大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法

2023-06-10 21:25:41

專利名稱：大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法
技術領域：
本發明屬於生物制氫技術，具體地說是大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫 產量的方法。
背景技術：
能源短缺和環境汙染成為當代人類社會發展面臨的兩大難題，開發和利用清潔能 源迫在眉睫。氫氣能量密度高，燃燒後只產生水、不產生具有溫室效應的CO2和其它有毒氣 體，對環境無汙染，是一種極具開發潛力的理想清潔能源。現有技術製備氫氣的方法是通過 水電解製備氫，但是這種方法耗費電能，實際上是以電能換取氫氣能源。生物制氫是解決氫 氣來源可持續生產問題的重要途徑之一。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種 單細胞綠藻，其氫酶(H2ase)基因在厭氧條件下被誘導表達，能將光合作用中產生的H+和 e_合成H2，釋放到細胞外，是利用太陽能生產氫氣的理想方法。萊茵衣藻生長速度快，培養 成本低，其氫酶活性高，是有極大潛力的微藻光合制氫藻種。但是萊茵衣藻氫酶對氧氣敏 感，很容易受氧氣的抑制而失去活性；而氧氣又是衣藻光合作用的主要產物。這一對矛盾限 制了衣藻的產氫效果，限制了衣藻產氫技術的應用。因此，為了提高衣藻光合產氫效率，需 要儘可能的降低衣藻細胞內的氧氣含量。目前降低衣藻細胞內的氧氣含量的辦法是通過抑 制光合系統II (PS II)的活性，從而實現抑制光解水放氧，但是該方法同時抑制了光合鏈電 子傳遞效率，影響了衣藻的產氫效率；另一方面，缺氧條件下衣藻的生長受到嚴重抑制，最 終影響了產氫效率。豆科植物根瘤中的固氮酶有很高的固氮活性，與根瘤細胞中含有大量的豆血紅蛋 白(leghemoglobin，簡稱Lb)有密切關係。豆血紅蛋白具有與氧氣可逆結合、降低細胞內氧 濃度和調節呼吸作用的特性，既能維持根瘤細胞內較低的氧氣含量，又能保障呼吸作用需 要的氧氣和固定空氣中氮素需要的能量。豆血紅蛋白有兩個亞基構成，一個是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另一個是血紅 素輔基，由共生的根瘤菌合成。兩個亞基結合成為有活性的豆血紅蛋白。在植物細胞內、尤 其是在葉綠體中，血紅素輔基前體可以通過葉綠素合成途徑合成。植物葉綠體中，原撲啉在 鎂螯合酶的作用下生成葉綠素；在根瘤細胞中，原撲啉在根瘤菌合成的亞鐵螯合酶催化下 合成血紅素輔基。植物細胞中存在著具有與亞鐵螯合酶相似功能和相似結構的吡啶核苷酸 二硫酸氧化還原酶(pyridine-nucleotide disulfide oxidoreductase)的蛋白酶家族。本發明針對衣藻產氫培養需要無氧條件的關鍵問題，利用來源於大豆(Glycine max)根瘤的豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba，解決衣藻產氫代謝過程中需要儘量降低細胞 內氧氣含量又儘量保證其正常代謝的技術難題。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba，解決萊茵衣藻 產氫中降低細胞內氧氣含量，提高氫化酶活性，又能保障呼吸作用需要的氧氣的技術方法。
本發明的目的是這樣實現的1、大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻的培養A、選細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849 ；B、培養萊茵衣藻藻種 (a)液體培養基溫度25士 1°C ；日光燈光照強度100 200微摩爾光量子/ 平方米·秒(μ mol photonsm—、-1) ；50 IOOml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽 (Tris-Acetate-Phosphate簡稱TAP)培養基液體培養，初始pH7. 2，水平搖床轉速100 130rpm,每5 6天1 %接種繼代培養；(b)固體平板TAP培養基瓊脂粉1. 5% ；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線 方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、產氫培養條件在缺硫培養基中進行，把正常的TAP培養基的硫酸鎂、硫酸鐵、 硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對數期後期 的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細胞並用缺硫培養基洗3次，懸浮在缺硫培養基 內，分別裝在培養瓶內，培養瓶上方留IOml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養24 小時，然後放在連續光照件下培養，光照強度50 100微摩爾光量子/平方米·秒(μ mol photons HT2iT1)，溫度25士 1°C ；每24小時進行氣體成分和含量檢測一次；D、用GC測定氫氣和氧氣含量氣相色譜儀為美國Agilent Technologies公司生 產的7890A型號，分子篩51/8 (OD)，柱長2m，內徑3mm，熱導檢測器TCD，以氬氣作為載氣。進 樣體積0. 5ml，柱溫50°C，進樣溫度200°C，熱導檢測溫度300°C ；(2)豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的克隆A、取大豆成熟的根瘤液氮研磨，提取大豆的總RNA ；用DNA水解酶DNase 137°C水浴 30min,去除RNA中混雜的DNA ；加入25mM乙二胺四乙酸，65°C水浴lOmin，終止DNA水解酶 的活性；37°C水浴60min合成單鏈cDNA ；B、用DNA聚合酶(ExTag)進行聚合酶鏈式反應(PCR)克隆大豆Iba基因，反應條 件94°C預變性5min，一個循環；94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延伸Imin ；共30個循 環；72°C延伸lOmin，反應產物純化回收；C、測序鑑定Iba基因的特異性引物Lba-Pl :5，-C gag CtC
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gag-3』，斜體表示限制性內切酶Small的酶切位點序列，方框中的序列是加入的增強翻譯 能力的核糖體結合位點RBS序列；Lba-P2 :5，-tcc CCC ggg ata cta att atg cct tct taa tag c_3，，斜體表示 限制性內切酶SacI酶切位點序列；(3)萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建用限制性內切酶Small和SacI來酶切克隆得到的大豆Iba基因片段和葉綠體 表達載體cg40 ；將Iba基因片段用T4DNA連接酶連接在質粒cg40中的壯觀黴素抗性基因 aadA之後形成aadA-lba融合基因，得到衣藻葉綠體表達載體cg401-l-lba，轉化大腸杆 菌DH5 α，提取質粒，經限制性內切酶Small和SacI雙酶切鑑定，得到442bp的Iba片段和5900bp的質粒片段；(4)萊茵衣藻葉綠體的轉化A、取IOOml對數期中後期的萊茵衣藻，25 °C下3000rpm離心5min收集藻細胞， 用新鮮TAP洗三次，塗於新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米·秒 (umol photons ·πΓ2 · s—1)和25士 1°C條件下培養24小時；用基因搶轟擊轉化；真空 度9. 48192 X IO4Pa,轟擊距離9cm，氦氣壓力7. 584236 X IO6Pa,金粉子彈經限制性內切酶 EcoRI酶切質粒cg401-l-lba DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1. 0微米；B、轉化後的衣藻在光照和25士 1°C條件下，過渡培養18h，用TAP液體培養基衝洗， 塗布於含壯觀黴素100μ g/ml的TAP固體選擇培養基上，在25 士 1°C和100微摩爾光量子/ 平方米·秒(μ mol photons · m_2 · s—1)的連續光照條件下，培養約7 15天；取有抗性的 單藻落分別在選擇培養基上多次繼代培養；分別進行產氫培養，並檢測產氫量和耗氧量；(5)轉基因萊茵衣藻中Iba基因的整合及其表達A、Iba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測取對數生長後期衣藻培養液，4°C低速離心收集，加入350 μ INET的0. lmol/L氯 化鈉，50mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8. 020mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸重懸沉澱， 加入25 μ 110mg/ml的蛋白酶K及25 μ 1 20%十二烷基硫酸鈉(SDS)，混合均勻，37°C水浴 12小時，冷卻；加入200 μ 1 5mol/L醋酸鉀(KAc)，冰上靜置、離心，上清液中加入等體積的 25 24 1酚/氯仿/異戊醇抽提2次；再用等體積的氯仿抽提1次；總DNA用無水乙醇 沉澱和70%乙醇洗滌，乾燥後溶於30 μ 1三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA， 簡稱TE)緩衝液；B、轉基因萊茵衣藻中Iba基因轉錄的檢測取對數生長期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細胞；提取萊茵衣 藻的總RNA和合成cDNA ；利用上述Iba基因的特異性引物和上述克隆Iba基因所述的PCR 條件進行擴增，進行Iba基因轉錄水平的檢測，得到442bp的擴增條帶；C、轉基因萊茵衣藻中Lba表達量的檢測取產氫培養的萊茵衣藻培養液，室溫3000rpm快速離心5min收集藻細胞，用 250μ 1蛋白提取緩衝液懸浮，加入2μ 1 β-巰基乙醇，液氮凍融三次；在4°C條件下，14000g 離心20min，取100 μ g的蛋白上清液加上0. 25摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸配製的緩 衝液(Tris-HCl)，pH 8. 0 ;25 % 甘油；7. 5 % 十二烷基硫酸鈉(SDS) ；0. 25mg/ml 溴酚蘭 (bromophenolblue) ；12. 5% (ν/ν) β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)於 10% 的分離膠和 5%的濃縮膠進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，抗大豆 Lba多克隆抗體進性免疫雜交檢測，對辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP) 標記的抗體進行化學發光檢測；(6)分析重組豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻生長的影響
A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計檢測萊茵衣藻在750nm處的吸光度；B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細胞，加入同體積的95%乙醇溶液，混合均勻， 室溫避光放置20min，4°C下12000rpm離心IOmin ；取上清，測定OD665及OD649的吸光值；C、計算葉綠素a，葉綠素b及總葉綠素的含量，單位mg/L 葉綠素Chl (mg/1)= 20. 04 (OD649)+6. 10 (OD665)；
(7)分析豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻產氫培養的耗氧量和產氫量的影 響A、缺硫培養基中耗氧量和產氫量的檢測B、含硫培養基中對耗氧量和產氫量的檢測。本發明步驟(l)B(b)中萊茵衣藻單克隆接種方法為劃線方法接種。步驟(4)A中金粉子彈經限制性內切酶EcoRI酶切質粒cg401-l-lba DNA包裹。步驟(5)C中液氮凍融次數為三次。步驟(6)A中使用的分光光度計為TU-1901雙光束紫外可見光光度計。本發明豆血紅蛋白基因在綠藻或藍藻產氫中的應用方法，使得降低微藻細胞內氧 氣含量和提高產氫量成為可能，克服了生物制氫中的一個重大技術難題，對於人類開闢新 能源有極大的促進和推動作用。通過研究發現，大豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba在萊茵衣藻的葉綠體中表達以 後，使轉基因衣藻產氫培養體系中的氧氣含量較快速度降低和維持在較低的氧氣含量水 平，產氫量增加。而這種結果是之前沒有想到的，其用途也是人們在生物制氫領域一直尋求 而沒有想到的。本發明一個豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba來源於大豆，該Iba基因的核苷酸序 列和胺基酸序列是已知的，其基因庫(NCBI GenBank)序列號是V00453，本領域的技術人員 可以通過基因序列中的數據信息進行檢索得到該Iba基因的信息。本發明優選具有該序列 號信息所示的核苷酸序列，更優選的是編碼具有該序列號信息所示的胺基酸序列的基因。 本發明的一個具體實例中，特別提到的一個豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba克隆於大豆根 瘤的cDNA，利用本領域技術人員公知的方法，可以直接從大豆根瘤細胞中提取mRNA，再反 轉錄成cDNA，然後用PCR方法克隆用於本發明的豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba。可選擇 地根據已知的核苷酸序列和胺基酸序列合成該基因。可選擇地利用已有的含有該基因的質 粒中提取該目的基因。本發明表達載體除了上面特別提到的豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba基因，還包 括啟動子、終止子，選擇性標記基因、增加轉錄和表達穩定性的調控子以及能夠使目的基因 整合到宿主細胞DNA上並穩定表達的基因片段等，這些都是在植物和藻類轉基因工作中常 用的基因表達元件。本發明的另一個具體實例中，用於豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba的 表達載體包括PsbB啟動子和終止子、3』 -rbcL轉錄穩定性增強元件、aadA篩選性標記基因 和幫助該表達載體整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上的含atpB基因序列的cpDNA-Ι序列區域 和cpDNA-2序列區域。本發明提供的啟動子、終止子、增加轉錄穩定性的調控子和幫助目的基因整合到 葉綠體DNA上的基因片段的種類不受限制，只要能夠在豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba基 因導入並整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上、能將該基因穩定表達就可以。優選的是psbB啟動 子和終止子、3』-rbcL基因序列以及含atpB基因序列的基因序列片段等萊茵衣藻葉綠體內 源基因表達調控元件。本發明所指的轉化包括基因槍轉化法和電 擊轉化法，更優選的是基因槍轉化法。 具體的在利於表達載體導入的條件下，用包被表達載體DNA的金粉轟擊衣藻細胞，將含有 包括豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba的表達載體導入萊茵衣藻細胞的葉綠體中。
本發明通過抗生素的選擇性篩選出表達豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba的轉基因萊 茵衣藻，並進一步在抗生素平板上多次繼代培養，增加目的基因在轉基因萊茵衣藻葉綠體 DNA中的整合率，並篩選出產氫培養體系中氧氣含量較低、產氫量較高的轉基因萊茵衣藻單 克隆。本發明表達理解為將起始DNA或RNA的遺傳信息轉移至基因產物多肽或蛋白質， 即豆血紅蛋白球蛋白亞基。
本發明轉基因或重組理解為將遺傳信息轉移至生物體，特別是萊茵衣藻。這意味 著包括引入所有對熟練工作人員所公知信息的方法，例如粒子轟擊、電穿孔、化學介導或膿 桿菌介導的攝入、顯微注射等。遺傳信息可引入細胞，例如以DNA、RNA、質粒或以任何其它 方式，並且通過重組摻入宿主基因組的方式。本發明轉基因萊茵衣藻是經過遺傳修飾的萊 茵衣藻。本發明在世界上首次提供了豆血紅蛋白基因未被發現和記載的新性能和新用途； 首次提供了一種降低綠藻產氫培養體系中氧氣含量和提高產氫量的新方法，因此本發明具 有新穎性和創造性。本發明通過生物制氫為人類提供清潔理想能源，是解決人類面臨的能 源緊缺、環境汙染重大難題的發明，有極大的實用價值。本發明優點如下1、首次提供了一個在葉綠體中表達豆血紅蛋白球蛋白亞基基因Iba的和產氫量 增加的轉基因萊茵衣藻藻種。2、萊茵衣藻產氫量明顯增加。3、本發明方法適用於所有產氫的微藻。為本發明目的的生物體是更多具有光合活性的產氫微藻和需要呼吸提供能量進 行產氫代謝的微藻或微生物，如微型綠藻、藍藻、光合細菌。優選的藻類是微型綠藻如萊茵 衣藻和藍藻如集胞藻屬(Synechocystis)。


圖1為萊茵衣藻葉綠體轉化載體cg401-l-lba主要基因元件結構圖。圖2為萊茵衣藻葉綠體表達載體cg40-l-l-lba的酶切鑑定電泳圖。圖3為葉綠體中轉化Iba基因的萊茵衣藻在含IOOmg. L—1壯觀黴素的TAP平板上 (上圖)和TAP液體培養基中(下圖)篩選。A 轉化Iba基因的萊茵衣藻；B:轉化cg40載 體的萊茵衣藻(陽性對照組)；C 轉化載體cg401-l的萊茵衣藻(陽性對照組)；D 未轉基 因的萊茵衣藻849 (陰性對照組)。圖4為萊茵衣藻葉綠體中轉化Iba基因的PCR鑑定圖。A圖以總DNA為模版的 PCR電泳圖；1轉基因萊茵衣藻；2未轉基因萊茵衣藻；3分子標記DL2000 ；B圖以cDNA為 模版的PCR電泳圖；1-3轉基因萊茵衣藻；4未轉基因萊茵衣藻；5分子標記DL2000。圖5為對葉綠體中轉化Iba基因的萊茵衣藻中Lba表達量進行WesternBlot檢測 結果圖。C:表達cg401-l-lba的大腸桿菌BL21的蛋白樣品(陽性對照組)。前一組數字 0、3、5和7分別指轉基因萊茵衣藻開始進行產氫培養的天數；後一組數字3和5分別指未 轉基因的萊茵衣藻開始進行產氫培養的天數(陰性對照組)。圖6為葉綠體中轉化Iba的萊茵衣藻與未轉基因萊茵衣藻849的生長情況的比較圖。圖7為葉綠體中轉化Iba的萊茵衣藻與未轉基因萊茵衣藻849在培養基中分別含 0、12. 5、50、100 μ M硫酸鹽的產氫培養條件下耗氧量和產氫量的比較圖。
具體實施例方式實施例1 萊茵衣藻及其培養因為萊茵衣藻生長速度快、培養成本低、氫化酶活性高，所以是微藻光合制氫的代 表物種。為了使轉基因容易操作，本發明優選細胞壁缺欠型的萊茵衣藻藻種cc849。①正常培養條件按照Harris 主編的《The Chlamydomonas Sourcebook a comprehensive guide to biology and laboratory use. New York AcademicPress. 1989》，優選是在 25 士 1°C，日光燈光照強度(100 200mol photonsnT2s-1)， 液體培養是在50 100ml Tris-Acetate-Phosphate (簡稱TAP)培養基，初始pH7. 2，水平 搖床轉速100 130rpm，每5 6天1 %接種繼代培養；固體TAP (平板)培養基含1. 5%的 瓊脂粉，藻種的保存和純化是挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上， 每3周繼代一次。②產氫培養條件按照Melis等(PlantPhysiology. 2000,122 :127_136)的方法， 萊茵衣藻的產氫培養是在缺硫培養基(簡稱TAP-S)中進行。缺硫培養基(TAP-S)是把正 常的TAP培養基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯 化銅和氯化鋅。本發明為了此技術將來能在工業化生產中應用，有目的的簡化了其產氫培 養的操作步驟即將生長至對數期後期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細胞並 用TAP-S培養基洗3次，然後懸浮在TAP-S或者含有不同濃度硫酸鹽的TAP-S培養基內，分 別裝在50ml的培養瓶內，培養瓶上方留IOml的空間，立刻用翻口橡皮塞塞緊培養瓶密閉培 養，先放在黑暗條件下培養24小時，然後放在連續光照件下培養，光照強度50 100 μ mol photons HT2iT1,溫度25士 1°C。每24小時用微量氣密進樣器抽取瓶中氣體，進行氣體成分 和含量檢測。③按照冉春秋等(高等學校化學學報，2006，27:62-66.)的方法用GC測定氫 氣和氧氣含量。氣相色譜儀為美國Agilent Technologies公司生產的7890A，分子篩 5X1/8 (OD)，柱長2m，內徑3mm，熱導檢測器TCD，以氬氣作為載氣。進樣體積0. 5ml，柱溫 50°C，進樣溫度200°C，熱導檢測溫度300°C。用本領域熟練技術人員公知的外標法計算氫 氣和氧氣體積。實施例2 豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的克隆通過本領域熟練技術人員所公知的標準方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)以及所用試劑製造商的產品說 明書(QIAGENTM，PromegaTM)提取大豆的總RNA和合成cDNA以及對RNA進行濃度和純度檢測。 具體實施方法是取大豆成熟的根瘤0. lg，液氮研磨，按照QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit 試劑製造商說明書提取大豆的總RNA，其濃度和純度用紫外分光光度法檢測。並用DNase I (Fermentas ) 37°C水浴 30min，去除 RNA 中混雜的 DNA ；然後加 入 25mM EDTA, 65°C水浴lOmin，終止DNase I的活性。單鏈cDNA的合成是按照Promega AMVRT protocol製造商 說明書進行在25 μ 1反應體系中含2 μ g的總RNA和1 μ gRadom Primer, 37°C水浴60min。本發明根據NCBI GenBank中大豆Iba基因(序列號V00453)的核苷酸序列設計特 異性引物，並在引物前分別添加特異性酶切位點序列，用ExTag進行PCR反應克隆大豆Iba 基因。PCR反應條件為94°C預變性5min，一個循環；94°C變性lmin，62°C退火30s，72°C延 伸lmin ；共30個循環；72°C延伸10min，PCR產物用QIAGEN公司生產的試劑盒純化回收，並 測序鑑定正確性。Iba基因的特異性引物如下
Lba-Pl :5，_c gag etc
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actgag-3』，斜體表示限制性內切酶Smal I酶切位點序列，方框中的序列是加入的增強翻譯 能力的核糖體結合位點RBS序列。Lba-P2 :5，-tcc CCC ggg ata cta att atg cct tct taa tag c_3，，斜體表示
限制性內切酶SacI酶切位點序列。實施例3 萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建通過本領域熟練技術人員所公知的標準方法(Sambrook等，MolecularCloning. New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)禾口 Vaistij 等對萊茵衣藻葉 綠體表達載體cg40描述的方法(The Plant Journal, 2000, 21 (5) :469_482)進行載體構 建。具體實施方法為分別用限制性內切酶Small和SacI來酶切上述克隆得到的大豆 Iba基因片段和載體cg40，將純化的Iba基因片段通過上述兩個酶切位點用T4DNA連接酶 連接在質粒cg40中的aadA基因之後形成aadA-lba融合基因，得到衣藻葉綠體表達載體 cg401-l-lba (圖1)，轉化大腸桿菌DH5 α，提取質粒，經限制性內切酶SmaI和SacI雙酶切 鑑定，得到大小正確的442bp的Iba目的片段和5900bp的質粒片段(圖2)。實施例4 萊茵衣藻葉綠體的轉化通過Boynton 等(Science，1988，240 (4858) 1534-1538)的方法對萊茵衣藻 葉綠體進行轉化，取IOOml生長至對數期中後期(約4 5X IO6)的萊茵衣藻，25 °C下 3000rpm離心5min收集藻細胞，用新鮮TAP洗三次，塗於新鮮TAP固體平板上，在光照 100 μ mo 1 · πΓ2 · 和 25士 1°C條件下培養 1 天，用基因搶(BioRad , Model :PDS1000/He Biolistic particle delivery system))進行轟擊轉化。參數為真空度9. 48192X IO4Pa, 轟擊距離9cm，氦氣壓力7. 584236 X IO6Pa,，金粉顆粒直徑1. O μ m。金粉子彈用線性化的質 粒cg401-l-lba DNA(經限制性內切酶EcoRI酶切)包裹。轉化後的衣藻在25°C和光照下經過18h過渡培養後，用TAP液體培養基衝洗下來， 塗布於含壯觀黴素100 μ g/ml的TAP固體選擇培養基上，於25°C和100 μ mol ·πΓ2 .s—1的連 續光照條件下，培養約7 15天，挑取有抗性的單藻落分別在選擇培養基上多次繼代培養 (圖3)，然後分別進行產氫培養並檢測產氫量和耗氧量，使用氫氣、氧氣和氮氣標準品(上 海基量標準氣體有限公司)定義所測氣體的組成和含量。實施例5 分析轉基因萊茵衣藻中Iba基因的整合及其表達
①Iba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測測定Iba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的合適方法是實施下文所述的PCR法， 如果Iba基因通過同源重組交換的方式整合到萊茵衣藻葉綠體DNA上，則以轉基因衣藻總 DNA為模板的PCR產物應該是5892bp，而未整合的PCR產物應該是5400bp (圖4，A)。其 中與萊茵衣藻葉綠體DNA結合的引物是cpDNA-Pl :5』 -aga cag cca aca ttt tgt ta_3，； cpDNA~P2 5' -get tea aaa aca aaatca 已已一3』。通過 Rochaix 禾口 Erickson 的方法(Trends in Biochemistry Science, 1988,13 56-59)提取衣藻總DNA。具體地，取IOml處於對數生長後期的衣藻培養液，4°C低速離心收 集，加 350μ1 NET(0. lmol/L NaCl, 50mmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)重懸沉 澱，加入25μ1 10mg/ml的蛋白酶K (Proteinase K)及25 μ 1 20% SDS，混勻並於37°C水浴 過夜，冰上冷卻，加入200 μ 1 5mol/L KAc，冰上靜置後離心，上清中加入等體積的酚/氯仿 /異戊醇(25 24 1)抽提2次，再用等體積的氯仿抽提1次，總DNA用無水乙醇沉澱和 70%乙醇洗滌，乾燥後溶於30 μ 1 TE緩衝液，用於上述PCR檢測。②轉基因萊茵衣藻中Iba基因轉錄的檢測檢測Iba基因在轉基因萊茵衣藻中是否轉錄的合適方法是按照本領域熟練技術 人員所公知的反轉錄PCR的標準方法(Sambrook等，Molecular Cloning. New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1998)或參照上述的大豆Iba基因克隆方法的實施部 分。萊茵衣藻的取樣是取對數生長期中期的萊茵衣藻Iml左右，室溫3000rpm離心5分鐘收 集藻細胞。按照試劑盒製造商的產品說明書(QIAGEN ，Promega )提取萊茵衣藻的總RNA 和按照Promega AMV RTProtocol說明書合成cDNA，利用上述Iba基因的特異性引物和上 述克隆Iba基因所述的PCR條件進行擴增，進行Iba基因轉錄水平的檢測，結果得到442bp 的擴增條帶(圖4，B)，測序後證明Iba基因在轉基因萊茵衣藻中正確轉錄。③轉基因萊茵衣藻中Lba表達量的檢測參照Hemschemeier等(Planta，2008，227 :397_407)的方法提取萊茵衣藻總蛋白 和進行Western blot檢測。具體地，取20_30ml進行產氫培養的萊茵衣藻培養液，快速室 溫3000rpm離心5min收集藻細胞，用250μ 1蛋白提取緩衝液(50mM Tris/HCl pH 8. 3,1% Triton-X 100)懸浮，加入2 μ 1 β -巰基乙醇，液氮凍融三次後，4°C，14000g離心20min，取 100 μ g 的蛋白上清液加上樣緩衝液(0. 25M Tris-HCl,pH 8. O ；25% glycerol ；7. 5% SDS ； 0. 25mg ml-lbromophenolblue ；12. 5% (v/v) 2-mercaptoethanol)於 10% 的分離膠禾口 5% 的濃縮膠進行SDS-PAGE凝膠電泳後，轉PVDF膜(Millipore，USA)，一抗用抗大豆Lba多克 隆抗體(上海中科蛋白抗體製備公司)進性免疫雜交檢測，按照ECL Plus (Amersham公司) 說明書對辣根過氧化酶HRP標記的抗體進行化學發光檢測，結果表明在產氫培養的第三天 開始能檢測到Lba，在第五天表達量最大，第七天又幾乎檢測不到(圖5)。對於蛋白質的定 量和SDS-PAGE凝膠電泳以及western blot實驗中的轉膜、封閉、雜交、洗膜、顯影等操作技 術是本領域熟練技術人員所公知的標準方法(Sambrook等，Molecular Cloning. New York Cold Spring HarborLaboratory Press. 1998)或按照試劑盒製造商說明書(Bio-Rad Bradfordkit 禾口 GE Healthcare)。實施例6 分析重組豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba 對萊茵衣藻生長的影響
本發明是通過測量轉基因藻前後萊茵衣藻的細胞數和葉綠素含量的變化來比較 在葉綠體中表達豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻生物量的影響。藻細胞數和葉綠 素含量的測定是參照 Harris 主編的((The ChlamydomonasSourcebook :a comprehensive guide to biology and laboratory use. NewYork :Academic Press. 1989》方法，因為萊茵 衣藻在750nm處的吸光度(OD75tl)與萊茵衣藻的細胞數正相關，所以用分光光度計(TU-1901 雙光束紫外可見光光度計)直接檢測培養的萊茵衣藻在750nm處的吸光度作為萊茵衣藻細 胞數的生長指標。葉綠素含量的測定是取Iml藻液，3000rpm離心5min收集藻細胞，加入 同體積的95%乙醇溶液，混勻，室溫避光放置20min後，4°C下12000rpm離心lOmin，取上清 液，測定OD665及OD649的吸光值，根據下列公式計算出葉綠素a，葉綠素b及總葉綠素的含量， 單位是 mg/L。葉綠素 Chl (mg/1) = 20. 04X (OD649) +6. IOX (OD665)。結果表明在葉綠體中表達豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba使轉基因萊茵衣藻的生長 受到輕微的抑制(圖6)。實施例7 分析豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻產氫培養的耗氧量和產氫量的影響①在缺硫培養基中對耗氧量和產氫量的檢測因為在缺硫培養基中，萊茵衣藻PSII的活性受到抑制，但是呼吸作用不受影響， 在密封條件下萊茵衣藻液體培養基中的氧氣含量因為呼吸消耗而快速下降，致使液體培 養基中出現缺氧狀態，誘導萊茵衣藻氫酶表達而開始產生氫氣，通過檢測密封瓶子上方封 存的空氣中的氧氣和氫氣含量變化情況就能反映出萊茵衣藻的耗氧和產氫情況。結果表 明(圖7，A、B)，轉Iba基因的萊茵衣藻培養體系中的氧氣含量從進行產氫培養開始就下 降得快，在第三天的時候達到最低，為3. 3-4.8%，而未轉基因的萊茵衣藻培養體系中的 氧氣含量在第五天才達到最低，為6. 3-7.2%,比轉Iba基因萊茵衣藻的高50_90%。轉 Iba基因的萊茵衣藻培養體系的產氫量在產氫培養的前4天與未轉基因的萊茵衣藻的產 氫量差不多，但在第5天迅速上升，在第6天達到最大，為178 μ 1，比未轉基因萊茵衣藻在 第8天積累的最高值120μ 1高48%。相應的，轉Iba基因萊茵衣藻的產氫最大速率出現 在第5天，為11. 25 μ 1 · Hig-1Chl · tT1，比未轉基因萊茵衣藻在第的3天的最大產氫速率 3. 47 μ 1 · mg-1Chl · h-1 高 2. 2 倍。Western blot檢測發現(圖5)，轉Iba基因萊茵衣藻中重組Lba的表達量在產氫 培養的第3天開始能被檢測出來，在第5天達到最大，第7天又開始迅速下降到幾乎檢測不 至IJ。此結果表明，轉Iba基因萊茵衣藻的氧氣含量下降快與重組Lba的表達量呈正相關；而 且，轉Iba基因萊茵衣藻的最大產氫速率出現在產氫培養的第5天這個時間與重組Lba的 最大表達量出現的時間一致，說明重組Lba對轉基因萊茵衣藻的耗氧和產氫產生一定的影 響。②在含硫培養基中對耗氧量和產氫量的影響雖然在缺硫培養基中能提高萊茵衣藻的產氫效率，但是缺乏硫元素的同時也抑制 了光合電子效率，最終導致產氫率低。而在培養基中恢復一定量的硫元素，可以部分恢復 PSII的活性，如果控制硫元素的濃度使呼吸作用耗氧速率大於光合放氧速率，仍然可以使 培養體系處於缺氧狀態，但是光合電子效率會增加，理論上可以增加產氫量。本發明的結果表明(圖7，C、D)，在培 養基中含有12. 5 μ M硫酸鹽時，轉Iba基因萊茵衣藻培養體系的氧氣含量下降速度仍然較快，在產氫培養第4天時候下降到最低點，為 3.3%,比未轉基因萊茵衣藻的最低點5. 9%低了 78%，而且維持在3. 3-4. 3%的低氧狀態 達兩天之久，之後才因為培養基中的硫元素恢復了部分PSII活性而使氧氣含量逐漸在第8 天回升到21% ；而未轉基因萊茵衣藻的氧氣含量在最低點後的第二天就迅速回升到21%， 之後的幾天甚至達到24-26%。轉Iba基因萊茵衣藻培養體系的產氫量在第7天達到最大， 為137 μ 1，而未轉基因萊茵衣藻培養體系的最大產氫量僅為98 μ 1。轉Iba基因萊茵衣藻 的最大產氫速率也出現在第5天，為7. 13 μ 1 ^g-1Chl化―1，約為未轉基因萊茵衣藻的2倍。在培養基中含有50-100 μ M硫酸鹽時(圖7，E、F、G、H)，轉Iba基因萊茵衣藻培養 體系的氧氣含量下降速度仍然較快，均能在產氫培養的第3天或第4天下降到最低值3. 7% 或3. 4%，而且均能維持在這樣的低氧水平達兩天之久，然後氧氣含量才在培養的第7天或 第6天逐漸升高到21-23%。而未轉基因萊茵衣藻培養體系的氧氣含量均僅在第3天或 第2天下降到9. 9% -16%，然後就迅速升高到24-26%。轉Iba基因萊茵衣藻培養體系的 最大產氫量維持在138-145 μ 1，而未轉基因萊茵衣藻培養體系的最大產氫量逐漸下降到 66-51 μ L·轉Iba基因萊茵衣藻的最大產氫速率維持在7. 98-7. 07 μ 1 · mg^Chl咄―1，而未 轉基因萊茵衣藻的最大產氫速率下降到3. 47-2. 80μ 1 · Hig-1Chl · h—1。本發明的結果顯示，轉Iba基因萊茵衣藻的產氫量在培養基中恢復微量硫元素的 條件下能穩定在137 μ 1-145 μ 1的水平，而未轉基因萊茵衣藻的產氫量卻從缺硫條件下的 120 μ 1逐漸下降到100 μ M硫酸鹽條件下的51 μ 1。綜上結果表明，在萊茵衣藻葉綠體中表達Iba基因能顯著的加快萊茵衣藻產氫培 養體系的氧氣消耗速度和在培養體系內維持較低的氧氣含量，能明顯提高轉Iba基因萊茵 衣藻的氫氣產量，即使在恢復一定硫酸鹽含量的培養基中仍然能使產氫量維持在較高水平 而不受硫酸鹽含量增加的影響。並且重組Lba在萊茵衣藻中的最大表達量出現時間與其最 大產氫速率出現的時間一致，說明轉Iba基因萊茵衣藻產氫培養體系中耗氧速度的增加、 氧氣含量的降低以及產氫量的增加是與重組Lba的表達聯繫在一起的。如果能提高該轉基 因萊茵衣藻中Lba的表達量，進一步增加產氫培養體系內的耗氧能力，此方法可以用於進 一步提高微型綠藻和藍藻的產氫能力。下面的附件為本發明涉及的大豆Iba基因(基因庫 序列號V00453)的核苷酸序列表。
附件
1，本發明涉及的大豆Iba基因(基 因庫序列號V00453)的核苷酸序列是
1 aagctttggt tttctcactc tccaagccct ctatataaac aaatattgga gtgaagttgt 61 tgcataactt gcatcgaaca attaatagaa ataacagaaa attaaaaaag aaatatggtt 121 gctttcactg agaagcaaga tgctttggtg agtagctcat tcgaagcatt caaggcaaac 181 attcctcaat acagcgttgt gttctacact tcgtaagttt tctctctaag catgtgtctt 241 ccattctatg tttttctttt ggaaatttgt tgtgtttgaa aaaagatata ttgttaatgt 301 gagtggtttt ggtttgatta aaaatgaata ggatactgga gaaagcacct gcagcaaagg 361 acttgttctc atttctagca aatggagtag accccactaa tcctaagctc acgggccatg 421 ctgaaaagct ttttgcattg gtaagtatca gccaactaaa attataacta ttttatgtga 481 ttaattttaa gattaagcat catgtatttt aacactctta aaacatcaat gaacattaat 541 tgtttgaatt gtattttata tttttgccat atcttgaact aggaatagta tataaatttc601 tattagtatt tgttgataat tatttttctt tcataactat cttgtcacat attatatatt 661 ttttgaattg taggtgcgtg actcagctgg tcaacttaaa gcaagtggaa cagtggtggc 721 tgatgccgca cttggttctg ttcatgccca aaaagcagtc actgatcctc agttcgtggt 781 atgataaata atgaaatgtt ataataaatt atgcatactt caatttttca tggagcagta 841 taatgatcaa cacacacttc ttttgtttca tgcatttgat aactacaatc ttaaaatgtt 901 gcaatcttaa aaatagtatt aaaaatataa catttaatta gctcatcaat atttttctgt 961 tgcaattttt tatgaaaaaa ttataattat gaattctttg agcaatgttt aattaaaaaa 1021 ttgatttaat aatgaaataa ctaagctacc tctgtctcgt ttttcattta aactatgaca 1081 taaacaatga ataaagtaaa ctaaaccatg acatgtttat ttttgaatga ggttattaat 1141 aatttttttt cactatctat tgcaatgttc attgattatc aattatcttg gttgcattga 1201 ttctctcgat ttttttcttg aggttaagct tcagttcaat atatattcat tttttgataa 1261 aaaaaaatag tacaatatat tttcatttag ctgatcatat ttatttaagt tcaacttaaa 1321 attttataga tgttaattga tataatttgt tgagatgatg agaagaccaa taccattacg 1381 tactcttttg aaagtgttat atggatttta attataagga aaaatgtaag agctaaacca 1441 ttgctgatga ttttgaaggt ggttaaagaa gcactgctga aaacaataaa ggcagcagtt 1501 ggggacaaat ggagtgacga gttgagccgt gcttgggaag tagcctacga tgaattggca 1561 gcagctatta agaaggcata attagtatct attgcagtaa agtgtaataa ataaatcttg 1621 tttcactata aaacttgtta ctattagaca agggcctgat acaaaatgtt ggttaaaata 1681 atggaattat atagtattgg ataaaaatct taaggttaat attctatatt tgcgtaggtt 1了41 tatgcttgtg aatcattatc ggtatttttt ttcctttctg ataattaatc ggtaaattat 1801 acaaataagt tcaaaatgat ttatatgttt caaaattatt ttaacagcag gtaaaatgtt 1861 atttggtacg aaagctaatt cgtcga
其中表達的外顯子(exon)為核苷酸序列第115bp-212bp、332bp-440bp、674bp-778bp 和 1459bp-1588bp。
2，本發明涉及的大豆Iba基因(基因庫序列號V 00453)的胺基酸序列是 MVAFTEKQDALVSSSFEAFKANIPQYSVVFYTSILEKAPAAKDLFSFLANGVDPTNPKLTGHAEKL FALVRDSAGQLKASGTVVADAALGSVHAQKAVTDPQFVVVKEALLKTIKAAVGDKWSDELSRAWEV AYDELAAAIKKA.
權利要求
大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法，步驟如下(1)萊茵衣藻的培養A、選細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849；B、培養萊茵衣藻藻種(a)液體培養基溫度25±1℃；日光燈光照強度100～200微摩爾光量子/平方米.秒(μmol photons m-2s-1)；50～100ml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(Tris-Acetate-Phosphate簡稱TAP)培養基液體培養，初始pH7.2，水平搖床轉速100～130rpm，每5～6天1％接種繼代培養；(b)固體平板TAP培養基瓊脂粉1.5％；挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每3周繼代一次；C、產氫培養條件在缺硫培養基中進行，把正常的TAP培養基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅；將生長至對數期後期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min，收集藻細胞並用缺硫培養基洗3次，懸浮在缺硫培養基內，分別裝在培養瓶內，培養瓶上方留10ml的空間，用翻口橡皮塞密閉；黑暗條件下培養24小時，然後放在連續光照件下培養，光照強度50～100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons m-2s-1)，溫度25±1℃；每24小時進行氣體成分和含量檢測一次；D、用GC測定氫氣和氧氣含量氣相色譜儀為美國Agilent Technologies公司生產的7890A型號，分子篩51/8(OD)，柱長2m，內徑3mm，熱導檢測器TCD，以氬氣作為載氣。進樣體積0.5ml，柱溫50℃，進樣溫度200℃，熱導檢測溫度300℃；(2)豆血紅蛋白球蛋白亞基1ba基因的克隆A、取大豆成熟的根瘤液氮研磨，提取大豆的總RNA；用DNA水解酶DNase I37℃水浴30min，去除RNA中混雜的DNA；加入25mM乙二胺四乙酸，65℃水浴10min，終止DNA水解酶的活性；37℃水浴60min合成單鏈cDNA；B、用DNA聚合酶(ExTag)進行聚合酶鏈式反應(PCR)克隆大豆1ba基因，反應條件94℃預變性5min，一個循環；94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min；共30個循環；72℃延伸10min，反應產物純化回收；C、測序鑑定1ba基因的特異性引物Lba-P15』-c gag ctcaaa ttt aaa ttt atg gtt gct ttc act gag-3』，斜體表示限制性內切酶SmalI的酶切位點序列，方框中的序列是加入的增強翻譯能力的核糖體結合位點RBS序列；Lba-P25』-tcc ccc ggg ata cta att atg cct tct taa tag c-3』，斜體表示限制性內切酶SacI酶切位點序列；(3)萊茵衣藻葉綠體表達載體的構建用限制性內切酶SmalI和SacI來酶切克隆得到的大豆1ba基因片段和葉綠體表達載體cg40；將1ba基因片段用T4 DNA連接酶連接在質粒cg40中的壯觀黴素抗性基因aadA之後形成aadA-1ba融合基因，得到衣藻葉綠體表達載體cg401-1-1ba，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，經限制性內切酶SmalI和SacI雙酶切鑑定，得到442bp的1ba片段和5900bp的質粒片段；(4)萊茵衣藻葉綠體的轉化A、取100ml對數期中後期的萊茵衣藻，25℃下3000rpm離心5min收集藻細胞，用新鮮TAP洗三次，塗於新鮮TAP固體平板上；光照100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons·m-2·s-1)和25±1℃條件下培養24小時；用基因搶轟擊轉化；真空度9.48192×104Pa，轟擊距離9cm，氦氣壓力7.584236×106Pa，金粉子彈經限制性內切酶EcoRI酶切質粒cg401-1-1ba DNA包裹，金粉子彈顆粒直徑1.0微米；B、轉化後的衣藻在光照和25±1℃條件下，過渡培養18h，用TAP液體培養基衝洗，塗布於含壯觀黴素100μg/ml的TAP固體選擇培養基上，在25±1℃和100微摩爾光量子/平方米·秒(μmol photons·m-2·s-1)的連續光照條件下，培養約7～15天；取有抗性的單藻落分別在選擇培養基上多次繼代培養；分別進行產氫培養，並檢測產氫量和耗氧量；(5)轉基因萊茵衣藻中1ba基因的整合及其表達A、1ba基因整合到萊茵衣藻葉綠體DNA的檢測取對數生長後期衣藻培養液，4℃低速離心收集，加入350μlNET的0.1mol/L氯化鈉，50mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.020mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸重懸沉澱，加入25μl10mg/ml的蛋白酶K及25μl 20％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混合均勻，37℃水浴12小時，冷卻；加入200μl 5mol/L醋酸鉀(KAc)，冰上靜置、離心，上清液中加入等體積的25∶24∶1酚/氯仿/異戊醇抽提2次；再用等體積的氯仿抽提1次；總DNA用無水乙醇沉澱和70％乙醇洗滌，乾燥後溶於30μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA，簡稱TE)緩衝液；B、轉基因萊茵衣藻中1ba基因轉錄的檢測取對數生長期中期的萊茵衣藻，室溫3000rpm離心5分鐘收集藻細胞；提取萊茵衣藻的總RNA和合成cDNA；利用上述1ba基因的特異性引物和上述克隆1ba基因所述的PCR條件進行擴增，進行1ba基因轉錄水平的檢測，得到442bp的擴增條帶；C、轉基因萊茵衣藻中Lba表達量的檢測取產氫培養的萊茵衣藻培養液，室溫3000rpm快速離心5min收集藻細胞，用250μl蛋白提取緩衝液懸浮，加入2μlβ-巰基乙醇，液氮凍融三次；在4℃條件下，14000g離心20min，取100μg的蛋白上清液加上0.25摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸配製的緩衝液(Tris-HCl)，pH 8.0；25％甘油；7.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)；0.25mg/ml溴酚蘭(bromophenolblue)；12.5％(v/v)β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)於10％的分離膠和5％的濃縮膠進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，抗大豆Lba多克隆抗體進性免疫雜交檢測，對辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)標記的抗體進行化學發光檢測；(6)分析重組豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻生長的影響A、用TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計檢測萊茵衣藻在750nm處的吸光度；B、取藻液3000rpm離心5min收集藻細胞，加入同體積的95％乙醇溶液，混合均勻，室溫避光放置20min，4℃下12000rpm離心10min；取上清，測定OD665及D649的吸光值；C、計算葉綠素a，葉綠素b及總葉綠素的含量，單位mg/L葉綠素Chl(mg/l)＝20.04(OD649)+6.10(0D665)；(7)分析豆血紅蛋白球蛋白亞基Lba對萊茵衣藻產氫培養的耗氧量和產氫量的影響A、缺硫培養基中耗氧量和產氫量的檢測B、含硫培養基中對耗氧量和產氫量的檢測。FSA00000033042500011.tif
全文摘要
本發明屬於生物制氫技術，一種大豆血紅蛋白基因提高萊茵衣藻生物制氫產量的方法。現有萊茵衣藻制氫的缺點是萊茵衣藻氫酶對氧氣敏感，容易受氧氣的抑制而失去活性；限制了衣藻的產氫效果。本發明公開了一個豆血紅蛋白球蛋白亞基基因在萊茵衣藻產氫中的應用，將豆血紅蛋白球蛋白亞基基因lba構建在萊茵衣藻葉綠體表達載體中，並將該表達載體轉入萊茵衣藻葉綠體中，使lba基因在萊茵衣藻葉綠體中表達。轉化的萊茵衣藻的密閉培養體系中氧氣含量下降明顯比未轉基因萊茵衣藻快，並且氧氣含量能維持較低水平，產氫量明顯增加；本發明方法適用於所有產氫的微藻。
文檔編號C12R1/89GK101845461SQ20101010792
公開日2010年9月29日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者吳雙秀, 王全喜, 王榮榮, 許麗麗, 閻光宇, 黃瑞 申請人:上海師範大學