一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法
2023-06-11 00:48:21 1
一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法
【專利摘要】本發明屬於益生菌微膠囊製備【技術領域】，具體地說是一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法。本發明對擴大培養過程中的溫度、溶解氧、pH、時間和培養基進行優化控制，在膠囊製備過程中採用雙層微膠囊結合真空包裝。生產的枯草桿菌微膠囊在貨架期內具有高活菌數、高抗逆性的優點。其產品不僅可應用於保健食品領域，也可應用於醫藥領域。本發明的菌株為益生菌，原料為無毒的天然化合物，可實現無汙染物排放，綠色、安全、環保。
【專利說明】一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及益生菌微膠囊製備【技術領域】，具體地說是一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法。
【背景技術】
[0002]枯草桿菌(Bacillus subtilis),是一種好氣性革蘭氏陽性菌,有鞭毛。枯草桿菌的內生孢子耐高溫(120 ° C能存活20 min)，耐酸鹼(100%直達大小腸的活菌)。進入消化道後，在短期內迅速由休眠狀態復活，繁殖成高含菌量的優勢種群。進而消耗掉腸道內的氧氣，產生過氧化氫、細菌素，促進有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細菌(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的生長，建立微生態平衡。從而預防腹瀉、下痢等腸胃道疾病。枯草桿菌在臨床醫學上屬於安全性的有益微生物，在保健食品中屬於益生菌。
[0003]益生菌是定植於人體腸道內、生殖系統內，能產生確切健康功效的生活的有益微生物的總稱。隨著對人們對益生菌了解、重視和研究的深入，益生菌正從保健向醫療領域延伸。然而，益生菌製品在從生產、保藏、運輸、經口服過消化道到達腸道的過程中，需要經受一系列不良環境因素的影響，導致到達腸道的活菌數量大大減少，限制了益生菌生理功能的發揮。將益生菌包埋在微膠囊內可減輕環境不良因素的影響，從而提高益生菌的存活率。
[0004]可用作微膠囊壁材的材料很多。有天然高分子聚合物、半合成高分子聚合物以及合成高分子聚合物，主要包括:碳水化合物，如海藻酸鈉、殼聚糖、澱粉；植物膠類，如阿拉伯膠、K-卡拉膠；動物蛋白，如牛奶、明膠；細菌多糖，如膠凝糖、黃原膠。用來包埋益生菌的壁材通常應具備如下特徵:好的生物相容性和成膜性，合適的粘度、滲透性、親水性和溶解性等；並具有性質穩定性、能與芯材配合，能生物降解等。對益生菌微膠囊的研究已有諸多報導，但在需氧益生菌微膠囊中還存在有很多不足，如:耐熱性差、透氣性強和存活期短的問題。解決這些問題的主要出路在於提高菌株的抗逆性和膠囊耐受性。
[0005]
【發明內容】
[0006]本發明公開一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法，旨在提高枯草桿菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌經過消化道時的死亡率，使儘可能多的活菌到達腸道定植，起到益生保健作用。
[0007]為解決上述技術問題，本發明採用以下技術方案。
[0008]一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
(I)菌株的活化:將4°c左右的條件下保存小於一個月的枯草桿菌單菌落接種於種子培養基中，在32-45 °C, 100-300 rpm條件下培養12-24 h進行初次活化，然後按1_5%的接種量第二次將初次活化的枯草桿菌培養液接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液； (2)擴大培養:將活化種子液按1-10%的接種量接種於pH6.5-8.5的裝有的奶粉-豆柏無菌培養基的發酵罐中，在35-45°C，溶解氧3 35%條件下發酵18-24 h，繼續在25-35 °C發酵18-48 h至內生芽孢生成率3 50%，得發酵液；
(3)洗滌:將發酵液於3000-10000rpm速度下離心5-30 min,去除上清液，按體積比1:1-5的比例將沉澱的菌體用無菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌1-3次，隨後用1-5%無菌奶粉液重新懸浮菌體，其活菌數> 101° cfu/ml，得菌懸液；
(4)單層微膠囊製備:按1-5%(W/V)的比例將無菌處理的海藻酸鈉、0.1-1% (W/V)的阿魏酸和1-2% (W/V)的甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以10-30ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的1_10 °C冷卻的1_10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴加邊在100-300 rpm下攪拌，固化30-60 min，無菌水洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與用無菌處理的0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60 min，無菌水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6)乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0009]述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，對步驟(5)中所述雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥為40 0C以下的任何一種乾燥方式，並真空包裝。
[0010]所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，步驟(I)中所述的枯草桿菌菌株指的是野生型枯草桿菌、基因工程的枯草桿菌中的一種或兩種。
[0011]所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，步驟(2)所述奶粉原料為全脂牛奶、脫脂牛奶、羊奶和馬奶中的任一種，所述豆柏為玉米豆柏、大豆豆柏和花生柏的任一種。
[0012]所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，所述的無菌方法為高溫滅菌和過濾除菌中的任一種。
[0013]所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，步驟(3) (4) (5)中的無菌水為生理鹽水、磷酸緩衝液、自來水和蒸餾水的任一種。
[0014]一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將4°c保存小於一個月的枯草桿菌單菌落接種於種子培養基中，在32-45 °C, 100-300 rpm條件下培養12-24 h進行初次活化；然後按1_5%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液；
所述枯草桿菌菌株為野生型枯草桿菌和基因工程的枯草桿菌中的任一種；所述種子培養基為改良LB培養基:10 g胰蛋白腖，10 g氯化鈉，5 g酵母提取粉，5 g甘油，加水定容至1000 mL，調pH至7.0-7.4，分裝(固體培養基加1.5%瓊脂)，在115 °C下滅菌20 min，所用試劑均為分析純。
[0015](2)擴大培養:將活化種子液按1-10%的接種量接種於裝有pH6.5-8.5的無菌奶粉-豆柏培養基的發酵罐中，在35-45°C，溶解氧3 35%條件下發酵18-24 h，繼續在25-35°C發酵18-48 h至內生芽孢生成率3 50%，得發酵液；
所述奶粉為全脂牛奶、脫脂牛奶、羊奶和馬奶中的任一種，所述豆柏為玉米豆柏、大豆豆柏和花生柏的任一種，所述的無菌方法為高溫滅菌和過濾除菌中的任一種。奶粉-豆柏培養基:過100目篩豆柏粉10-20克溶於1000毫升水，60°C保溫30分鐘，4000轉/min離心IOmin後取上清得豆柏培養基；加20-200克奶粉至豆柏培養基中得奶粉-豆柏培養基。[0016](3)洗漆:將發酵液於3000-10000 rpm速度下離心5_30 min,去除上清,按體積比1:1-5的比例將沉澱的菌體用無菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌1-3次，隨後用1-5%無菌奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥101° cfu/ml )，得菌懸液。
[0017]所述無菌水為生理鹽水、磷酸緩衝液、自來水和蒸餾水的任一種。
[0018](4)單層微膠囊製備:按1-5% (W/V)的比例將海藻酸鈉、0.1-1% (W/V)阿魏酸和1-2% (W/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以10-30 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的1-10 °C冷卻的1-10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(100-300 rpm),固化30-60 min,無菌水洗漆三次,得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60 min，無菌水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6 )乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0019]所述的真空包裝中 用於脫氧的氣體可以是N2或隊、0)2、H2的混合氣。
[0020]以上所述枯草桿菌微膠囊的製備方法所製備的枯草桿菌微膠囊應用於保健食品和醫藥領域。
[0021]本發明的有益效果是:在擴大培養時採用優化的培養條件，包括溫度、溶解氧、pH、時間和培養基，特別是雙溫度段培養，使之細胞大量繁殖和孢子大量形成；在膠囊製備中採用雙層微膠囊結合真空包裝使細胞處於良好的休眠環境。提高益生菌活菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌經過胃時胃液的破壞作用，使儘可能多的活菌到達腸道定植，起到益生保健功能。
[0022]本發明通過整合細胞生理特徵與膠囊製備技術生產的枯草桿菌微膠囊具有貨架期內高活菌數、高抗逆性的優點。其產品不僅可應用於保健食品領域，也可應用於醫藥領域。本發明的菌株為益生菌，原料為無毒的天然化合物，可實現無汙染物排放，綠色、安全、環保。
【具體實施方式】
[0023]為了更充分理解本發明的技術內容，下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步介紹和說明。
[0024]以下實施例使用以下材料:
所用水均符合國家「生活飲用水衛生標準」(GB 5749— 2006)。
[0025]野生菌:枯草芽抱桿菌漢subtil is 168。
[0026]工程菌:枯草芽孢桿菌漢subti I is IBL 241 [WB800N/pHCMC05_svu022]。
[0027]培養基原料:全脂奶粉，雀巢全脂奶粉，雙城雀巢有限公司；豆柏，大豆豆柏，山東嘉冠油脂化工有限公司。
[0028]種子培養基為改良LB種子培養基(1L): 10 g胰蛋白腖，10 g氯化鈉，5 g酵母提取粉，5 g甘油，加水定容至1000 mL，調pH至7.0-7.4，分裝(固體培養基加1.5%瓊脂)，在115 °C下滅菌20 min,所用試劑均為分析純。
[0029]實施例1
一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:(1)菌株的活化:將保存於4°c保存小於一個月的枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種於種子培養基中，在37 °C, 200 rpm條件下培養16-20 h進行初次活化；然後按2%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液；
(2)擴大培養:將活化種子液按4-6%的接種量接種於裝有奶粉-豆柏(5%脫脂奶粉與1%大豆豆柏4000rpm離心上清)的115°C高溫滅菌的培養基(pH 7.5)的發酵罐中，在37 °C，溶解氧3 30%條件下發酵20-24 h，繼續在25 °C發酵24-36 h至內生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發酵液；
(3)洗滌:將發酵液於6000rpm速度下離心15 min,去除上清，按體積比1:2的比例將沉澱的菌體用無菌自來水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌2次，隨後用1%無菌脫脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥101° cfu/ml)，得菌懸液；
(4)單層微膠囊製備:按2%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和1% (W/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的4°C冷卻的5% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化40min，無菌自來水洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與1%殼聚糖中覆膜45min，無菌自來水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6)乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0030]該枯草桿菌幹微膠囊產品的保質期≥2年，活菌數≥IXlO9個/g，芽孢3 60%;淡黃色，無異味。
[0031]以上製得的枯草桿菌幹微膠囊產品可應用於保健食品和醫藥領域。
[0032]實施例2
一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存於4°C保存小於一個月枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種於種子培養基中，在39 V, 200 rpm條件下培養16-20 h進行初次活化；然後按2%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液；
(2)擴大培養:將活化種子液按4-6%的接種量接種於裝有奶粉-豆柏(5%全脂奶粉與1%玉米豆柏)的115°C高溫滅菌的培養基(pH 8.0)的發酵罐中，在39 °C，溶解氧蘭40%條件下發酵20-24 h，繼續在30 °C發酵36-48 h至內生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發酵液；
(3)洗滌:將發酵液於4000rpm速度下離心20 min,去除上清，按體積比1:3的比例將沉澱的菌體用無菌生理鹽水(0.9%NaCl)振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌2次，隨後用1%無菌全脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥101° cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊製備:按3%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和2% (W/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的4°C冷卻的4% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化40min，無菌生理鹽水洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與2%殼聚糖中覆膜45min，無菌生理鹽水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；(6)乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0033]該枯草桿菌幹微膠囊產品的保質期> 2年，活菌數> IXlOici個/g，芽孢3 80% ；淡黃色，無異味。
[0034]以上製得的枯草桿菌幹微膠囊產品可應用於保健食品和醫藥領域。
[0035]實施例3
一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:
(1)菌株的活化:將保存於4°C保存小於一個月的枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種於種子培養基中，在37 °C, 200 rpm條件下培養16-20 h進行初次活化；然後按2%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液；
(2)擴大培養:將活化種子液按4-6%的接種量接種於裝有奶粉-豆柏(10%全脂奶粉與1%玉米豆柏)的115°C高溫滅菌的培養基(pH 7.0)的發酵罐中，在39 °C，溶解氧蘭30%條件下發酵20-24 h，繼續在28 °C發酵36-48 h至內生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發酵液；
(3)洗漆:將發酵液於4000rpm速度下離心20 min,去除上清,按體積比1:3的比例將沉澱的菌體用無菌自來水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌2次，隨後用1%無菌全脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥1010 cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊製備:按3%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和1% (W/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的4°C冷卻的3% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化40min，無菌自來水洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與2%殼聚糖中覆膜45min，無菌自來水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6)乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0036]該枯草桿菌幹微膠囊產品的保質期≥ 2年，活菌數≥2 X 1010個/g，芽孢3 80% ；淡黃色，無異味。
[0037]以上製得的枯草桿菌幹微膠囊產品可應用於保健食品和醫藥領域。
[0038]實施例4
一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存於4°C保存小於一個月的枯草桿菌漢subtilis 241單菌落接種於種子培養基中，在37 °C, 200 rpm條件下培養16-20 h進行初次活化；然後按2%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液；
(2)擴大培養:將活化種子液按4-6%的接種量接種於裝有奶粉-豆柏(10%全脂奶粉與2%玉米豆柏)的110-115°C高溫滅菌的培養基(pH 7.0)的發酵罐中，在39 °C，溶解氧蘭30%條件下發酵20-24 h，繼續在28 °C發酵36-48 h至內生芽孢大量形成(芽孢生成率^ 50%)，得發酵液；
(3)洗漆:將發酵液於4000rpm速度下離心20 min,去除上清,按體積比1:3的比例將沉澱的菌體用無菌自來水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌2次，隨後用1%無菌全脂奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥101° cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊製備:按2.5% (W/V)的比例將海藻酸鈉、0.5% (W/V)阿魏酸和1% (ff/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以20 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的4°C冷卻的3% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(200 rpm),固化60min，無菌自來水洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與2%殼聚糖中覆膜45min，無菌自來水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6 )乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0039]該枯草桿菌幹微膠囊產品的保質期> 2年，活菌數> 5 X 101°個/g，芽孢3 90% ；淡黃色，無異味。 [0040]以上製得的枯草桿菌幹微膠囊產品可應用於保健食品和醫藥領域。
[0041]實施例5
一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存於4°C保存小於一個月的枯草桿菌漢subtilis 168單菌落接種於種子培養基中，在32 V, 100 rpm條件下培養24 h進行初次活化；然後按1%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養10 h進行再次活化，得活化種子液；
(2)擴大培養:將活化種子液按1%的接種量接種於裝有奶粉-豆柏(2%羊奶粉與1%大豆豆柏)的110-115°C高溫滅菌的培養基(pH 6.5)的發酵罐中，在35 °C，溶解氧蘭35%條件下發酵24 h，繼續在25 °C發酵48 h至內生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發酵液；
(3)洗漆:將發酵液於3000rpm速度下離心30 min,去除上清,按體積比1:1的比例將沉澱的菌體用無菌蒸餾水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌I次，隨後用1%無菌羊奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥IO9 cfu/ml )，得菌懸液；
(4)單層微膠囊製備:按1%(W/V)的比例將海藻酸鈉、0.1% (W/V)阿魏酸和1% (W/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以10 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的1°C冷卻的1% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(100 rpm)，固化30min，無菌蒸餾水洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與0.5%殼聚糖中覆膜60 min，無菌蒸餾水洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6 )乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0042]該枯草桿菌幹微膠囊產品的保質期≥2年，活菌數≥I X IO8個/g，芽孢3 70% ;淡黃色，無異味。
[0043]以上製得的枯草桿菌幹微膠囊產品可應用於保健食品和醫藥領域。
[0044]實施例6
一種枯草桿菌微膠囊的製備方法，包括以下步驟:
(O菌株的活化:將保存於4°C保存小於一個月的枯草桿菌漢subtilis IBL 241單菌落接種於種子培養基中，在45 V, 300 rpm條件下培養12 h進行初次活化；然後按5%的接種量第二次接入種子培養基中，在相同條件下培養4 h進行再次活化，得活化種子液；
(2)擴大培養:將活化種子液按10%的接種量接種於裝有奶粉-豆柏(20%馬奶粉與2%花生柏)的過濾除菌後的培養基(pH 6.5)的發酵罐中，在45 °C，溶解氧3 35%條件下發酵18h，繼續在35 °C發酵18 h至內生芽孢大量形成(芽孢生成率3 50%)，得發酵液；
(3)洗漆:將發酵液於10000rpm速度下離心5 min,去除上清,按體積比1:5的比例將沉澱的菌體用無菌磷酸緩衝液振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌3次，隨後用5%無菌馬奶粉液重新懸浮菌體(活菌數≥IO9 cfu/ml )，得菌懸液； (4)單層微膠囊製備:按5%(W/V)的比例將海藻酸鈉、1% (W/V)阿魏酸和2% (W/V)甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以30 ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的10°C冷卻的10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴邊加攪拌(300 rpm)，固化60min，無菌磷酸緩衝液洗滌三次，得單層溼微膠囊；
(5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊與5%殼聚糖中覆膜30min，無菌磷酸緩衝液洗滌三次，得雙層溼微膠囊；
(6)乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
[0045]該枯草桿菌幹微膠囊產品的保質期≥2年，活菌數≥IXlO9個/g，芽孢3 80%;淡黃色，無異味。
[0046]以上製得的枯草桿菌幹微膠囊產品可應用於保健食品和醫藥領域。
[0047]以上所述僅以實施例來進一步說明本發明的技術內容，以便於讀者更容易理解，但不代表本發明的實施方式僅限於此，任何依本發明所做的技術延伸或再創造，均受本發明的保護。
【權利要求】
1.一種貨架期內具有高活菌數的枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (O菌株的活化:將4°c左右的條件下保存小於一個月的枯草桿菌單菌落接種於種子培養基中，在32-45 0C , 100-300 rpm條件下培養12-24 h進行初次活化，然後按1_5%的接種量第二次將初次活化的枯草桿菌培養液接入種子培養基中，在相同條件下培養4-10 h進行再次活化，得活化種子液； (2)擴大培養:將活化種子液按1-10%的接種量接種於pH6.5-8.5的裝有的奶粉-豆柏無菌培養基的發酵罐中，在35-45°C，溶解氧3 35%條件下發酵18-24 h，繼續在25-35 °C發酵18-48 h至內生芽孢生成率3 50%，得發酵液； (3)洗滌:將發酵液於3000-10000rpm速度下離心5-30 min,去除上清液，按體積比1:1-5的比例將沉澱的菌體用無菌水振蕩混均，與前述相同條件下離心去除上清液，反覆洗滌1-3次，隨後用1-5%無菌奶粉液重新懸浮菌體，其活菌數> 101° cfu/ml，得菌懸液； (4)單層微膠囊製備:按1-5%(W/V)的比例將無菌處理的海藻酸鈉、0.1-1% (W/V)的阿魏酸和1-2% (W/V)的甘油加入菌懸液中，無菌條件下充分攪拌混勻，得菌膠液；以10-30ml/min流速用注射泵將菌膠液注入無菌的1_10 °C冷卻的1_10% (Μ/V)的氯化鈣溶液中，邊滴加邊在100-300 rpm下攪拌，固化30-60 min，無菌水洗滌三次，得單層溼微膠囊； (5)雙層微膠囊製備:將所得單層溼微膠囊用無菌處理的0.5-5%殼聚糖中覆膜30-60min，無菌水洗滌三次，得雙層溼微膠囊； (6)乾燥保藏:將雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥後在無菌條件下進行真空包裝，得枯草桿菌幹微膠囊。
2.根據權利要求1所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，對步驟(5)中所述雙層溼微膠囊進行低溫真空乾燥為40 0C以下的任何一種乾燥方式，並真空包裝。
3.根據權利要求1所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，步驟(I)中所述的枯草桿菌菌株指的是野生型枯草桿菌、基因工程的枯草桿菌中的一種或兩種。
4.根據權利要求3所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，步驟(2)所述奶粉原料為全脂牛奶、脫脂牛奶、羊奶和馬奶中的任一種，所述豆柏為玉米豆柏、大豆豆柏和花生柏的任一種。
5.根據權利要求3所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，所述的無菌方法為高溫滅菌和過濾除菌中的任一種。
6.根據權利要求4或5所述枯草桿菌微膠囊的製備方法，其特徵在於，步驟(3)(4)(5)中的無菌水為生理鹽水、磷酸緩衝液、自來水和蒸餾水的任一種。
【文檔編號】C12R1/125GK103704718SQ201310714772
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】童望宇, 羅學才 申請人:安徽大學