黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法

2023-06-10 19:59:26 1

專利名稱：黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，屬於植物生物技 術領域。
背景技術：
黃瓜細菌性角斑病(Pseudomopnas syringae pv. lachrymans)是一種重要的細菌 性病害。致病菌為丁香假單孢桿菌黃瓜致病變種，屬薄壁菌門假單孢菌屬。發病初始產生 水漬狀小斑點，擴大後受葉脈限制，病斑呈多角形，淡黃色至褐色，邊緣有黃色暈環，發病嚴 重時，病斑布滿葉片，使葉片乾枯捲曲脫落。該病在保護地及露地生產中均有發生，且以露 地危害最重，造成嚴重減產。近年來隨著黃瓜種植面積的不斷擴大，此病已成為黃瓜生產中 亟待解決的問題。關於黃瓜細菌性角斑病生物防治主要集中在選用優良抗病品種、種子消 毒、培育無病苗、加強栽培管理、生態防治和化學藥劑防治等幾個方面。目前對於黃瓜與細 菌性角斑病相互作用的分子機理仍不清楚，許多關於病原菌基因和黃瓜抗病基因的結構和 功能作用方式仍不清晰，因此尋找與黃瓜抗細菌性角斑病基因緊密連鎖的分子標記，對於 加快黃瓜育種進程具有重要的實際應用價值。

發明內容
本發明的目的是針對上述存在的問題提供一種黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子 標記鑑定方法，能夠更好地利用上述黃瓜抗病基因分子標記，並將黃瓜抗細菌性角斑病分 子標記應用於黃瓜育種的輔助選擇。上述的目的通過以下的技術方案實現黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，該方法包括如下步驟以細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進 行PCR擴增，對擴增產物進行3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴增產物進行7.5%的變性聚 丙烯醯胺凝膠電泳檢測，如果擴增得到的帶型與已知的抗細菌性角斑病的黃瓜東農803帶 型一致，則該細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品係為抗細菌性角斑病品種或品系，所 述PCR擴增的程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，57°C退火lmin，35個循環，72°C延伸 lmin，72°C延伸lOmin，最後4°C保存，所述的CSWCT24A為引物 1 5，-AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3，，引物 2 5，-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3，。所述的黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，所述PCR擴增中，每 20μ 1 的 PCR 反應體系如下10 X buffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1，lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 :10. 7μ 1。黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法在輔助選擇抗病黃瓜材料中的應用。
有益效果1.本發明直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測 到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題，因此，本發明能夠克服黃瓜細菌性角斑病 抗性鑑定易受環境影響的缺點，在苗期就能夠通過分子標記對黃瓜品種和品系的細菌性角 斑病抗性進行鑑定和篩選，淘汰感病植株，減少人力和物力的浪費，提高育種效率。同時， DNA分子標記技術操作簡單，成本低廉，用時短，在一天內即可完成全部的檢測過程。通過高 效率的分子標記檢測，還能夠減少農民的農藥用量，降低生產成本，提高其經濟收入，也可 以有效減輕農藥對環境產生的汙染和危害。2.所需樣本數量少，操作比較簡便，效率高，成本低廉。3.本發明易於掌握，不受環境條件影響，重複性高。


圖1黃瓜抗細菌性角斑病基因分子標記的瓊脂糖電泳檢測結果(東農804)，圖中 M :DL2000DNA Marker ；1，抗病對照東農 803 ；2-3，東農 804 單株。圖2黃瓜抗細菌性角斑病基因分子標記的瓊脂糖電泳檢測結果(東農80 ，圖中 M :DL2000 DNA Marker ；1，抗病對照東農803 ；2 8 東農805單株。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試 驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。所有引物合成均由生工生物 工程(上海)有限公司完成。以下實施例中所有用到的黃瓜材料均為公知的。實施例1 黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，該方法包括如下步驟以細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進 行PCR擴增，對擴增產物進行3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴增產物進行7.5%的變性聚 丙烯醯胺凝膠電泳檢測，如果擴增得到的帶型與已知的抗細菌性角斑病的黃瓜東農803帶 型一致，則該細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品係為抗細菌性角斑病品種或品系，所 述PCR擴增的程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，57°C退火Imin，35個循環，72°C延伸 lmin，72°C延伸lOmin，最後4°C保存，所述的CSWCT24A為 引物 1 5，-AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3，，引物 2 5，-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3，。實施例2 所述的黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，所述PCR擴增中，每 20μ 1 的 PCR 反應體系如下10 X buffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1，lOpmol/μ 1 的 Primer 1 O. 8 μ 1, lOpmol/μ 1 的 Primer 2 :0. 8 μ l,25mM MgCl2 2. 5μ l,5U/y 1 的 TaqDNA 聚合酶 0. 2μ l,60ng/y 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 :10. 7μ 1。實施例3 黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法在輔助選擇抗病黃瓜材料中的應用。
以東北農業大學園藝學院黃瓜課題組培育出的黃瓜雜交新品種東農804和東農 805為材料；提取其單個植株DNA為模板，以本發明提供的1個黃瓜抗細菌性角斑病特異分 子標記CSWCT24A為引物進行PCR擴增，結果表明，東農804和東農805單株的PCR擴增帶型 與抗病對照東農803擴增帶型完全一致，且PCR檢測結果與田間細菌性角斑病抗性鑑定的 吻合率為100%，證明了 CSWCT24A是一個實用的黃瓜細菌性角斑病抗性檢測的分子標記。
權利要求
1.一種黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，其特徵是該方法包括如下步 驟以細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進行 PCR擴增，對擴增產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴增產物進行7. 5%的變性聚丙 烯醯胺凝膠電泳檢測，如果擴增得到的帶型與已知的抗細菌性角斑病的黃瓜東農803帶型 一致，則該細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品係為抗細菌性角斑病品種或品系，所述 PCR擴增的程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，57°C退火Imin, 35個循環，72°C延伸 lmin，72°C延伸lOmin，最後4°C保存，所述的CSWCT24A為引物 1 :5』 -AGGACATTGGGAACTGCTATGGAT-3，，引物 2 :5，-GAATTCTGTTCTTGGAAGAGTATC-3，。
2.根據權利要求1所述的黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法，其特徵 是所述PCR擴增中，每20 μ 1的PCR反應體系如下=IOXbuffer :2μ l，2mM dNTP :2 μ 1， lOpmol/μ 1 的 Primer 1 :0. 8 μ 1，IOpmol/μ 1 的 Primer 2 0. 8μ l,25mM MgCl2 :2. 5 μ 1， 5U/ μ 1 的 TaqDNA 聚合酶0. 2 μ 1，60ng/ μ 1 的模板 DNA 1 μ 1，ddH20 10. 7 μ 1。
3.—種上述黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法在輔助選擇抗病黃瓜材料 中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種黃瓜抗細菌性角斑病基因的分子標記鑑定方法。本發明的方法包括以細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品系的DNA為模板，以CSWCT24A為引物進行PCR擴增，對擴增產物進行3％瓊脂糖凝膠電泳檢測或者對擴增產物進行7.5％的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，如果擴增得到的帶型與已知的抗細菌性角斑病的黃瓜東農803帶型一致，則該細菌性角斑病抗性未知的黃瓜品種或品係為抗細菌性角斑病品種或品系，所述PCR擴增的程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，57℃退火1min，35個循環，72℃延伸1min，72℃延伸10min，最後4℃保存。本發明用於鑑定黃瓜抗細菌性角斑病基因。
文檔編號C12Q1/68GK102102128SQ201010575818
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月7日 優先權日2010年12月7日
發明者周秀豔, 武濤, 王麗莉, 秦智偉, 辛明 申請人:東北農業大學