一種高通量快速篩選抗生素產生菌的方法及其裝置的製作方法

2023-06-11 03:40:46

專利名稱：一種高通量快速篩選抗生素產生菌的方法及其裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高通量快速篩選抗生素產生菌的新方法，另外還涉及應用在這種方法中 的新裝置。
技術背景青黴素等抗生素的發現及其在臨床上的應用對控制人類感染性疾病發揮了巨大的作用。 但隨著抗生素的廣泛使用，特別是抗生素的濫用，各種耐藥性病原體相繼出現，而且出現的 速度越來越快。例如醫院常見的感染菌耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)，能大幅增加感染性疾病 的死亡率，又例如出現了能抵抗甲氧西林、四環素、萬古黴素等多種抗生素的超級細菌。這 些細菌的出現極大地威脅著人類健康和生活質量。雖然合理服用抗生素可以降低耐藥病原微生物的出現速度，但由於各種抗藥性會在菌株 間積累和轉移，最終還是會出現如MRSA類的耐藥菌。因此，加大力度開發出新的抗生素藥物 是最有效的途徑。自然界存在著不計其數的微生物種類，這個異常豐富的微生物資源是藥物 開發的寶藏。利用細菌拮抗作用來篩選對病原菌有抑制作用的菌株，然後對其代謝產物進行 分離，從而得到抑制病原菌的有效活性成分，是開發新抗生素的傳統路線，也是最有效的方 法之一，其中青黴素就是這樣被發現的。目前，篩選不同微生物菌株之間有拮抗作用的方法主要有瓊脂塊法，濾紙片法，比濁法， 生長速率法和管碟法。瓊脂塊法就是將待篩選菌株於合適的培養基平板中培養一定的時間後， 用打孔器將待篩選菌瓊脂塊轉移到事先塗有指示菌的平板上，根據指示菌的生長特性培養一 段時間，觀測抑菌圈的大小。濾紙片法就是將經過高溫滅菌的濾紙浸入由待篩選菌株的發酵 液或其發酵液的提取物配製成的測試液中，瀝乾溶劑後平貼於塗有指示菌的平板上，培養一定時間後與對照組比較測定抑菌圈的大小，以確定是否有拮抗作用。比濁法是將待篩選菌株 的發酵液或其發酵液的提取物配製成測試液，將一定量測試液加入指示菌的液體培養基中， 培養一定時間後測定培養液濁度值的大小，並與對照組進行比較以確定是否有拮抗作用。生 長速率法是將待篩選菌株的發酵液或者發酵液的提取物製成測試液，加入適合指示菌生長的 固體培養平板中，然後將含有指示菌的瓊脂塊置於此平板中，培養一定時間後觀測菌落的大 小，並與對照組比較，確定是否有抑菌作用。管碟法是將待篩選菌株的發酵液或者發酵液的 提取物製成測試液。將無菌不鏽鋼小杯置於事先塗有指示菌的平板中，並向杯中加入一定量 測試液，培養一定時間後，與對照組比較，確定是否有抑菌作用。總體來說，上述方法都需要先純化待篩選菌，無法實現菌株的分離和篩選同步進行。除 了瓊脂塊法外，其它方法都需要對待篩選菌進行液體發酵，不僅操作繁瑣，耗時較長，液體
發酵的條件較難控制，而且有些待篩選菌株的液體發酵條件並不適合抗生素的產生。瓊脂塊 法方法雖然步驟相對簡單，但篩選拮抗菌時，需要將待篩選菌的瓊脂塊從培養的平板上轉移 到指示菌平板上，而且一次只能篩選少數幾個待篩選菌，大批量篩選操作時，含待篩選菌的 瓊脂塊的轉移不方便，需要的材料多，費時又費力。 發明內容本發明的目的在於開發出一種能快速並高通量篩選抗生素產生菌的新方法，另一 目的是開 發出應用於該方法中的新裝置。我們設計出一種新裝置，具有上下兩層培養皿，層間用半透過性微孔膜隔開，通過將待 篩選菌和指示菌分別置於其中一層，從而觀察指示菌是否出現抑菌圈，這種方法能快速並高 通量地篩選出與指示菌拮抗的菌株，從而實現了本發明的目的。本發明用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是具有上層和下層培養皿，層間用半透過 性微孔膜隔開。本發明裝置最好還具有一個上蓋和一個下蓋，以便操作和避免汙染，當然也可以不具有 蓋，需要時可蓋上無菌薄膜或薄板等。所述裝置的上或下層培養皿可以是1個或者1個以上， 所述培養皿可以為不同的形狀和大小，只要適合待篩選菌和指示菌培養都可採用。圖l示意 的裝置由帶有上、下蓋的1個上層培養皿和1個下層培養皿構成，上層培養皿底部有小孔與 下層相通，其間固定有半透過性微孔膜隔開；圖2 4示意的裝置上、下層都有多個同樣數目 的培養皿，上層培養皿是一個上為方形和下為倒圓梯形的組合，下層培養皿是上大下小的倒 梯形，上層每個培養皿底部都有小孔與下層相通；圖5 7示意的裝置上層有多個培養皿，是 一個上為方形和下為倒圓梯形的組合，下層培養皿為1個帶邊緣的平板，上層每個培養皿底 部都有小孔與下層相通，其間固定有半透過性微孔膜隔開。上述各附圖中所示的本發明裝置 上、下層結構可以互換。下層的培養皿除上述的形狀也可以是倒圓梯形、圓柱形或其它形狀。 當然在各層培養皿為多個又使用同一種培養基的情況下，培養皿的進口處最好為方形，只要 使相鄰的培養皿間有一個如冰箱中的冰格那樣的豁口 ，就能快捷地在所有培養皿中加入培養 基。考慮到使用時，按操作習慣， 一般把待篩選菌置於上層培養皿，所以裝置的上層的培養 皿最好為上大下小的形狀，這樣有利於細菌分泌的代謝產物濃縮，便於抑菌圈的觀察，而且 當下層倒入45-5(TC的培養基時，不會把上層的固體培養基融化，使之能保持原有形狀。上、 下兩層各培養皿相通的孔徑最好為2 8 mm。整個裝置包括上下蓋可以用塑料或其他便於加工和便於滅菌的材料製造。 本發明所用的半透過性膜的材質可以是纖維素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏 氟乙烯、聚碸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚碸醯胺、磺化聚碸、交鏈的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚 合物等容易滅菌的材質，其孔徑大小以在上述培養皿中倒入液態培養基不漏為宜， 一般為 0. 2 3um ，可購自市場。
本發明的篩選抗生素產生菌的方法，其特徵是先在所述的裝置其中一層培養皿中加入含 瓊脂10 15 g/L的無菌液態的待篩選菌培養基，待其凝固後，接種待篩選菌進行培養足夠時 間後，在另一層培養皿中接種指示菌，然後將分處兩層由半透過性微孔膜隔開的待篩選菌和 指示菌共同培養，觀察指示菌培養基中是否出現抑菌圈。根據上述的本發明裝置上、下層結構，所述的待篩選菌和指示菌可以分別置於其中的一 層，但因為待篩選菌需先培養，按操作習慣， 一般把待篩選菌置於上層培養皿。所述的指示菌指示菌培養過夜後接種到45 50 'C無菌液態的指示菌培養基(含瓊脂10 15g/L)中，菌濃度達102 106 cfu/mL，在待篩選菌培養5 7天時，再加入另一層培養皿中， 或在所述的待篩選菌培養基凝固後，在另一層培養皿中加入其中含瓊脂10 15 g/L的45 50 'C無菌液態的指示菌培養基，待其凝固，在待篩選菌培養基上接種待篩選菌，培養5 7天時， 再在所述的指示菌培養基上用無菌棉球均勻接種指示菌。所述指示菌、待篩選菌的培養可以 採用現有的方法。指示菌的培養方法配製適合指示菌生長的無菌培養基，其中瓊脂10 15 g/L，然後在45 50 'C接入經活化、過夜培養(一般為16小時)的指示菌；所述待篩選菌的 培養，採用適合待篩選菌生長的無菌液態培養基，在適合待篩選菌生長的溫度和溼度下進行， 培養時間與待篩選菌的生長特點有關，放線菌(分r印toy^c") —般為5 7天也可以更長； 所述的待篩選菌和指示菌共同培養一般在適合指示菌的溫度和溼度下進行，培養時間一般為 與指示菌的生長特點有關，大腸桿菌一般為24小時左右。所述的指示菌可以是大腸桿菌(&c力erc/^'a 、枯草芽孢桿菌(fe"""s 、 金黃色葡萄球菌(5YapAr7oc。cci751 a"reiAS)、銅綠假單胞菌(屍se^y。7z 。朋51 ar柳'"osa)、結 核桿菌(Cb/777e/jacte/7'"歷tt/力arc7o〃57'51)等人類致病細菌，或酵母菌(5"acc/ aro/ 7/ces cereWsiae)、念珠菌(ifo/7i7ia)等真核生物，以及其他適合平板培養和觀察的菌株等。所述的待篩選菌可以是從環境中分離得到的天然菌株包括放線菌(5Yr印to/^c")、粘細 菌(#/;ra6acteria)、假單胞菌(/^e"c/OT0/7as)，芽孢桿菌(6ac/7J"s)等原核生物，或青黴 菌(屍e/^'ci77i"歷)、念珠菌(i/o/7j7i'a)、酵母菌(5^cc力aro/ 7/ces)等真核生物，人工構建文 庫中的克隆菌，或者陸地或海洋環境樣品的混合菌液。所述的指示菌種可向廣東省微生物研 究所菌種保藏中心購買；所述的指示菌的平板培養可以採用常規的培養基，如果採用顯色培 養基，抑菌圈將更明顯，有助於觀察和分辨；所述的抑菌圈可裸眼觀測或利用抗生素效價測 量儀測定，如觀察有抑菌圈出現，與其相對應的待篩選菌就有拮抗活性。本發明方法能簡單、快速而且高通量地篩選出與指示菌拮抗的菌株，而且能夠利用環境樣品中的菌體混合液(如海綿的浸提液)直接篩選拮抗菌株，有目的地分離菌株，實現分離和篩選一次完成，篩選出的有拮抗作用的菌株與採用目前的方法得到的菌株一致。本發明還能大大減少菌株分離的工作量，提高篩選效率，加快抗生素開發的速度，而且可以大量節省試劑和降低人工成本。根據需要，本發明的篩選裝置還可與機械手臂聯用，實現高通量篩選
的自動化。


圖l:上、下層各具有一個培養皿的裝置示意圖，其中l表示上蓋，2表示上層培養皿，3表示半透過性微孔膜，4表示下層培養皿，5表示下蓋。圖2:上、下層各具有96個培養皿的裝置(上蓋己打開)的正面示意圖，其中l表示半透 過性微孔膜。圖3:上、下層各具有96個培養皿的裝置的剖面示意圖，其中l表示上蓋，2表示下蓋，3 表示半透過性微孔膜，4表示上層培養皿，5表示下層培養皿。圖4:上、下層各具有96個培養皿的裝置(下蓋已打開)的背面示意圖，其中l表示半透 過性微孔膜。圖5:上層具有96個培養皿和下層具有1個培養皿的裝置(上蓋已打開)正面示意圖，其 中l表示半透過性微孔膜。圖6:上層具有96個培養皿和下層具有1個培養皿的裝置的剖面示意圖，其中l表示上蓋， 2表示下蓋，3表示半透過性微孔膜，4表示上層培養皿，5表示下層培養皿。圖7:上層具有96個培養皿和下層具有1個培養皿的裝置的背面示意圖，其中l表示半透過 性微孔膜。
具體實施方式
以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例中使用的菌種購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。大腸桿菌(^"力erc力j's c。力')GIM1.115,枯草芽孢桿菌(few'77"s s"6"7A) GIM1.181，金黃色葡萄球菌 (5"tap/ y7ococct/s a"_reiAS) GIM1. 178，酉良酒酵母(5"acc/ arcwyces cefeia'siae) GIM2. 86。實施例中的培養基2216E、 ISP4、高氏1號、YED參照培養基手冊配置(Atlas RM， Park L C (2000) Handbook of Microbiological Media, CRC Press, Inc., Corporate Blvd. ， N. W.， Boca Raton, Florida 33431)。實施例1:從海綿浸出液中，在分離菌株的同時篩選出與枯草芽孢桿菌有拮抗作用的菌株採用附圖2 4所示的裝置，每個裝置上、下層面積各為120mmX80mm，上層每個培養皿 底部都有直徑約4 mm的小孔與下層培養皿相通，其間固定有半透過性微孔膜。打開裝置的上蓋，在上層96個培養皿中加入無菌的含瓊脂15 g/L的改良的2216E液體 培養基，待凝固後4 'C保存備用；將1 g新鮮海綿在10 mL滅菌海水中破碎成小片段，充分混勻後靜置5 min取上清，將 上清10倍稀釋，依次形成4個梯度，然後取各梯度稀釋液100 ii L分別均勻塗抹於上述的上 層培養基上，置於28 'C恆溫箱培養7天； 配製LB培養基(其成分為酵母提取粉5 g/L，氯化鈉10g/L，細菌蛋白腖10g/L,瓊脂IO g/L，培養溫度35 37 。C， pH6.8 7.2)，高壓滅菌，冷卻至約50 。C時加入過夜培養的枯草 芽孢桿菌，搖勻，菌體濃度保持在103 106cfu/mL，打開下蓋，倒入上述裝置的下層(先把 裝置倒置，打開下蓋，在上述從南海海綿樣品分離純化的菌株培養7天時倒入)，厚度為O. 5 cm， 靜置凝固後，放入28 'C培養箱中過夜；在下層培養基上共發現2個抑菌圈，其中一個抑菌圈對應的孔中只有一個單菌落；將此 單菌落轉移至新鮮的2216E固體培養基中繼代培養，初步鑑定為念珠菌(ifow7&)。實施例2:從海綿中分離篩選出與金黃色葡萄球菌具有拮抗作用的菌株用2216E培養基從南海海綿樣品分離純化出300多株菌株。採用4個與實施例1相同的裝置。打開上蓋，在裝置的上層培養皿中加入無菌的瓊脂IO g/L 的2216E固體培養基，待凝固後蓋上上蓋，倒置；打開下蓋，倒入滅菌後的約50 'C LB液體培 養基(瓊脂15g/L，其它條件同實施例l)，待其凝固後蓋上下蓋，把裝置正置；在上層的每 個培養皿中，接種不同的分離菌株，可接入約5 yL菌液或用接種環挑取單個菌落；然後置於 28'C恆溫箱中，上蓋朝上正置培養14天；取出裝置打開下蓋，在下層的培養基上用無菌棉球 均勻塗抹金黃色葡萄球菌菌液，晾乾後37'C培養過夜，裸眼隨時觀測抑菌圈的出現；共發現 28個抑菌圈，並查找對應的待篩選菌；經初步鑑定，此28個菌株包括放線菌(5Yrepto/z7/ces)， 假單胞菌(/^e"ob w/7as)，青黴菌(屍e/7icW72'咖)，酵母菌(fecc力ar咖7ces)和芽孢桿菌採用瓊脂塊法也同樣篩選出28個與金黃色葡萄球菌有拮抗作用的菌株，而且兩種方法篩 選出的菌株一致。實施例3:從土壤中分離篩選出與酵母菌有拮抗作用的菌株用ISP4培養基從神農架自然保護區收集到的土壤樣品中，分離純化出80多株菌株； 採用一個附圖5 7所示的裝置，該裝置上、下層面積各為120mmX80mm，上層由96個的 培養皿組成，下層為l個帶邊緣的平板培養皿，上層96個培養皿底部都有直徑約6mm的小孔與 下層相通，緊貼各孔固定有半透過性微孔膜，下層蓋子用合金材料製成，尺寸為130 mmX90 mmX 10 mm。打開上蓋，在裝置上層96個培養皿中加入無菌的改良的ISP4培養基(瓊脂IO g/L)後接 種。每個培養皿接種不同的分離菌株，可接入約5uL菌液或用接種環挑取單個菌落，將上述 接種後的裝置蓋上上蓋，於28'C恆溫箱培養15天。配製YED培養基(瓊脂10g/L)，高壓滅菌，冷卻至50'C時加入過夜培養的釀酒酵母菌， 搖勻，菌體濃度保持在104CFU/mL，倒入上述裝置的下層，厚度為0.5cm。靜置凝固後，放入 3(TC培養箱中過夜。利用抗生素效價測量儀測定下層指示菌培養基中出現的抑菌圈，共發現 7個與釀酒酵母菌有拮抗作用的菌株；此7個菌株初步鑑定包括放線菌(5Yre/^o/ y^es)，假單
胞菌(Pseudomonas);採用瓊脂塊法，也同樣篩選出7個與釀酒酵母菌有拮抗作用的菌株，而且兩種方法篩選出 的菌株一致。實施例4:從文庫中篩選出與大腸桿菌有拮抗作用的克隆用穿梭載體pOJ446 ( Bierman M et al. Gene， 1992， 116(1) :43-49.)構建了海綿的 宏基因組文庫。將此文庫質粒轉移到鏈黴菌中，得到了400個克隆。 採用實施例1所示的裝置5個。打開裝置上蓋，在各裝置上層96個培養皿中加入無菌高氏固體1號培養基(瓊脂IO g/L) 厚度為0.5cm左右，將400個克隆分別接種到各培養皿中，將接種後的裝置蓋上上蓋，置於28 'C恆溫箱培養7天。配製LB培養基(瓊脂15 g/L，其它條件同實施例l),高壓滅菌，冷卻至50 。C時，加入 5-溴-4-氯-3-吲哚-e-D-半乳糖苷(其終濃度為0.05 mg/mL)和大腸桿菌(培養基中菌體濃度 為10、fu/mL)，搖勻，倒入裝置的下層(先把裝置倒置，打開下蓋，在上述從南海海綿樣品 分離純化的菌株培養5天時倒入)，厚度為0.5 cm。靜置凝固後，放入37 'C培養箱中過夜， 裸眼觀測下層指示菌培養基中出現的抑菌圈，共發現l個與大腸桿菌有拮抗作用的菌株。採用瓊脂塊法，也同樣篩選出l個與大腸桿菌有拮抗作用的菌株，而且兩種方法篩選出的 菌株一致。
權利要求
1.一種用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是具有上層和下層培養皿，層間用半透過性微孔膜隔開。
2. 根據權利要求l所述的一種用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是所述的上層或下 層培養皿可以是1個或者1個以上。
3. 根據權利要求2所述的一種用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是上層的培養皿為 上大下小的形狀。
4. 根據權利要求3所述的一種用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是所述上層的培養 皿形狀是上為方形和下為倒圓梯形。
5. 根據權利要求1或2或3或4所述的一種用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是還 具有一個上蓋和一個下蓋。
6. 根據權利要求5所述的一種用於篩選抗生素產生菌的裝置，其特徵是所述的半透過性 微孔膜的孔徑為0.2 3um。
7. —種用權利要求1 6所述任一裝置篩選抗生素產生菌的方法，其特徵是在所述的裝 置其中一層培養皿中加入含瓊脂10 15g/L的無菌液態的待篩選菌培養基，待其凝固後，接 種待篩選菌進行培養足夠時間後，在另一層培養皿中接種指示菌，然後將分處兩層由半透過 性微孔膜隔開的待篩選菌和指示菌共同培養，觀察指示菌培養基中是否出現抑菌圈。
8. 根據權利要求7所述裝置篩選產抗生素菌株的方法，其特徵是所述的指示菌培養過夜 後接種到45 50 。C無菌液態含瓊脂10 15 g/L的指示菌培養基中，菌濃度達102 106 cfu/mL，在待篩選菌培養5 7天時，再加入另一層培養皿中，或在所述的待篩選菌培養基凝 固後，在另一層培養皿中加入其中含瓊脂10 15 g/L的45 50 "C無菌液態的指示菌培養基， 待其凝固，在待篩選菌培養基上接種待篩選菌，培養5 7天時，再在所述的指示菌培養基上 用無菌棉球均勻接種指示菌。
9. 根據權利要求7或8所述篩選抗生素產生菌的方法，其特徵是所述的待篩選菌是從環 境中分離得到的天然菌株包括原核生物，真核生物或人工構建文庫中的克隆菌；所述指示菌 是人類致病細菌或真核生物。
10. 根據權利要求9所述篩選抗生素產生菌的方法，其特徵是所述的待篩選菌原核生物 是放線菌(5Yr印to邁/ces)、粘細菌(ify;ro力acz^ria)或假單胞菌(/^euob/z o朋s)，所述的待 篩選菌真核生物是青黴菌(屍e/w'^7力'，)、念珠菌(i/w^7ia)或酵母菌(5scc力a/^ /ce5)， 所述的指示菌人類致病細菌是大腸桿菌(&c力erc力ia ""')、枯草芽孢桿菌(5sw7^as 勵"7A)、金黃葡萄球菌(5"t邵力/kocc〃s awre〃s)、銅綠假單胞菌屍se油/77。朋s ar柳V osa) 或結核桿菌(6b/y/7e/^cter^y/T7 t"6erc化i/w's)所述的指示菌真核生物是釀酒酵母菌(5"acc/ ara77/ces cereKis^'se)或念珠菌(#o"Ws)。
全文摘要
本發明涉及一種篩選抗生素產生菌的方法及其裝置，其特徵是用於篩選抗生素產生菌的裝置具有上層和下層培養皿，層間用半透過性微孔膜隔開，先在該裝置其中一層培養皿中加入含瓊脂10～15g/L的無菌液態的待篩選菌培養基，待其凝固，接種待篩選菌進行培養足夠時間後，在另一層培養皿中接種指示菌，然後將分處兩層由半透過性微孔膜隔開的待篩選菌和指示菌共同培養，觀察指示菌培養基中是否出現抑菌圈。本發明方法能簡單、快速而且高通量地篩選出與指示菌拮抗的菌株，而且能夠利用環境樣品中的菌體混合液(如海綿的浸提液)直接篩選拮抗菌株，實現分離和篩選一次完成，大大減少菌株分離的工作量，提高篩選效率，並大量節省試劑和降低人工成本。
文檔編號C12M1/34GK101148641SQ20071002960
公開日2008年3月26日 申請日期2007年8月6日 優先權日2007年8月6日
發明者姜淑梅, 戴世鯤, 翔 李, 歐陽永長, 嶺 秦, 謝練武 申請人:中國科學院南海海洋研究所