一株用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株的製作方法

2023-06-11 00:35:01 3

專利名稱：一株用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株五.co/Z Q10 (CCTCC M 209113)，
屬於基因工程和微生物發酵領域。
背景技術：
大腸桿菌作為一種模式生物，由於其遺傳背景清楚、操作技術成熟等特點，已經廣 泛應用於遺傳、代謝工程等諸多領域。諸多外源性蛋白已經成功在大腸桿菌中表達並生 產。通過基因工程改造大腸桿菌，諸如琥珀酸發酵、聚羥基脂肪酸發酵、穀氨酸發酵及 乳酸發酵等途徑已成功構建。
大腸桿菌雖然應用廣泛，但存在許多缺點。如乙酸鹽的分泌就是一個利用大腸桿菌 發酵中常常面臨的問題。當外界環境中存在高濃度的葡萄糖等碳源時，大腸桿菌由於代 謝不平衡而分泌大量的乙酸鹽。乙酸鹽的分泌不僅造成了碳源的浪費，同時乙酸鹽對菌 體的生長有抑制作用，因而乙酸鹽的分泌不利用菌體的正常生長和發酵的進行。
大腸桿菌中存在兩條主要的乙酸生成途徑。 一條是丙酮酸通過PoxB (丙酮酸氧化 酶)的催化生成乙酸；另一條途徑則是乙醯-CoA通過Pta(磷酸轉乙醯基酶)和ackA(乙 酸激酶)生成乙酸，同時生成ATP。上述兩條途徑作用時間不同，大腸桿菌在時空上通 過調節相關酶類來調節乙酸的生成速率。PoxB途徑主要在大腸桿菌進入穩定期後發揮 作用；而Pta-ackA途徑則主要是大腸桿菌在對數生長期時發揮作用。
當前有兩種方法己經應用於減少乙酸鹽的分泌。 一種是對發酵工藝的優化，即通過 控制葡萄糖等碳源的濃度來減少乙酸的分泌。雖然該方法可以減少乙酸的生成，但是延 長了發酵周期。而另一種方法則是通過代謝工程手段，即阻斷乙酸生成分泌的直接途徑， 減少乙酸的生成。然而過去的相關研究文獻只是針對個別乙酸相關基因進行單獨研究。 而在大腸桿菌代謝途徑及其調控方式的基礎上構建同時缺失/^G、/wxB和; to基因的工 程菌株的研究和專利還未見報導。

發明內容
針對大腸桿菌發酵過程中所存在的乙酸鹽分泌問題，本發明目的是通過基因工程， 利用基因敲除構建一株應用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株。同時，利用該工程菌株積 累聚羥基脂肪酸酯(PHA)，本發明以PHA家族中的代表聚-P-羥基丁酸酯(PHB)為例來 闡述該工程菌株的應用。
本發明所述用於好氧發酵的大腸軒菌工程菌株，其特徵在於該菌株名為埃希氏大 腸桿菌QIO，即為大腸桿菌Q10 (&c/ eWc/H'fl co// Q10);菌株已於2009年5月27日 保藏在"中國典型培養物保藏中心"，保藏編號為CCTCCM209113。
上述大腸桿菌工程菌株Q10外形呈杆狀，大小為0.4 0.6微米xl 3微米，無芽胞。 有普通菌毛與性菌毛，屬於革蘭氏陰性桿菌。此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、 葡萄糖的普通培養基上生長良好。最適生長溫度為37。C，在42-44'C條件下仍能生長，生長溫度範圍為15-46°C。菌株的基因型為MG1655Ai^GA戶;c萬A/ to:: Cm。
上述大腸桿菌工程菌株的出發菌株是大腸桿菌MG1655、 DH5a、 JM109、 W3110、 XLl -Blue中的一種，其中優選菌株為大腸桿菌MGl 655 。所述MGl 655 、 JM109和W3110 購買於ATCC(美國典型菌種保藏中心)；DH5a與Xll-blue購買於DSMZ(德國微生物保 藏中心)。真養產鹼桿菌04/a^gew^ e^ro/^"力購買於CICC(中國工業微生物菌種保藏 管理中心)。
上述大腸桿菌工程菌株是通過敲除j "G、 po;cB及/7to基因而構建，其基因型可以 由 MG1655Ap"G 、 MG1655A萍B 、 MG1655A, 、 MG1655 &GA萍5 、 MG1655A/wx5Apto或MG1655A/^GA/ to基因型進一步改造獲得。
上述大腸桿菌工程菌株的構建及檢測步驟是 基因的敲除
通過Red重組系統在大腸桿菌MG1655中敲除基因;^G (磷酸轉移酶系統II)。所 得缺失基因的大腸桿菌MG1655A; "G::Cm命名為co// Q8。
(2) .poj^基因的敲除
通過Red重組系統在大腸桿菌E co/iQ8中敲除基因p似5 (丙酮酸氧化酶)。所得 缺失jtojcS基因的大腸桿菌MG1655A ; "GA; o;f及:Cm命名為co// Q9。
(3) .戶似基因的敲除
通過Red重組系統在大腸桿菌五.《>//09中敲除基因;7似(磷酸轉乙醯基酶)。所得 缺失pto基因的大腸桿菌MG1655A / "GA; o;c5A/ to::Cm命名為co// Q10,該菌株 2009年5月27日已保藏於"中國典型培養物保藏中心"，保藏編號為CCTCCM 209113。
上述Red重組系統，是通過質粒pKD46表達X噬菌體重組酶Gam， Bet和Exo, 通過設計帶有同源臂的引物擴增帶有篩選標記kan(卡那黴素抗性基因)或Cm(氯黴素抗 性基因)基因的重組片斷。然後通過電穿孔儀電擊，將重組片斷轉入表達X噬菌體重組 酶Gam， Bet和Exo的大腸桿菌中。重組片斷在重組酶的作用下與基因組上的目的基因 發生重組，從而將原來的基因置換下來。而抗性基因通過表達FLP內切酶，從基因組上 切除掉。
(4) .工程菌株在LB培養基中的生長曲線比較
為了比較說明所構建工程菌株co// Q10 (保藏編號為CCTCC M 209113)的優越 性，我們將菌株MG1655,五.co// LR1010， ￡. QZ1011及co// QZ1100在LB培養 基中培養。方法如下:將平板中的單克隆挑至裝有LB培養基3-5ml的試管中，置於30-40 'C下培養10-16h，然後按照1-3%的接種量轉入裝有30-50ml的250ml的三角瓶中。至於 置於30-40 °C，轉速為200-250轉/min。每間隔2-4h取樣，然後在600nm波長下檢測菌 液光吸收值。即將菌液置於室溫下10， 000-12， 000轉/min，離心2-5min。將上清倒掉， 然後利用0.4-0.6M的NaCl溶液洗兩次，重懸，檢測吸光度。
(5) .工程菌株在LB添加1%葡萄糖中的生物量及乙酸鹽產量比較
通過情況下，培養菌體所用碳源為廉價的葡萄糖。所以我們利用LB培養基添加葡 萄糖對菌株進行了培養比較。菌株MG1655， co// Q8， co/Z Q9及co/z' Q10在LB添加1%葡萄糖的培養基中培養。方法如下:將平板中的單克隆挑至裝有LB培養基3-5ml 的試管中，置於30-40 'C下培養10-16h，然後按照1-3%的接種量轉入裝有30-50ml的 250ml的三角瓶中。至於置於30-40 。C，轉速為200-250轉/min。每間隔2-4h取樣，然 後在600nm波長下檢測菌液光吸收值。即將菌液置於室溫下10， 000-12， 000轉/min,離 心2-5min。將上清倒掉，然後利用0.4-0.6M的NaCl溶液洗兩次，重懸，檢測吸光度。
代謝產物分析採用高壓液相色譜(HPLC)分析。方法:將所取得樣品置於10,000-12， 000轉，離心2-5min。然後上清利用孔徑為0.2 pm的濾膜過濾。過濾樣品如果不及時檢 測則置於-2(TC下保存一周。葡萄糖、乙酸鹽採用示差檢測器，而丙酮酸則採用紫外檢 測器檢測，檢測波長為210nm。檢測樣品前，葡萄糖、乙酸鹽及丙酮酸標準樣品進行梯 度檢測並繪製標準曲線。然後樣品再進行檢測。
(6). pH7.0條件下，工程菌株在LB添加1%葡萄糖中的生物量及乙酸鹽產量比較
基於(5)，我們對菌株進行了pH恆定培養，即通過調節培養液的pH,防止菌體因 為pH過低而停止生長。從而可以分析比較所構建菌株的生長代謝特點。培養方法將 平板中的單克隆挑至裝有LB培養基3-5ml的試管中，置於30-40 。C下培養10-16h，然 後按照l-3。/。的接種量轉入200ml的搖瓶櫃中。至於置於30-40 °C，轉速為150-250rpm， pH採用2MNaOH調節。每間隔2-4h取樣，然後在600nm波長下檢測菌液光吸收值。 即將菌液置於室溫下10， 000-12， 000轉/min,離心2-5min。將上清過濾離心用於檢測 代謝產物，而菌體利用0.4-0.6M的NaCl溶液洗兩次，重懸，檢測吸光度。
本發明所述用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株作為平臺在構建琥珀酸、乳酸、穀氨 酸、5-氨基乙醯丙酸、3-羥基丙酸、甲羥戊酸或PHB的發酵途徑中的應用。
進一步優選的方式是所述用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株作為平臺構建的PHB 發酵途徑用於製備PHB，其發酵條件為溫度37士rC，搖床轉速250士30轉/min,發酵 時間48±2h;發酵培養基為改良的M9培養基組成為Na2HP04 6g/L 、 KH2P04 3g/L、 NaCl 0.5g/L、 NH4Cl lg/L、酵母浸出物2g/L、MgS04 2mmol/L、CaCl2 0.1薩ol/L、 葡萄糖20g/L。
以積累PHB為例闡述本發明所述大腸桿菌工程菌株的應用，具體步驟如下
(1) . PHB發酵途徑的構建
將PHB表達載體pSK-如6C^轉化至工程菌株五.co/!' Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)中。同時，MG1655作為對照菌株，也轉入pSK-如6C45。
(2) . PHB發酵生產
將工程菌株E co//QlO/pSK-p^C^以及五.co//MG1655/pSK少^C45單克隆挑 至裝有3-5ml的LB的試管中。置於30-40 。C下培養10-16h，然後將菌體置於室溫下10， 000-12, 000轉/min，離心2-5min。然後利用M9培養基洗漆2次，然後加入3-5ml的 M9培養基重懸菌體細胞，然後按照體積比1-3%的接種量轉入裝有100-200ml改良M9 培養基的1L的三角瓶中。改良的M9培養基添加2y。的葡萄糖。將菌液置於30-40 'C 下培養10-16h。然後按照體積比5-10%的接種量轉入裝有2.5-3.5L的5L發酵罐中發酵。 IPTG的誘導濃度為0.1-0.2 mol/L。其中菌液pH採用2MNaOH自動調節，溶氧(DO)通過調節轉速控制在30-50以上。每間隔4-8h取樣一次。離心5-10ml發酵液，將菌體 冷凍乾燥，而上清利用孔徑為0.2 nm的濾膜過濾。過濾樣品如果不及時檢測則置於-20'C 下保存一周。
所述pSK—質粒為大腸桿菌克隆質粒，購自Invitrogen公司。啟動子為IPTG誘導的 lac啟動子。/ /^C4S基因來源於真養產鹼桿菌(j/ca/fgewes ewfro/ /zw。。
本發明在分析大腸桿菌代謝途徑及其調控方式的基礎上，設計並構建了一株應用於 好氧發酵的同時缺失;^G、；7oxB和;7to基因工程菌株，並以乙酸鹽分泌量、生物量的變 化為例來闡述該好氧發酵工程菌株。本發明的好氧發酵菌株的構建為其他目的產物發酵 途徑的構建打下了基礎，具有重要的實用意義。


本發明所述大腸桿菌(EsdieWc/H'aco/z') Q10已於2009年5月27日保藏在"中國典 型培養物保藏中心"，保藏編號為CCTCCM209113。 圖1為本發明構建的好氧發酵途徑平臺。 圖2為本發明所構建菌株在LB培養基中的生長曲線。 圖3為本發明所構建菌株在LB添加lc/c葡萄糖培養基中的生物量產量。 圖4為本發明所構建菌株在LB添加1%葡萄糖培養基中的乙酸鹽產量
圖5為恆定pH7.0條件下，本發明所構建菌株在LB添加1%葡萄糖培養基中的生
物量產量。
圖6為恆定pH7.0條件下，本發明所構建菌株在LB添加1%葡萄糖培養基中的乙
酸鹽產量。
圖7為本發明所構建的工程菌株的PHB發酵結果。
具體實施例方式
實施例1、菌株構建(a).j^G基因的敲除 菌種大腸桿菌MG1655
所述LB培養基為蛋白腖10g/L,酵母粉5g/L， NaCl 10g/L，氨苄青黴素，100mg/L， 卡那黴素50mg/L。
所述氨苄黴素抗性平板為含有100mg/L的氨苄青黴素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養基。
所述氯黴素抗性平板為含有50mg/L的氯黴素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養基。
所述SOC培養基為蛋白腖2g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl0.0585 g/L， KC1 0.0186g/L， MgCl2 0.203 g， MgS04 0.246 g/L,葡萄糖20 mmol/L。
(1)同源重組片斷的克隆
利用Red重組系統對目的基因進行敲除。根據Genbank公布的;^G基因序列設計 引物
pKD-ptsG F:GCTTC-3' pKD-ptsG R
GTCC-3'
以pKD3通過PCR(聚合酶鏈式反應)體外擴增獲得帶有氯黴素抗性的重組片斷。PCR 反應體系如下(引物濃度為20pmol/L) 10x緩衝液 5pl; 25mmol/LMgC12 4|til; 10mmol/L四種dNTP混合液 上下遊引物各lpl; TaqDNA聚合酶0.5pl; 模板DNAlnl，加水補至5(Hil;
PCR反應條件97。C預變性lOmin， 94。C變性60s, 58。C退火30s， 72。C延伸90s, 30個循環後72t:延伸10min, 4'C保存。通過i)p"/內切酶消化後，回收純化濃縮同源
重組片斷。
(2) 電轉化感受態細胞的製備
(I) 挑取帶有pKD46質粒的大腸桿菌MG1655，轉入LB培養基中，同時加入0.2%
的阿拉伯糖，培養OD60。至0.5;
(II) 冰浴15min,離心菌體，然後利用10%的甘油洗滌三次；
(III) 加入10%的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態。
(3) 電轉化，篩選重組子
(I) 吸取8ng/l的同源重組片斷，加入100^1的感受態細胞中，混勻。調節電穿孔儀， 2.5Kv， 電擊；
(II) 加入90(Hd的SOC培養基，37°C， 150轉/min，培養lh;
(III) 塗布氯黴素抗性平板，調取重組子利用 ptsG test F: 5'-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3'
ptsG test R: 5'-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3'
進行PCR檢測，通過PCR產物測序進一步證實pox5基因己被氯黴素抗性基因換。
(IV) PLP位點專一重組
將pCP20轉入氯黴素抗性克隆，30'C培養8h，後提高至42。C過夜，熱誘導FLP重 組酶表達，質粒也逐漸丟失。利用接種環蘸取菌液在無抗性培養基上劃線，將長出的單 克隆同時轉入無抗性平板和卡那黴素抗性平板上培養，在無抗性平板上生長而在卡那黴 素抗性平板上不生長的已被FiP重組酶刪除。利用檢測引物poxBtestF和poxBtestR進 一步鑑定。
(V) 獲得工程菌株MG1655A;^G::Cm，命名為￡. co//Q8。(b)./W』基因的敲除 菌種大腸桿菌五.CO//Q8
所述LB培養基為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L， NaCl 10g/L，氨苄青黴素，100mg/L， 卡那黴素50mg/L。
所述氨苄黴素抗性平板為含有100mg^的氨苄青黴素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養基。 所述氯黴素抗性平板為含有50mg/L的氯黴素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養基。 所述SOC培養基為蛋白腖2 g/L,酵母粉0.5 g/L,NaCl 0.0585 g/L， KC1 0.0186 g/L， MgCl2 0.203 g， MgS04 0.246 g/L，葡萄糖20mmol/L。
(1)同源重組片斷的克隆
利用Red重組系統對目的基因進行敲除。根據Genbank公布的/w;^基因序列設計
引物
pKD-poxB F:
GCTTC-3' pKD-poxB R :
GTCC-3'
以pKD3通過PCR(聚合酶鏈式反應)體外擴增獲得帶有氯黴素抗性的重組片斷。PCR 反應體系如下(引物濃度為20pmol/L) 10x緩衝液 5^1; 25簡ol認gC12 4pl; 1Ommol/L四種dNTP混合液 上下遊引物各lnh TaqDNA聚合酶0.5pl; 模板DNA1 ^，加水補至5(Htl;
PCR反應條件97。C預變性10min， 94。C變性60s， 58。C退火30s, 72。C延伸90s， 30個循環後72'C延伸10min， 4'C保存。通過D/w/內切酶消化後，回收純化濃縮同源 重組片斷。
(2) 電轉化感受態細胞的製備
(I) 挑取帶有pKD46質粒的大腸桿菌co// Q8，轉入LB培養基中，同時加入0.2% 的阿拉伯糖，培養0D6W至0.5;
(II) 冰浴15min，離心菌體，然後利用10%的甘油洗滌三次；
(III) 加入10%的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態。
(3) 電轉化，篩選重組子
(I)吸取^g/l的同源重組片斷，加入10(Hil的感受態細胞中，混勻。調節電穿孔儀， 2.5Kv， 電擊；(n)加入900nl的SOC培養基，37°C, 150轉/min，培養lh;
(ni)塗布氯黴素抗性平板，調取重組子利用
poxB test F: 5'-TCCCCCTCCGTCAGATGA-3' poxB test R: 5'陽GGTATCACTGCGTAAATCAA-3'
進行PCR檢測，通過PCR產物測序進一步證實/ oc5基因已被氯黴素抗性基因換。
(IV) PLP位點專一重組
將pCP20轉入氯黴素抗性克隆，30'C培養8h，後提高至42。C過夜，熱誘導FLP重 組酶表達，質粒也逐漸丟失。利用接種環蘸取菌液在無抗性培養基上劃線，將長出的單 克隆同時轉入無抗性平板和卡那黴素抗性平板上培養，在無抗性平板上生長而在卡那黴 素抗性平板上不生長的已被F1P重組酶刪除。利用檢測引物poxB test F和poxB test R進 一步鑑定。
(V) 獲得工程菌株MG1655A;^GA;70;c及:Cm，命名為￡.￡0//(^9。 (c)pto基因的敲除
菌種大腸桿菌五co/ZQ9
所述LB培養基為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L, NaC110g/L，氨苄青黴素，100mg/L， 卡那黴素50mg/L。
所述氨苄黴素抗性平板為含有100mg/L的氨苄青黴素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養基。 所述氯黴素抗性平板為含有50mg/L的氯黴素，1.5%的瓊脂粉的LB固體培養基。 所述SOC培養基為蛋白腖2 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.0585 g/L， KC1 0.0186 g/L， MgCl2 0.203 g， MgS04 0.246 g/L，葡萄糖20 mmol/L。
(1)同源重組片斷的克隆
利用Red重組系統對目的基因進行敲除。根據Genbank公布的pto基因序列設計 引物 pKD-pta F
TGCTTC-3 pKD-pta R
GGTCC-3'
以pKD3通過PCR(聚合酶鏈式反應)體外擴增獲得帶有氯黴素抗性的重組片斷。PCR 反應體系如下(引物濃度為20pmol/L) 10x緩衝液 5^1; 25mmol/LMgC12 4^1; 10mmol/L四種dNTP混合液 上下遊引物各1^1; TaqDNA聚合酶0.5^1;模板DNAlpl，加水補至50pl;
PCR反應條件97。C預變性10min， 94。C變性60s, 58。C退火30s， 72。C延伸90s， 30個循環後72'C延伸10min， 4'C保存。通過D/w/內切酶消化後，回收純化濃縮同源
重組片斷。
(2) 電轉化感受態細胞的製備
(I )挑取帶有pKD46質粒的大腸桿菌Q9，轉入LB培養基中，同時加入0.2% 的阿拉伯糖，培養OD6oo至0.5;
(II) 冰浴15min，離心菌體，然後利用10%的甘油洗滌三次；
(III) 加入10%的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態。
(3) 電轉化，篩選重組子
(I) 吸取8pg/l的同源重組片斷，加入100nl的感受態細胞中，混勻。調節電穿孔儀， 2.5Kv， 電擊；
(II) 加入900pl的SOC培養基，37°C， 150轉/min，培養lh;
(III) 塗布氯黴素抗性平板，調取重組子利用 Pta test F5 '-TC AGCTGGCGGTGCTGTTT-3'
Pta test R 5'-ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG陽3'
進行PCR檢測，通過PCR產物測序進一步證實聲"已被氯黴素抗性基因換。
(IV) PLP位點專一重組
將pCP20轉入氯黴素抗性克隆，3(TC培養8h,後提高至42'C過夜，熱誘導FLP重 組酶表達，質粒也逐漸丟失。利用接種環蘸取菌液在無抗性培養基上劃線，將長出的單 克隆同時轉入無抗性平板和卡那黴素抗性平板上培養，在無抗性平板上生長而在卡那黴 素抗性平板上不生長的已被F1P重組酶刪除。利用檢測引物Ptatest F和Ptatest R進一 步鑑定。
(V) 獲得工程菌株MG1655A;^GZ^o;c5A;^::OM,命名為￡. co/f QZIO。該工程菌株 已保藏至"中國典型培養物保藏中心"，保藏編號為CCTCCM209113 。
所構建工程菌株的碳源代謝途徑見圖1。如圖所示改造的工程菌株E coZ/QZ10(保 藏編號為CCTCC M 209113)的葡萄糖代謝途徑中，；7&G的缺失將減少丙酮酸的積累， 從而進一步減少流向乙酸的碳流量;jw;^和聲a基因的缺失阻斷了乙酸鹽的生成途徑， 從而降低了乙酸鹽的生成。
實施例2、工程菌株在LB培養基中的生長曲線比較
菌種五.co// MG1655、五.co// Q8、 co/z' Q9及co/Z Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)
培養基LB培養基蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L, NaC110g/L。
培養方法
分別挑取平板中的MG1655、 co// Q8、 ￡. Q9及co// Q10 (保藏編號 CCTCCM 209113)的單菌落，轉至裝有4ml LB的試管中培養過夜。按照體積比1%的接種量轉入裝有50ml LB的300ml的三角瓶，250轉/min， 37。C下培養。每間隔2h取樣 lml。樣品置於室溫下12,000轉/min,離心2min。然後去掉上清，將菌體利用0.5MNaCl 溶液清洗兩次，然後利用lml的0.5MNaCl溶液重懸細胞。菌體的光密度OD為波長為 600nm處的吸光值。
繪製生長曲線,比較各株菌的生長差異。比較結果見圖2。如圖2所示，工程菌株 ￡. co/!' Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)與野生型的大腸桿菌MG1655相比具有更大 的生長速率。
實施例3、工程菌株在LB添加iy。葡萄糖中的生物量及乙酸鹽產量比較
培養基LBG:蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L, NaC110g/L、 glucose20g/L。
菌種五.co// MG1655、 co// Q8、五.co// Q9及co/z' Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)
(1)培養方法
(I) 種子液得製備用接種環分別挑取平板上的co//MG1655、 ￡. co/z' Q8、 co// Q9及co// Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)接入裝有50ml LB培養基的300ml的三 角瓶中，氯黴素至終濃度分別為50mg/L於37'C， 250轉/min，培養12h。
(II) 搖瓶發酵將種子液按照體積比1%的接種量接入裝有50ml LBG培養基的 300ml的三角瓶中。接種時￡、 co/z' Q8、 ￡. co/z' Q9及￡. co/!' Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)菌株培養基中加入氯黴素至終濃度為50mg/L。培養溫度設為37'C，搖床轉速設 為250轉/min。培養48h。
(2) 代謝產物分析
(I)葡萄糖的檢測取發酵完畢的菌液12， 000轉/min，離心2min。取上清，用 0.2pm的濾膜過濾，然後利用葡萄糖生物傳感器檢測葡萄糖的濃度。HPLC(高壓液相色 譜)檢測。檢測條件為檢測柱watersC18，流動相1%。的甲酸，檢測器示差檢測器。
(II)乙酸鹽的檢測取發酵完畢的菌液12， 000轉/min，離心2min。取上清，用 0.2jLim的濾膜過濾，然後利用HPLC(高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱waters C18，流動相1%。的甲酸，檢測器示差檢測器。乙酸鹽檢測結果見圖3，如圖3所示 工程菌株co" Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)分泌的乙酸鹽的量最少。
(3) 生物量分析
將不同菌株所取樣品置於室溫下12,000轉/min，離心2min。然後去掉上清，將菌體 利用0.5MNaCl溶液清洗兩次，然後利用lml的0.5MNaCl溶液重懸細胞。菌體的光密 度OD為波長為600nm處的吸光值。
繪製生物量曲線，比較差異。結果見圖4。如圖4所示，工程菌株EcoZ/Q10(保藏 編號CCTCC M 209113)積累的生物量是野生型五.co/z'MG1655的4倍。
實施例4、 pH7.0條件下，工程菌株在LB添加l"/。葡萄糖中的生物量及乙酸鹽產
量比較
培養基LBG:蛋白腖10g/L,酵母粉5g/L， NaC110g/L、 glucose 20 g/L。菌種￡. MG1655、 co// Q8、 co// Q9及E co// Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)
(1)培養方法
(I) 種子液得製備用接種環調取平板上的E co//MG1655、五.co//Q8、五.co//Q9 及E co// Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)接入裝有50ml LB培養基的300ml的三角 瓶中，氯黴素至終濃度分別為50mg/L於37。C， 250轉/min，培養12h。
(II) 搖瓶櫃培養將種子液按照1%的接種量接入裝有200ml LBG培養基的1L的搖 瓶櫃中。培養液利用2M的NaOH自動調節pH, pH設定為7.0。接種時 MG1655A;^yG:.Ow、 co// QZ1011及￡. co" QZllOO菌株培養基中加入氯黴素至終濃 度為50mg/L。培養溫度設為37'C，搖床轉速設為250轉/min。培養48h。
(2)代謝產物分析
(I )葡萄糖的檢測取發酵完畢的菌液12, 000轉/min，離心2min。取上清，用0.2pm 的濾膜過濾，然後利用葡萄糖生物傳感器檢測葡萄糖的濃度。HPLC(高壓液相色譜)檢 測。檢測條件為檢測柱waters ds，流動相1%。的甲酸，檢測器示差檢測器。
(II)乙酸鹽的檢測取發酵完畢的菌液12, 000轉/min，離心2min。取上清，用0.2nm 的濾膜過濾，然後利用HPLC(高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱waters C18， 流動相1%。的甲酸，檢測器示差檢測器。
(3)生物量分析
將不同菌株所取樣品置於室溫下12,000轉/min,離心2min。然後去掉上清，將菌體 利用0.5MNaCl溶液清洗兩次，然後利用lml的0.5MNaCl溶液重懸細胞。菌體的光密 度OD為波長為600nm處的吸光值。
生物量積累差異及乙酸鹽分泌量結果見圖5，圖6。如圖5所示￡.^//(510(保藏編 號CCTCCM209113)的生物量最大，同時其乙酸分泌量最小。
實施例5、 PHB發酵結果比較
發酵培養基(改良M9培養基)
Na2HP04 6g/L KH2P04 3g/L NaCl 0.5g/L NH4C1 lg/L 酵母浸出物 2g/L MgS042mmol/L CaCl2 0.1mmol/L 葡萄糖20g/L 。
方法
(1) PHB發酵途徑的構建
(I) 感受態細胞的製備
挑取LB平板中的大腸桿菌五.co/z' MG1655和E co// Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)，培養過夜;將培養過夜的大腸桿菌MG1655和五.co/z' Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)按照1%的接種量分別轉入裝有50 ml LB的300ml的三角瓶中培養，於37°C、 225轉/min下培養至OD6Q為0.4。停止培養，置冰上20分鐘，4°C, 4000轉/min,離 心10分鐘，棄上清，加入冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液懸浮，冰上靜置30分鐘。離 心濃縮。獲得感受態細胞。放於-70'C保存。
(II) PHB發酵途徑的構建將PHB合成途徑表達質粒轉化至大腸桿菌E co/z' MG1655和co// Q10 (保藏編號: CCTCC M 209113)。
從而獲得PHB發酵菌株co// MG1655/pBluescript SK—/^6C45 和co// Q10 (保藏編號CCTCC M 209113)/pBluescript SK—p/z6C45。 (2) PHB發酵
挑取LB平板中的PHB重組大腸桿菌co// MG1655/pBluescript SK一戶/^C45和五. co// Q10 (保藏編號CCTCC M 209113) /pBluescript SK一p/^C45,在無菌條件下分別用 接種環接1環於50 ml並加有終濃度為100 mg/L的氨苄青黴素的M9改良培養基中(添 加2%的葡萄糖)，37"C條件下，250轉/min搖床振蕩培養12小時，製得種子液；再分 別以體積比2。/。的接種量轉接入裝有200ml培養基的1000ml三角瓶中。IPTG誘導濃度 為0.1mmol/L。發酵條件為37°C， 250轉/min。其中對照組為重組大腸桿菌co" MG1655/pBluescriptSK一; W)C4B，發酵時間為48h，每間隔4h取樣。
所述質粒pBluescript SK-少^C45為帶有;^6C45基因的pBluescript SIC質粒，通過 IPTG的誘導而表達。
PHB發酵檢測
收集細胞將所取的發酵液樣品在4,000轉/min,離心20min，收集沉澱細胞，使用 蒸餾水洗滌細胞2次後，4,000轉/min,離心20min收集細胞，烘乾後稱其乾重。
PHB檢測將所得的幹菌體，加入150微升的濃硫酸沸水浴中加熱60分鐘，然後 利用15。/。的氨水調節pH至2.5，經微孔濾膜過濾後，HPLC(高壓液相色譜)檢測PHB含 量。檢測條件為分析柱C18; 1%。的甲酸作流動相；紫外檢測器；紫外波長為210nm。 檢測結果見圖7。如圖7所示，co" Q10 (保藏編號CCTCC M 209113) /pBluescript SK"p/^C4B積累PHB的量為￡. co// MG1655/pBluescript SK—; /^C45積累量的2倍。序列表
〈uo〉山東大學
—株用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株
2009-5-27
〈160>12
〈210〉1
〈211>59
〈212〉腿
〈213〉pKD-ptsG F
<400〉1
acgtaaaaaa agcacccata ctcaggagca ctctcaattg tgtaggctgg agctgcttc 59
<210〉2 〈211〉59 腿 〈213〉pKD-ptsG R <400〉2
agccatctgg ctgccttagt ctccccaacg tcttacggaa tgggaattag ccatggtcc 59
3
<211〉20
〈212>DNA
〈213〉ptsG test F 3
cctgtacacg gcgaggctct 20
<210〉4
〈211〉25
〈212>腿
〈213>ptsG test R 〈400>4
aataacacct gtaaaaaagg cagcc 25
59 <212〉腿 〈213〉pKD-poxB F 〈400〉5幼ccg tgtaggctgg 3gctgcttc 59
6 〈211〉59 pKD-poxB R 〈400>6
catggcatgt ccttattatg acgggaaatg ccacccttta tgggaattagc catggtcc 59
〈210>7
〈211>18
〈212>DNA
<213〉poxB test F <400〉7
tccccctccg tcagatga 18
<210〉8
〈211〉20
〈212>DNA
〈213〉poxB test R <400〉8
ggtatcactg cgtaaatcaa 20
〈210〉9 <211〉59 pKD-pta F 〈400〉9
gtaacccgcc aaatcggcgg taacgaaaga ggataaaccg tgtaggctgg agctgcttc 59
〈210>10 〈211>59 〈212〉DNA 〈213>pKD-pta R 〈400>10
tcaga_t3tcc gc3gcgc3aa gctgcggatg atgacggigaa tggg肪ttag ccatggtcc 59
<210〉11 腿 〈213>Pta test F 〈400〉11
tcagctggcg gtgctgttt 19
12 <211〉24 <212〉DNA Pta test R 12
accggaaata gtgattattt ccgg 2權利要求
1.一株用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於該菌株名為大腸桿菌(Escherichia coli)Q10；菌株已於2009年5月27日保藏在「中國典型培養物保藏中心」，保藏編號為CCTCC M 209113。
2. 根據權利要求1所述用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株，其特徵在於所述菌 株的基因型為MG1655A;^GA; ox萬A;7to:: Cm。
3. 權利要求1所述用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株作為平臺在構建琥珀酸、乳 酸、穀氨酸、5-氨基乙醯丙酸、3-羥基丙酸、甲羥戊酸或PHB的發酵途徑中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌 株作為平臺構建的PHB發酵途徑用於製備PHB，其發酵條件為溫度37士rC，搖床轉 速250±30轉/min，發酵時間48±2h;發酵培養基組成為Na2HP04 6g/L 、 KH2P04 3g/L、 NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、酵母浸出物2g/L、MgS04 2mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、 葡萄糖20g/L。
全文摘要
本發明公開了一株用於好氧發酵的大腸桿菌工程菌株，該菌株名為大腸桿菌(Escherichia coli)Q10，保藏編號為CCTCC M 209113，其基因型為MG1655 ΔptsGΔpoxBΔpta::Cm。以野生型大腸桿菌為對照，培養結果表明，本發明的工程菌株乙酸鹽分泌量減少了90％，同時菌體的生物量提高了近2倍，為其作為平臺在構建琥珀酸、乳酸、穀氨酸、5-氨基乙醯丙酸、3-羥基丙酸、甲羥戊酸或PHB發酵途徑的應用奠定了基礎，具有重要的應用前景和價值。
文檔編號C12N1/21GK101613669SQ200910015399
公開日2009年12月30日 申請日期2009年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者振 康, 祁慶生 申請人:山東大學