高賴氨酸玉米Opaque7基因的分子標記及其應用的製作方法
2023-06-10 17:38:16
專利名稱：高賴氨酸玉米Opaque7基因的分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高賴氨酸玉米0paque7基因的分子標記及其應用。
背景技術：
玉米(Zea mays L.)是世界上也是我國主要的糧食和飼料作物，從1995年開始， 我國玉米的總產量已經超過小麥，成為僅次於水稻的第二大糧食作物。據FAO統計，從1998 年開始，玉米的總產量已超過小麥和水稻成為全球第一大糧食作物。作為食品、飼料和燃料的重要來源，玉米的全球需求和消耗正在急劇增加。預計到2017年，全球玉米和小麥的年產量需要再增加2億噸才能滿足全世界的需求。為應對世界糧食危機，保證我國的糧食安全，國務院提出了到2020年再增產糧食1000億斤的戰略目標，其中需要新增玉米400億斤。隨著我國以及世界上一些其它新興國家飲食結構的調整，對動物產品的需求大幅度增加。作為「飼料之王」的玉米對畜牧業和養殖業的發展具有舉足輕重的作用，這就對玉米的營養成份的改良提出了更高的要求。玉米籽粒主要成份為澱粉、蛋白質和油脂，其中對營養成份起決定作用的是蛋白質。玉米籽粒的蛋白含量主要是由玉米的儲藏蛋白控制的，玉米最主要的儲藏蛋白是醇溶蛋白，約佔蛋白總量的60%左右，它是一類在種子發育過程中特異表達的蛋白，主要起貯存自由胺基酸的作用。醇溶蛋白又可以進一步分為四類，分別是a、P、Y和S醇溶蛋白。 其中最大的一類是a醇溶蛋白，a醇溶蛋白基因家族根據所編碼蛋白的分子大小，又分為 22-kDa醇溶蛋白和19-kDa醇溶蛋白兩個部分。a醇溶蛋白約佔醇溶蛋白的80%以上，是決定種子蛋白含量重要因素。雖然醇溶蛋白富含脯氨酸和穀氨酸，但缺乏必需胺基酸尤其是色氨酸和賴氨酸，這些含量豐富的醇溶蛋白包含的胺基酸成分十分不均衡，造成以玉米為食物來源的人類和動物的營養缺乏。人類必需的8種胺基酸中，以賴氨酸影響最大，但在普通玉米中缺乏也最多。高賴氨酸玉米與普通玉米最本質的區別是胚乳中各種蛋白質組成及蛋白質胺基酸組成的差異。高賴氨酸玉米營養價值提高的原因是其醇溶蛋白含量由普通玉米的55. 1%下降至22. 9% ;而谷蛋白、白蛋白、球蛋白含量提高，其中谷蛋白由普通玉米的31. 8%上升至50. 1%。由此表明，玉米種子中儲藏蛋白的相對表達量顯著地影響著玉米作為動物飼料的營養價值，因此對蛋白質含量以及成分的改變是改造玉米籽粒的關鍵途徑。玉米在品質性狀的改造上有賴於一些籽粒的突變體。在玉米中有一類與蛋白品質相關的突變體，被稱為高賴氨酸突變體。這類突變體一般具有不透明或粉質的籽粒，在玉米遺傳上被稱為Opaque或Floury突變體。這類突變體能夠顯著改善玉米籽粒中賴氨酸等必需胺基酸的含量，從而顯著提高玉米在蛋白水平的營養品質。其中最為有名的是0paqUe2 突變體(似)，似已經被廣泛應用在高賴氨酸玉米的育種實踐中。o7是另一種能顯著提高玉米籽粒賴氨酸含量的重要突變，已有研究表明，在蛋白水平上，突變體與其相應的野生型相比，胚乳中總蛋白的含量較野生型相比降低了 20.7%，醇溶蛋白和非醇溶蛋白分別降低了 33. 4%和15. 1% ;與醇溶蛋白的降低相對應，在胺基酸水平上，o7突變體與其相應的野生型相比，賴氨酸(Iys)含量升高了 38.2%。如能將07突變體引入生產品種，則能進一步提高籽粒的賴氨酸(Iys)含量，培育出高賴氨酸(Iys)含量的優質蛋白玉米新品種。因此，07突變體可以改善玉米籽粒的蛋白品質，對培育品質更高的玉米有很好的應用價值。07基因雖然已經被克隆，但是07基因至今尚未通過雜交育種被很好地利用，主要是因為07由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長的時間。DNA分子標記輔助育種是一項新的育種技術，該技術是通過利用與目標性狀基因緊密連鎖的DNA分子標記對控制目標性狀的基因進行間接選擇的現代育種技術。該技術對目標基因的轉移，不僅可在早期進行準確、穩定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因識別難的問題，從而加速育種進程，提聞育種效率。與常規育種相比，該技術可提聞育種效率2-3倍。DNA分子標記輔助育種技術的關鍵是(I)獲得的分子標記應該是能夠區分育種過程中雜交親本(純合07類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性標記；(2)獲得的共顯性分子標記與控制目標性狀基因的連鎖情況，連鎖越緊密在其後代中錯選的概率越低，如果該標記來源於控制目標性狀基因，則利用該分子標記在其後代中錯選的概率為零；(3)該標記可以區分突變體與國內所有主要育種親本。以往研究中並沒有獲得位於07基因上並且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標記，故無法對該基因所控制的目標性狀進行DNA分子標記輔助選擇，同時，以往也為獲得能夠區分突變體與國內所有主要育種親本的分析標記。所以，對於該種標記的獲得和鑑定是對控制玉米籽粒高賴氨酸含量農藝性狀的07基因進行DNA分子標記輔助育種的基礎。
發明內容
本發明的目的之一在於提供高賴氨酸玉米0paque7基因的分子標記。本發明的目的之二在於提供該分子標記的用途。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案
一種高賴氨酸玉米0paqUe7基因的分子標記，其特徵在於該分子標記是通過PCR擴增特異性引物，得到的一種共顯性分子標記6837D，所述的特異性引物的鹼基序列為
正向引物從5'端至3'端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT ;
反向引物從5'端至3'端為GCGTCCACCTCGATCGGGG。一種上述的高賴氨酸玉米0paqUe7基因的分子標記在檢測和區分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應用。本發明利用高賴氨酸玉米(07/07)與其他具優良性狀的玉米雜交獲得Fl代，Fl代自交後篩選具有目的性狀的高賴氨酸玉米F2，F2代多次自交，最終獲得穩定的純合體。本發明提供I個位於07基因上並且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標記，以及利用這個共顯性DNA分子標記對07基因進行分子標記輔助選擇的方法。利用這個分子標記能對玉米任何時期和任何組織的DNA進行基因型鑑定，檢測雜交育種子代各單株中基因的存在與否以及雜合或純合狀態。利用這個分子標記能區分突變體與國內539種主要育種親本，能夠在任何育種背景群體中準確檢測到o7基因的存在。這種檢測方法的準確性高， 操作簡單，為利用基因的DNA分子標記輔助育種提供重要的技術手段。
圖I o7/o7和野生型籽粒中醇溶蛋白、非醇溶蛋白和總蛋白的含量變化圖2 o7/o7和野生型籽粒中總的賴氨酸含量變化圖3為玉米籽粒純合突變體外形圖(o7/o7)；
圖4是玉米籽粒野生型(+/+)
圖5是用於進行07基因克隆的BC群體構建路線；
圖6標記6837D在BC群體中的分離情況，其中1、2和4為o7/o7純合體；3、5、6和7 為07/+雜合體；H20為負對照，o7/o7為純和突變體，+/+為純和野生型；
圖I是本發明中分子標記在玉米十號染色體長臂上的示意位置，其中CENlO代表第十號染色體著絲粒，TEL代表端粒；
圖8是標記6837D在539種國內不同育種自交系間的多態情況；_為H20是負對照、+ 為+/+是野生型對照，CK為o7/o7是突變體對照。
具體實施例方式下面結合具體實施事例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編』 Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件,或按照製造廠商所建議的條件。
實施例一利用突變體(o7/o7)培育高賴氨酸玉米
由於o7突變體與其相應的野生型相比，胚乳中總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量分別降低了 20. 7%、33.4%和15. 1%，參見圖1，賴氨酸(Iys)含量升高了 38. 2%，參見圖2，因此利用該基因與其他優良品種的雜交可以培育出高賴氨酸玉米。把突變純合體 (o7/o7)與其他具有優良生產性狀的玉米雜交，然後Fl代自交，在F2代中分離出高賴氨酸玉米籽粒的隱性純合體。該隱性純合體經多代自交，輪迴選擇，逐代選擇籽粒發育好，賴氨酸含量高的種子，最終獲得穩定的隱性純合體，高賴氨酸自交系或群體，即獲得高賴氨酸商品玉米。實施例二共顯性分子標記的獲得及與07基因連鎖關係的確定
圖3和圖4為玉米籽粒野生型(+/+)與玉米籽粒純合突變體(07/07)外形圖。通過純合突變體(07/07)與純合野生型(+/+)雜交獲得Fl (07/+)，然後以Fl為母本，純合突變體為父本進行回交構建回交(BC)群體，參見圖5。BC群體中出現了基因型分離，包含07/+與 07/07兩種基因型，參見圖6，具有07/+基因型的與+/+基因型的籽粒均為非Opaque的野生型類型籽粒，具有07/07基因型的籽粒為Opaque的突變體類型。本發明通過經典的遺傳定位獲知07基因定位在玉米第10號染色體的長臂上 (BinlO. 07)。通過在07位點附近為純合突變體和純合野生型的植株構建的回交群體(BC)， 提取純合突變體、野生型以及BC群體各單株的基因組DNA，利用圖位克隆的方法克隆了該基因，獲得了該基因的DNA序列。經過序列分析表明，該基因在基因組上與野生型相比缺失了 12個鹼基。轉基因功能互補表明，該基因即為07基因。本研究依據突變基因o7與野生型基因07的差別序列設計特異性引物，通過擴增特異性引物，共顯性分子標記6837D。所述的特異性引物為
正向引物從5'端至3'端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT ;
反向引物從5'端至3'端為GCGTCCACCTCGATCGGGG ;
所得到共顯性分子標記6837D能夠區分育種過程中雜交親本(純合類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的。由於該標記位於07基因上，故該分子標記與該基因完全連鎖，參見圖7。使用這個分子標記進行輔助選擇準確度很高，在任何背景下，標記6837D與07基因的交換率為0，使用這個標記確定07基因的錯選率為O。實施例三分子標記在不同親本間的多態性鑑定
提取o7/o7突變體純和，野生型純和和B73、Mol7、W22、W64A、BSSS53等539種育種中廣泛使用的自交系的基因組DNA，通過PCR反應分析在不同品種間的多態性。結果表明，使用本發明中的分子標記6837D對o7與B73、Mol7、W22、W64A、BSSS53等539中育種親本DNA 進行PCR擴增和凝膠電泳分析表明，6837D在o7與B73、Mol7、W22、W64A、BSSS53等539中育種親本都具有多態性，參見圖8。此結果證明，分子標記6837D能夠在任何育種背景群體中準確檢測到o7基因的存在，可用於與這些育種材料培育高賴氨酸玉米時o7基因的輔助選擇且錯選率為O。
序列表
上海大學
〈120〉高賴氨酸玉米基因0paque7的分子標記及其應用
〈160〉 2
〈210〉 I
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
CCACG GAAGC CCGGG TCAGT20
〈210〉 2 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 2
GCGTC CACCT CGATC GGGG19
權利要求
1.一種高賴氨酸玉米0paque7基因的分子標記,其特徵在於該分子標記是通過PCR擴增特異性引物，得到的一種共顯性分子標記6837D，所述的特異性引物的鹼基序列為正向引物從5'端至3'端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT ;反向引物從5'端至3'端為GCGTCCACCTCGATCGGGG。
2.一種根據權利要求I所述的高賴氨酸玉米0paqUe7基因的分子標記在檢測和區分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種高賴氨酸玉米Opaque7基因的分子標記及其應用。該分子標記是通過PCR擴增特異性引物，得到的一種共顯性分子標記6837D，所述的特異性引物的鹼基序列為正向引物從5′端至3′端為CCACGGAAGCCCGGGTCAGT；反向引物從5′端至3′端為GCGTCCACCTCGATCGGGG。利用這個與o7基因完全連鎖的分子標記能對玉米任何時期和任何組織的DNA進行基因型鑑定，檢測雜交育種子代各單株中o7基因的存在與否以及雜合或純合狀態。同時，利用這個分子標記能區分突變體與539種國內主要育種親本，能夠在任何育種背景群體中準確檢測到o7基因的存在，且錯選率為0。這種檢測方法的準確性高，操作簡單，為利用o7基因的DNA分子標記輔助育種提供重要的技術手段。
文檔編號C12N15/11GK102586241SQ20121005118
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者孫鑫, 宋任濤, 樊向瑜, 王剛, 王樹, 王桂鳳, 王飛, 詹紅蕊, 許政暟 申請人:上海大學