖29A顯示了 TAT或 AP綴合的Src肽抑制劑(TAT-P3或AP-P3)的序列。圖29B顯示了新肽 在體外抑制Src。圖29C顯示FITC綴合的TAT-P3被靶向至細胞膜。 圖29D顯示向DU145細胞加入TAT-P3或AP-P3抑制細胞生長。
儘管本發明已經參考多種和優選的實施方案進行了描述，但是本 領域技術人員應當理解可以進行多種改變並且等同方案可以替代其要 素而不背離本發明的基本範圍。另外，可產生許多修改使具體的條件
或材料適應本發明的教導而不脫離其基本範圍。因此，本發明旨在不 限於預期用於實施本發明的本文公開的具體實施方案，而是本發明將包括落入權利要求範圍內的所有實施方案。 參考文獻
將上面討論的參考文獻和下面的參考文獻(在它們提供的補充本 文給出方案的示例性程序或者其他細節的程度上)特別引入本文作為 參考。本文參考文獻的引用將不被理解為承認其是本發明的現有技術。Abram， C. L., and Courtneidge， S. A. (2000). Src family tyrosine kinases,and growth factor signaling. Exp. Cell Res. 254, 1—13.
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權利要求
1.調控Src和其下遊信號傳導通路的方法，其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結合。
2. 誘導烏本普引起的信號轉導的受體，其包含化+/1(+47 酶/3^ 或Src家族激酶的複合體。
3. 靶標，其包含^+/"41 酶和Src或Src家族激酶之間的相互 作用位點。
4. 藥物組合物，其用於調控涉及控制細胞生長、運動性、活性氧 (ROS)的產生、por-膠原合成和肌肉收縮的多種信號傳導通路，所述組合物包含一種或多種Src和Src家族激酶抑制劑或激活劑。
5. 權利要求4的組合物，其包含一種或多種肽或肽片段，其抑制 或刺激Na+/K+- ATP酶的信號傳導功能並且不抑制Na+/K+- ATP酶的離 子泵功能。
6. 權利要求4的組合物，其中所述抑制劑不直接與ATP竟爭。
7. 包含Na+/K+-ATP酶或Src序列的Src抑制劑或激活劑，其幹擾 Src和Na+/K+- ATP酶之間的相互作用，通過與ATP類似物不同的機理 發揮作用，並且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。
8. 治療組合物，其包含至少一種權利要求7的肽Src抑制劑或激 活劑。
9. 開發小分子的方法，所述小分子模擬權利要求7的肽抑制劑或 激活劑，通過與ATP類似物不同的機理髮揮作用，並且是通路 (Na+/K+-ATP酶)特異性的。
10. 包含Na+/K+-ATP酶的信號轉導物，其介導與癌細胞生長、心 髒纖維質生成、缺血/再灌注損傷、肌肉收縮或尿毒症心肌病有關的一 種或多種信號傳導通路。
11. 包含在Src或Na+/K+-ATP酶cx 1亞基中發現的功能結構域的 組合物，其中Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制是由於所述oc亞基或 其他P型ATP酶的ot亞基的N結構域和Src激酶結構域之間的相互作用。
12. 權利要求ll的組合物，其包含ND1肽，或其片段。
13. 來自ND1的肽，其足夠結合Src以及其他Src家族激酶，包括 但不限於Lyn，和抑制它們的活性。
14. 來自Src激酶結構域(KD1)或其他Src家族激酶的類似結構域 的肽，其能夠與Na+/K+-ATP酶結合併通過竟爭Src的結合基序而有效 激活Na+/K+-ATP酶抑制的Src。
15. 肽，其用於激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性Src或Src 家族激酶。
16. 包含肽或其片段的Src抑制劑和/或激活劑，所述肽或其片段 靶向i)與Na+/K+-ATP酶或者Src特異相互作用而不是竟爭ATP結合， 和ii)提供Src活性的通路特異性調節的區域。
17. 各Src家族激酶的同種型特異性Src抑制劑和/或激活劑，所 述激酶包括具有序列或其片段的激酶，其中使用也結合該激酶結構域的 Na+/K+-ATP酶的一個或多個a亞基開發所述序列或其片段。
18. 小分子，其包含權利要求16的同種型特異性Src抑制劑和/ 或激活劑。
19. 用於大規模和高通量篩選的快速篩選測定法，其包括 Na+/K+-ATP酶和至少一種Src或Src家族激酶之間的相互作用。
20. 治療蛋白激酶相關的疾病狀態的方法，該方法包括對需要其的 受試者施用治療有效量的至少一種權利要求3或4的組合物。
21. 權利要求19的方法，其中所述疾病狀態涉及^f吏用Src或Src 家族激酶作為效應物的非受體酪氨酸激酶或者受體酪氨酸激酶。
22. 權利要求19的方法，其中所述疾病狀態涉及包含Src的細胞 酪氨酸激酶。
23. 權利要求19的方法，其中所述疾病狀態包括癌症或者腎臟或 心血管相關的疾病。
24. 物質的組合物，其包含a)具有5到50個胺基酸長度的肽， 該肽包含選自任一種如本文所述的肽序列的基序和b)第一種可檢測的 部分，其中所述第一種可檢測的部分與該肽結合。
25.組合物，其包含圖19B中所示的序列[SEQ ID NO l]或者基於 該序列開發。
26，組合物，其包含圖20B中所示的序列[SEQ ID NO 34]或者基 於該序列開發。
27. 組合物，其包含圖24A中所示的肽序列[SEQ ID NO 2]或者基 於該肽序列開發。
28. 組合物，其包含^+/"-ATP酶和Src或Src家族激酶之間相 互作用的結構信息或者基於該信息開發。
29. 小分子Src抑制劑或激活劑，其被開發以靶向Na+/K+-ATP酶 和Src或Src家族激酶之間的相互作用或基於該相互作用開發。
30. Src抑制劑或激活劑，其基於NA+/K+-ATP酶或其他P-ATP酶 和Src或Src家族激酶之間的相互作用開發。
31. 開發鑑定的Na+/K+-ATP酶/Src受體複合體的激動劑或拮抗劑 的方法。
32. 組合物，其包含基於^+/"41 酶/31:(;複合體開發的激動劑 或拮抗劑。
33. 治療組合物，其包含至少一種權利要求32的激動劑或拮抗劑。
34. 對培養的細胞中操作細胞^+/"4丁？酶的方法，其包括用A4 siRNA表達載體轉染細胞，從而降低克隆的細胞中Na/K-ATP酶的表達。
35. 至少部分沉默培養的細胞中內源otl的表達的方法，其包括用 A4 siRNA表達載體轉染細胞，從而降低克隆的細胞中ocl的表達。
36，耗盡內源Na+/K+-ATP酶而不需要使用烏本苷以迫使表達轉染 的Na+/K+-ATP酶的方法，其包括使用A4 siRNA以沉默來自希望的物種， 包括人和豬的細胞中的ocl表達。
37. 包含GST-NT (胺基酸殘基6-90) [SEQ ID N0 51]的表達載體。
38. 包含GST- CD2 (胺基酸殘基152-288 ) [SEQ ID NO 52]的表達 載體。
39. 包含GST- CD3 (胺基酸殘基350-785 ) [SEQ ID NO 53]的表達 載體。
40. 包含GST-H+/K+-CD3 [SEQ ID NO 54]的構建體。
41. 包含GST-SERCA-CD3 [SEQ ID NO 55]的構建體。
42. 基於siRNA的測定法，其經配置以測定Na+/K+-ATP酶的量和 性質的改變對基礎的和烏本苷刺激的Src活性的影響。
43. 用於測定外源的/突變的a l的信號傳導功能的ot l耗盡細胞， 該細胞通過用al表達載體轉染敲減的細胞來製備，所述載體中A4 siRNA 靶向的序列被沉默突變，其中外源al被敲入並且al的表達被恢復，不 僅總的細胞^+/"-ATP酶蛋白，而且^+/"-ATP酶活性都被恢復。
全文摘要
公開了調控Src和其下遊信號傳導通路的方法，其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結合。Na+/K+-ATP酶/Src複合體是強心類固醇如烏本苷的功能性受體。還公開了Src抑制劑或激活劑，其包括幹擾Na/K-ATP酶和Src之間相互作用的Na+/K+-ATP酶或Src，通過不同於ATP類似物的機理髮揮作用，並且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。
文檔編號A61K31/17GK101541319SQ200780043725
公開日2009年9月23日 申請日期2007年10月31日 優先權日2006年10月31日
發明者J·I·沙皮羅, J·田, Z·謝 申請人:託萊多大學