阿黴素與乳糖胺化白蛋白的軛合物的用途的製作方法

2023-06-11 00:31:21 1

專利名稱：：阿黴素與乳糖胺化白蛋白的軛合物的用途的製作方法阿黴素與乳糖胺化白蛋白的輒合物的用途本發明的目的是阿黴素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用於製備治療不表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的肝細胞癌(HCC)的藥物組合物的用途。該軛合物的製備和研究先前只用於治療表達ASGP-R的HCC,現在其意外的顯示出還具有治療沒有受體的HCC的有利用途的潛力。因此，含有該輒合物的組合物可以對所有的HCC施用，而不必經過預先腫瘤組織活檢來證明受體存在與否。在之前的實驗中我們耦合阿黴素(DOXO)和乳糖胺化人白蛋白(L-HSA)以增強藥物的抗癌症活性並降低其治療那些細胞表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的肝細胞癌的毒副反應(DiStefanoG，etal.Doxorubicincoupledtolactosaminatedhumanalbumin...DigLiverDis2003;35;428隱433;FiumeL,etal.Doxorubicincoupledtolactosaminatedalbumin...JHepatol2005;43;645-652)。HCC是抗化療試劑的肺瘤；DOXO具有抗HCC活性，但是在有效劑量下顯示了嚴重的不良反應(LlovetJM.Updatedtreatment...JGastroenterol2005;40:225-235)。DOXO的毒害效應主要產生在心臟、骨髓和腸(MazueG，etal.Anthracydines:areview...IntJOncol1995;7:713-26)。ASGP-R僅存在於肝細胞的表面。其介導半乳糖基末端肽段的吞噬和溶酶體降解(AshwellGetal.Carbohydrate-specific…AnnuRevBiochem1982;51:531-534),並能用作載體來選擇性地將藥物傳遞到肝實質細胞(FiumeL,etal.Livertargetingofantiviralnucleosideanalogsthroughtheasialoglycoproteinreceptor.JViralHep1997;4:363-370)。L-HSA是一種半乳糖基末端的擬糖蛋白，其已經成功用作人體內的肝耙向藥物載體(TorraniCerenziaMR,etal.Adeninearabinosidemonophosphate...Hepatology1996;23:657-661;ZarskiJP,etal.EfficacyandsafetyofL-HSA-ara-AMP...JHepatol2001;34:487-488)。DOXO通過酸敏感的腙鍵耦合到L-HSA,該鍵允許DOXO從包涵體和溶酶體內的載體上月包內釋》文出來(GreenfieldRS,etal.Evaluationinvitroofadriamycin...CancerRes1990;50:6600-6607)。(該共輒步驟由Bologna大學提交的一份專利覆蓋(PCT/IT2005/000257)。ASGP-R保持在大部分高分化(WD)的人HCC瘤細胞上，然而在大部分低分化(PD)HCC上卻並不表達(HyodoI,etal.Distributionofasialoglyc邵.rote.in.recepto:r…Liver1993;13:80-85;TrereD,etal.Theasialoglycoproteinreceptor...BrJCancer1999;81:404-408;Sawa.muraT,etal,"Hyperasialoglycoproteinemiainpatients..."Gastroenterology1984;87:1217-1221)。人HCC上的ASGP-R的存在與否可以通過針刺活檢或外科手術切除的腫瘤碎片進行免疫組化來測定。在二乙基亞硝胺誘發HCC的大鼠中，已經在所有7種高分化腫瘤中發現了通過ASGP-R內在化L-HSV的能力，在5種中度分化腫瘤中有4種具有該能力，而在5種低分化HCC中僅觀察到2種能捕獲L-HSA的低能力(DiStefanoG,etal.EnhanceduptakeoflactosaminatedL,LiverInt2005;25:854-860)。在放射性L-HSA-DOXO的HCC分布和大鼠器官分布實驗中，我們得到2個意外且相關的觀察結果1-PDHCC內化輒合物的量是L-HSA的3倍2-在所有類型的HCC中，無論它們的分化程度，軛合物產生的高濃度DOXO是那些在腸和心臟中測定的5-8倍。材料和方法L[14C]HSA-DOXO的合成和表徵人白蛋白(HSA)從Kedrion處獲得(Lucca,Italy),用SephacrylS-200HR(Sigma,StLouis,MO，USA)凝膠過濾並收集單體(>起始材料的90%)使用。HSA用["C]蔗糖標記。["C]蔗糖是一种放射性示蹤劑，其會保留在進入的細胞內，從而允許準確測定組織中的蛋白攝取(PittmanRC,etal,"Radiolabeledsucrose..."JBiolChem.1979;254:6876-6879)。[14C]蔗糖(500mCi/mmol,Amersham,Buckinghamshire,UK)稀釋至特異活性3.2xl05dpm/嗎。根據PittmanRC等("Radiolabeledsucrose..."JBiolChe亂1979;254:6876-6879)，將["C]蔗糖耦合到HSA上。因為該方法會引起蛋白寡聚，因此對標記的HSA進行SephacrylS200HR柱凝膠層析，同時收集單體(製備的70%)。根據LowryOH等("Proteinmeasurement..."JBiolChem.951;193:265-275),通過放射活性計數以及測定蛋白來測定["C]蔗糖/HSA的摩爾比，結果是0.2。通過還原胺化反應(WilsonG."Effectof■reductivelactosamination…"JBiolChem1978;253:2070-2072)將a-享L糖(Sigma)耦合到["C]HSA上。根據DuboisM等人("Colorimetricmethodfordetermination..."AnalChem1956;28:350-356)的方法測定4唐來確定乳糖/["C]HSA的摩爾比，結果是26。採用藥物(DOXO-EMCH)的(6-馬來醯亞胺己醯)腙衍生物將DOXO耦合到L-[14C]HSA上，依據WillnerD等人的方法("(6-maleimidoca:proyl)hydrazonederivative..."BioconjChem1993;4:521-527)合成。根據DiStefanoG等人("Anovelmethodforcoupling..."EurJPharmSci2004;23:393-397)的方法耦合DOXO-EMCH和L-["C]HSA，這裡附上供參考，但是使混合物在20。C反應。根據LowryOH等(Proteinmeasurement...JBiolChem1951;193:265-275),測定蛋白濃度以及以X495的吸光度表示的DOXO[DOXO-EMCH的s495(pH7.4)=9250M"cm"]來計算DOXO/L-["C]HSA的摩爾比，結果是5.8(24mg軛合物中含有1mgDOXO;24mg軛合物中含有22.5mgL-HSA)。大鼠的HCC誘發；腫瘤和器官中軛合物和DOXO濃度的分布採用雄性Wistar大鼠，從HarlanItaly(Udine,Italy)處獲得，並在Bologna的實驗病理系的動物實驗室飼養。實驗方案通過Bologna大學倫理委員會的批准。持續8周在飲用水中加入二乙基亞硝胺(DENA)(100mg/L)以誘發HCC。在最後一天DENA施用後的6-8周，對動物進行靜脈注射以下化合物L-["C]HSA(22.5嗎/g)、L-["C]HSA-DOXO(24嗎/g,對應於22.5(ig/gL-["C]HSA和1pg/gDOXO)和游離的DOXO(1fig/g)。在異氟烷麻醉下，化合物從陰莖背靜脈注射，注射量為10fil/10g體重。每種化合物使用4隻大鼠。動物注射4小時後異氟烷麻醉下使大鼠致死。迅速轉移器官並冷凍，同時從肝周圍精確地將瘤結節分離出來。冷凍每種瘤結節的一部分；其他部分用10%的福馬林固定用於組織學處理。冷凍的器官和瘤結節樣品用於放射活性計數和測定DOXO水平。根據BotsAM等(Analysisofadriamycin…JChromatogr1983;272:421—127)的方法及其》務正方法(DiStefan.oG,etal.Doxorubicincoupledtolactosarninated…DigLiverDis2003;35:428-433)測定了DOXO。結果大鼠中，DENA誘發了高分化、中度分化和低分化形式的HCC(分別是WD、MD、PDHCC)。它們顯示與人HCC相吻合的組織特徵。如DiStefanoG等("Enhanceduptakeoflactosaminated..."LiverInt2005;25:854-860)所描述的，WDHCC瘤性肝細胞與嗜酸性細胞質是同形的；它們與其非瘤性的對應部分形似，都具有帶梁的圖案和介入的血管空間。在PDHCC中，腫瘤組織顯示固體外形；瘤細胞呈嗜鹼性細胞質多態狀。MDHCC顯示的組織外形介於WD和PDHCC之間。表1顯示了HCC、心臟和腸中的L-["C]HSA和L-["C]HSA-DOXO的分布。與DiStefanoG等("Enhanceduptakeoflactosaminated..."LiverInt:2005;25:854-860)相一致，在6個檢查的PDHCC中，有4個的L-["C]HSA濃度比不表達ASGP-R(dpm/g/SA=9.1±0.1)的器官心臟和腸中測定的低。PDHCC內在化軛合物L-["C]HSA-DOXO的量比L-["C]HSA高4倍(p=0.004，根據Student'st檢驗)，並且軛合物進入到所有7個檢查的PDHCC中，其量至少是心臟和腸中攝取的7倍。一個重要的發現是注射扼合物的動物中，DOXO的濃度比心臟和腸中測定的分別高8倍和5倍(p=0.006)。相反，注射游離藥物的動物中，心臟和腸中測定的DOXO濃度比HCC中測定的要高(表2)。總之，對比沒有輒合的DOXO,L-HSA-DOXO出現在所有類型的HCC中，其中的藥物濃度高於DOXO毒害效應的靶向器官心臟和腸，並且獨立於腫瘤的分化程度和內在化L-HSA的能力。因此，此前在治療保持內在化暴露半乳糖基的蛋白質的能力的HCC中，通過製備輒合物用於增強抗瘤效應和減少DOXO毒性，而在本觀察結果的基礎上，該軛合物顯示了提高DOXO治療所有類型HCC的化療指數的潛力，包括低分化類型，其在肝外組織中顯示沒有或者^艮低的累積L-HSA的能力。因此，本發明的目的是L-SA-DOXO，且尤其是L-HSA-DOXO在治療所有HCC中的用途，無論其細胞是否表達ASGP-R。因此，授權的專利要求L-SA-DOXO軛合物在HCC化療中的用途，該用途不需要預先研究ASGP-R存在與否，從而避免進行腫瘤活4全和相應的風險。而且，本專利要求保護L-SA-DOXO軛合物在不表達ASGP-R的HCC化療中的用途的權利。表1L-["C]HSA和L-[14C].HSA-DOXO在不同等級的H.CC、心臟和腸內的分布化合物dpm/g/SAa)wdhccmdhccpdhcc心臟腸:l-[14c]hsab'178.3±12.485.6±4.432.6±14.98.7±0.98.9±1.5(6)d)(5)(6)l-[14c]hsa-180.9±27.8135.5±19.3124.8±20.29.0±0.89.8±0.8dox(:)c(10)m試驗的細節描述在材料和方法中。在靜脈注射化合物後4小時，殺死大鼠。對每一種化合物來說，使用4隻動物。數據是平均值土標準誤差。a)SA=特異活性b)以22.5嗎/g的劑量注射L-[14C]HSA。c)以24|ig/g的劑量(24嗎含有22.5|igL-[14C]HSA和1嗎DOXO的軛合物)注射L-[14C]HSA-DOXO。d)檢驗的HCC的數目。表2在施用L-["C].H.SA-DOXO和游離的DOXO之後，在不同等級的HCC、心臟和腸內測得的DOXO濃度tableseeoriginaldocumentpage8試驗的細節描述在材料和方法中。數據是平均值士標準誤差。a)在注射了軛合的DOXO的動物體內測量了游離藥物，即從細胞內的載體L-HSA釋放的。b)以24pg/g的劑量(24嗎含有1jigDOXO的軛合物)注射L-[14C]HSA-DOXO。c)以1ug/g的劑量注射DOXO。d)檢驗的HCC的數目。權利要求1.阿黴素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用於製備治療肝細胞癌的藥物組合物的用途，其中所述方法並不包括預先證明腫瘤細胞內是否存在去唾液酸糖蛋白的受體。2.阿黴素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用於製備治療不表達去唾液酸糖蛋白受體的肝細胞癌的藥物組合物的用途。3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於施用所述軛合物並不包括預先證明所述肺瘤細胞內是否存在去唾液酸糖蛋白的受體。4.根據前述任一項權利要求所述的用途，其特徵在於所述乳糖胺化白蛋白是乳糖胺化人白蛋白。5.根據前述任一項權利要求所述的用途，其特徵在於所述藥物組合物通過非腸道途徑施用。6.根據權利要求5所述的用途，其特徵在於所述藥物組合物通過靜脈注射途徑、通過推注或通過輸注施用。7.根據前述任一項權利要求所述的用途，其特徵在於所述藥物組合物是水溶液。8.根據權利要求7所述的用途，其中所述水溶液含有賦形劑和/或藥學上可接受的輔佐劑。全文摘要本發明涉及阿黴素與乳糖胺化白蛋白的軛合物用於製備治療不表達去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)的肝細胞癌(HCC)的藥物組合物的用途。該軛合物的製備和研究先前只用於治療表達ASGP-R的HCC，現在其顯示出具有治療沒有受體的HCC的有利用途的潛力。因此，含有軛合物的組合物可以施用所有的HCC治療，而不必經過預先腫瘤組織活檢來證明受體存在與否。文檔編號A61K47/48GK101267842SQ200680034375公開日2008年9月17日申請日期2006年9月19日優先權日2005年9月20日發明者朱賽平娜·狄·史蒂凡諾,路奇·費歐密申請人:博洛尼亞大學病理學研究學院