三磷酸腺苷－敏感性鉀通道基因缺陷型動物的製作方法
2023-06-11 02:37:41
專利名稱：三磷酸腺苷－敏感性鉀通道基因缺陷型動物的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因缺陷型(剔除(knockout))動物，具體地涉及基因缺陷型小鼠，而且首先涉及三磷酸腺苷(ATP)敏感性鉀通道基因缺陷型小鼠。
胰島素是由胰腺β-細胞所分泌的，它是一種降低血中葡萄糖水平的激素，而葡萄糖是胰島素分泌的重要生理刺激物之一。在過去的二十多年內，已經對葡萄糖誘導的胰島素分泌機制進行了充分研究，其中主要是以葡萄糖代謝假設為基礎(Malaisse WJ.等人，代謝(Metabolism),28:373-386(1979))。這個假設已經引起了廣泛的注意，它強調了在胰腺β-細胞中葡萄糖代謝產物作為胰島素分泌信號的可能性。在各種不同的代謝產物中，ATP被認為是最重要的分子之一，它所起的作用是作為代謝能量載體，作為胰腺β-細胞分泌胰島素的胞內信號(Ashcroft,SJH，生物化學雜誌(Biochem.J.),132:223-231(1973))。
胰腺β-細胞是電生理可興奮細胞，而且已知β-細胞的膜電位是胰島素釋放中刺激-分泌偶聯過程中的關鍵因素(Henquin JC.,實驗(Experimentia),40:1043-1052(1984))。還已知，葡萄糖通過控制膜對鉀離子的通透性來調控β-細胞膜電位(Sehlin,J.，糖尿病(Diabetes)32:320-323(1983))。
之後，1984年，在Cook等人發現了ATP-敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassium channel，簡稱為KATP)之後，先發現了一種使葡萄糖代謝與膜的鉀通透性關聯的分子(Cook,DL等人，自然(Nature),311:271-273(1984))。KATP通道最初是在心肌中發現的，它的特徵是當胞內ATP濃度增加時，該通道被抑制(Noma,A.，自然(Nature)305:147-148(1983))。隨後，在各種組織和細胞中發現了KATP通道，其中包括腦、垂體腺和骨骼肌(Ashcroft,FM，神經科學年報(Annu.Rev.Neurosci.),11:97-118(1988))。
根據胰腺β-細胞的胰島素分泌機制，由葡萄糖代謝所產生的ATP會導致KATP通道的關閉，這又導致β-細胞膜的去極化，這之後是電壓依賴型鈣通道開啟，從而允許Ca2+流入β-細胞。這樣所造成的胞內Ca2+濃度上升，就觸發了依賴Ca2+的胰島素分泌(Wollheim,CB等人，生理學綜述(Physiol.Rev.),61:914-973(1981))。因此，將細胞的代謝狀態與細胞膜電位相關聯的β-細胞KATP通道，是關鍵性的分子，因而認為它們的作用是胞內的ATP-和ADP-傳感器，從而調控膜的興奮性。
磺醯脲(Su劑)是一種促進胰島素分泌的口服降血糖藥，它是在治療非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)中廣泛使用的治療劑，已表明磺醯脲可抑制β細胞KATP通道的活性(Sturges,NC等人，柳葉刀(Lancet),8453:474-475(1985),De Weille,J.，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:1312-1316(1988))。對KATP通道的電生理學研究已表明，它們的動力學和藥理學特性在不同組織中是不同的，這暗示KATP在組織中有結構和功能上的差異(Terzic,A等人，Am.I.Physiol.,269:C525-C545(1995))。因為在胰腺β-細胞和分泌胰島素的細胞系中KATP通道具有內向式整流(inward rectification)的特性，因此，它們在結構上可能與構成內向式整流K+通道家族的其他通道有關。內向式整流K+通道與電壓門控型K通道(Kv)的區別在於前者並不被膜的去極化所激活而且它們允許K+的流入大於流出。
在了解內向式整流K+通道的結構和功能的過程中，由於表達克隆了編碼3種截然不同的內向式整流K+通道的cDNA而獲得了突破這3種K+通道是來自大鼠腎臟的ROMK1(Kir1.1)(Ho,K.等人，自然(Nature),362:31-38(1993))、來自小鼠巨噬細胞系的IRK1(Kir2.1)(Kubo,Y等人，自然(Nature),362:127-133(1993))和來自大鼠心臟的KGA(Kir3.1)(Dascal,N等人，美國科學院院報(Proe.Natl.Acad.Sci.USA),90:10235-10239(1993))。這些研究確立了新的Kir家族基因，它們編碼結構和功能特徵不同於Kv超家族的蛋白質。現在，根據Chandy和Gutman的命名，Kir亞家族被命名為Kir1.0-7.0(Chandy,KG.,Gutman,GA.，藥理科學趨勢(Trends Pharmacol.Sci.),14:434(1993)；Krapivinsky,G.等人，神經元(Neuron),20,995-1005(1998))。
將GIRK1 cDNA作為探針，已從各種組織中分離出Kir家族的一個新成員，uKATP-1(Kir6.1)(Inagaki,N.，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),270:5691-5694(1995))。而且，通過將Kir6.1 cDNA用作探針對人基因組文庫進行篩選，還分離出一個新的Kir基因，人Kir6.2(也稱為「BIR」)。此外，通過在標準雜交條件下篩選小鼠胰島素分泌細胞系MIN6 cDNA文庫的7×105空斑，還獲得了小鼠Kir6.2(mBIR)基因，人和小鼠的該基因的DNA序列已經公開(日本未審查的專利出版物77796/97)。小鼠Kir6.2基因的DNA序列示於序列表(SEQ ID NO:1)中。
Kir6.2由390個胺基酸殘基構成，在人Kir6.2和小鼠Kir6.2之間有96％相同性。此外，Aguilar-Bryan等人在克隆Kir6.2(BIR)的過程中發現了磺醯脲受體(SUR)(Aguilar-Bryan,L.等人，科學(Science),268:423-426(1995))。現在已知道胰腺β-細胞KATP通道含有至少兩個亞基，即Kir6.2(BIR)和磺醯脲受體(SUR)，而且發生於KATP通道基因的突變被認為是非胰島素依賴性糖尿病的主要致病因素之一。對於內向整流型鉀通道的多樣性和功能，可參見Horio,Y.,Seikagaku,70(2),p.73-83(1998)，和Seino,S.等人，糖尿病綜述(Diabetes Reviews),4(2),177-190(1996)。
現在，糖尿病是一種全國性疾病，在日本和美國，包括潛在病人在內的病人數目已經到達了數百萬，據估計，5-10％中年人或更高年齡的人是糖尿病患者。糖尿病被分為Ⅰ型即胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和Ⅱ型即非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)，而且非胰島素依賴性的Ⅱ型糖尿病佔糖尿病患者的90％以上。如上所述，非胰島素依賴性糖尿病和ATP-敏感性鉀通道之間的關係正逐漸地被闡明。然而，NIDDM的新治療劑的開發卻受到了障礙，因為無法獲得所必需的實驗動物，因而無法研究ATP-敏感性鉀通道的生物作用以及在此基礎上開發非胰島素依賴性糖尿病的改良治療劑。
另一方面，產生特定基因發生突變的模型動物，是研究導致多種病理狀態的基因功能並且開發診斷藥物或治療藥物或治療方法的重要手段。最近分子生物學的進展已經建立了通過在小鼠胚胎幹細胞(ES細胞)中採用基因導向，將缺失或突變引入小鼠染色體上所需基因的技術，從而能夠產生剔除小鼠，即某個特定基因被破壞的小鼠(Capecchi,M.R.，科學(Science),244:1288-1292(1989))。
胰腺β-細胞中的KATP通道包括亞基，即磺醯脲受體(SUR1)和Kir6.2(Inagaki,N.等人科學(Science)270:1166-1170(1995)；Sakura,H.等人，FEBS Lett.,377:338-344(1995))，而骨骼肌或心肌中的KATP通道包括SUR2A和Kir6.2(Inagaki,N.等人，神經元(Neuron),16:1011-1107(1996))。因為Kir6.2被認為起著形成KATP通道的K+選擇性孔洞的作用，因此，我們假設通過破壞Kir6.2基因可以產生缺乏KATP通道的小鼠。基於這種假設，本發明的目的是產生一種基因缺陷型(剔除)動物，特別是基因剔除的小鼠，其中缺失了Kir6.2基因，即KATP通道的亞基之一的基因。這些動物是闡明KATP通道(胰腺β-細胞分泌胰島素中的關鍵分子)的功能和生理作用，以及開發非胰島素依賴性糖尿病的治療劑所必需的。
因此，本發明提供一種Kir6.2基因缺陷的、純合的、非人的哺乳動物，其中ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因從兩個等位基因座上被缺失掉。較佳地，非人哺乳動物是小鼠。
此外，本發明還提供Kir6.2基因缺失的、雜合的、非人的哺乳動物，其中ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因僅從兩個等位基因座中的一個基因座上被缺失掉。較佳地，非人哺乳動物是小鼠。
此外，本發明還提供了這些非人哺乳動物的組織。術語「組織」包括胰腺組織、心肌組織、骨骼肌組織、腦組織、血管內皮組織和其他組織。
另外，本發明還提供了這些非人哺乳動物的細胞。術語「細胞」包括郎格罕氏β-細胞(Langerhans′β-cell)、骨骼肌細胞、心肌細胞、垂體腺細胞、血管內皮細胞和其他細胞。
通過提供這些缺乏與非胰島素依賴性糖尿病(NDDM)發作直接有關的特定ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因的動物、組織和細胞，本發明將有助於研究NDDM的病因機制並加速NDDM改良治療劑的開發。
純合的Kir6.2基因缺陷型非人ES細胞系還可方便地用常規方法(例如，J.D.Watson等人，「重組DNA」(Recombinant DNA)，第2版，14章，W.H.Freeman andCompany(1992))，通過使用雄性和雌性的Kir6.2基因缺陷型純合非人哺乳動物而建立，其中該動物在兩個等位基因座上都缺失了ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因。
還提供了一種產生純合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物的方法，其中在兩個等位基因座上都缺失了ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因，該方法包括步驟如下用cDNA探針，從該非人動物基因組文庫中分離出含Kir6.2基因的克隆，通過在該Kir6.2基因中插入可供選擇的標記基因，破壞該分離出的克隆的DNA序列中的Kir6.2基因，構建導向載體，該載體含有包含該被破壞的Kir6.2基因的DNA序列，將該導向載體引入培養的ES細胞中，從而發生同源重組，分離和鑑定已發生同源重組的克隆，從懷孕動物獲得胚泡，並將分離和鑑定的克隆的細胞注入該胚泡，將該胚泡移植入代理母親動物的子宮內，獲得嵌合動物，將該嵌合動物與野生型動物雜交獲得F1動物，將該F1動物相互雜交，獲得F2動物，和選擇純合的Kir6.2基因缺陷型動物。
圖1顯示了小鼠Kir6.2基因、所用的導向載體和同源重組偶聯物的示意圖。
圖2顯示了第二代的Southern印跡分析的結果。
圖3顯示了用Kir6.2+/+和Kir6.2-/-小鼠的胰腺、心臟和腦進行RT-PCR分析的結果。
圖4為顯示了胰腺β-細胞中整個細胞膜電流的圖。
圖5為顯示胰腺β-細胞的KATP通道導電性的圖。
圖6為顯示胰腺β-細胞的靜息膜電位和胞內Ca2+基礎濃度的圖。
圖7顯示了促分泌劑對胰腺β-細胞中胞內Ca2+濃度的作用。
圖8為顯示批量孵育的胰島的胰島素分泌情況的圖。
圖9顯示了在灌流的胰島中，對葡萄糖和甲基磺丁脲的胰島素分泌反應的時間過程。
圖10顯示了對於血糖水平的葡萄糖負荷和對於血清胰島素濃度的反應情況。
圖11為顯示胰島素負荷實驗結果的圖。
培養小鼠ES細胞並維持其全能性的技術，以及在培養的細胞中實現同源重組的載體系統的發展(Thomas,K.T.和Capecchi,M.R.，細胞(Cell),44:419-428(1986))，使得對Kir6.2基因進行基因導向成為可能。即通過從小鼠基因組文庫中用DNA探針分離Kir6.2基因，在其中插入可選擇標記基因從而摧毀該基因，將整合有該被破壞基因的載體引入培養的ES細胞從而讓同源重組發生，分離和鑑別發生同源重組的克隆，將該克隆注入胚泡中，從而獲得嵌合小鼠。因為受注入的ES細胞保留了分化成胚芽細胞的能力，因而突變ES細胞的遺傳信息會以一定的概率傳遞給其子代，因此通過F1動物之間的雜交，可產生Kir6.2基因缺陷的純合小鼠(Kir6.2-/-)，其中在兩個等位基因座上都缺失了Kir6.2基因。確定小鼠是否是Kir6.2-/-，可通過從小鼠尾部抽提基因組DNA，用EcoRⅠ和BglⅡ消化，然後用約0.6kb的Kir6.2基因片段進行Southern印跡分析，該片段位於Kir6.2基因中XhoⅠ位點下遊約4kb處而且在導向載體中並不包括該片段。一旦獲得Kir6.2-/-小鼠，那麼可以通過它們之間的雜交而維持具有該特徵的小鼠。此外，通過將Kir6.2-/-小鼠與正常Kir6.2+/+小鼠雜交，可以輕易地獲得雜合的Kir6.2缺陷型小鼠(Kir6.2+/-)，其中在兩個等位基因座中僅一個基因座缺失Kir6.2基因。同樣方法也適用於其他動物品種。
下面結合實施例進一步詳細地闡述本發明。然而，應理解，本發明並不局限於實施例。
實施例Kir6.2基因導向
現參見圖1，所給的圖中顯示了包含小鼠Kir6.2基因(SEQ ID NO:1)的基因組DNA的一部分、所用的導向載體和導向的等位基因(即同源重組偶聯體)。在圖中，外顯子用虛線框表示。已知Kir6.2基因不含內含子。Neo和TK分別為新黴素抗性基因和胸苷激酶基因。「探針」表示Southern印跡分析中的探針位置，而箭頭表示RT-PCR的引物。如圖所示，利用Kir6.2基因中的限制性酶XhoⅠ位點，在導向載體中插入新黴素抗性基因「Neo」，它是陽性選擇標記。在同源區域外，插入一個限制性酶XhoⅠ位點。製備基因導向載體的程序如下。
藉助cDNA探針，從129/Sv小鼠基因組文庫λFIⅫ(Stratagen)中分離出KATP通道Kir6.2基因。所用的探針是約1.2kb的DNA片段，它是用SmaⅠ和PmaCⅠ從我們已克隆的含有小鼠Kir6.2的cDNA質粒(科學(Science),17:1166-1170,(1995))中切下的。此DNA片段包括從Kir6.2的5′UT處的SmaⅠ位點至3′UT處的PmacⅠ位點之間的序列。用放射性同位素32P，通過缺口翻譯法來標記探針，然後用其在高度嚴謹條件下來篩選基因組DNA文庫，從而分離到9個陽性克隆。因為發現兩個克隆與其餘克隆中的克隆是相同的，因此對7個陽性克隆製作了限制性圖譜。用SacⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、SphⅠ、EcoRⅠ、ScaⅠ、XbaⅠ、NheⅠ、DraⅠ、XhoⅠ、SmaⅠ、和NotⅠ，製作了此限制性圖譜。
Kir6.2基因導向載體是如下製備的從Kir6.2基因胺基酸編碼區域中的XhoⅠ位點算起，將位於5′方向8.0kb處位點和3′方向3.8kb處位點之間的部分選為導向載體的同源區域。將新黴素抗性基因「neo」(陽性選擇標記)插入XhoⅠ位點，在同源區域的3′-端下遊插入單純皰疹病毒胸苷激酶基因作為陰性選擇標記。用pBluescriptⅡKS+(Stratagene)來製備導向載體。因為它在此同源區域5′-端上遊有NotⅠ位點，因此可以用NotⅠ消化來使其線性化。
製備ES細胞(胚胎幹細胞)
對於ES細胞，使用已從129/01a建立的E14細胞系，它由Kumamoto大學的S.Aizawa教授饋贈。ES細胞儲藏在液氮中，而且在使用前，在含LIF、NEAA和丙酮酸的15％FCS-DMEM中培養。
製備飼養細胞
用表達neo(新黴素抗性基因)的轉基因小鼠來製備飼養細胞。將14.5天齡的新黴素抗性基因的轉基因小鼠胚胎，去除其胚外組織和臟器，然後切碎，在37℃,0.1％胰蛋白酶溶液(用5.9mM EDTA-PBS對GIBCO-BRL2.5％胰蛋白酶進行25倍稀釋而製得)中振搖50分鐘而分散。細胞懸浮在10％FCS-DMEM高葡萄糖培養基中，離心一次，然後在10釐米培養皿中於10％FCS-DMEM高葡萄糖培養基中培養，以得到第一代培養物。在使用前一天，將飼養細胞在含10微克/毫升絲裂黴素的10％FCS-DMEM高葡萄糖培養基中培養2小時，並亞培養，然後在次日用作飼養細胞。
將基因摻入ES細胞
將基因摻ES細胞，是採用電穿孔法，用Gene pulserⅡ(BioRad)進行。用NotⅠ消化120微克的導向載體，用苯酚/氯仿處理一次，再用氯仿處理一次，用乙醇沉澱，然後用PBS調至300微克/毫升。在電穿孔之前，將ES細胞刮下並懸浮於PBS中，濃度為1.43×107細胞/毫升。準備4個樣品池(cuvette)，每個含有0.7毫升該ES細胞懸浮液(107細胞/樣品池)和0.1毫升導向載體DNA(總計4×107細胞)，移液，在冰上放置10分鐘，然後在210V,500μF下進行脈衝(打孔)。
挑選集落
在電穿孔之後，將一個樣品池中的細胞轉移至Falcon 2058管中，加入1毫升培養液而懸浮。再加入38毫升培養液使細胞分散，然後將其接種於4個已經接種有飼養細胞的10毫米培養皿中，每個皿中10毫升。在電穿孔後36小時，用250微克/毫升G418(新黴素，慶大黴素Gibco BRL)進行選擇，48小時後用250微克/毫升G418和0.2nM FIAU(1-[2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶)(1-[2-deoxy-2-fluoro-β-arabinofranosyl]-5-iodouracyl)進行選擇。
集落的收穫
在電穿孔後第8天收穫各集落。將各個集落吸入含有10微升0.25％胰蛋白酶EDTA的96孔培養皿中，37℃孵育6分鐘。加入50微升PBS，細胞通過吸管吹吸而分散，然後接種於2個已接種飼養細胞的96孔培養皿，每孔接種30微升。一個培養皿被冰凍保藏以便進行胚泡注射，而另一個培養皿被培養以抽提基因組DNA進行篩選。
鑑別發生了同源重組的克隆
從收穫的抗新黴素ES細胞中，通過以下步驟收集DNA苯酚/氯仿抽提、氯仿抽提、乙醇沉澱、然後用70％乙醇洗滌。那些實現了同源重組的克隆是這樣選擇的用EcoRⅠ和BglⅡ消化10微克如上收集的基因組DNA，用位於Kir6.2基因中XhoⅠ位點下遊約4kb處的約0.6kb Kit6.2基因片段(該片段在導向載體中並不包含)探針，進行Southern印跡分析。篩選了393個ES細胞，鑑定出一個實現了同源重組的克隆。
產生Kir6.2基因缺陷型純合小鼠
從懷孕的129/SV小鼠中取出3.5日齡的未分化胚胎，用約20個亞培養的突變ES細胞進行顯微注射，然後移植入代理母親(小鼠)的子宮中，通過自然分娩而得到嵌合小鼠。
然後，將這些嵌合小鼠中的雄性小鼠與野生型雌性小鼠雜交，獲得第二代(F1)小鼠。然後，第二代小鼠相互雜交，獲得第三代(F2)小鼠。某些第三代(F2)小鼠是Kir6.2基因缺陷型純合小鼠(Kir6.2-/-)，它是通過雜合(Kir6.2-/+)小鼠(這些小鼠僅在兩個等位基因座的一個基因座上缺失Kir6.2基因)之間的雜交而產生的。這些雜合小鼠被選出以產生本發明的Kir6.2基因缺陷型純合小鼠(Kir6.2-/-)。圖2顯示了Southern印跡分析結果。在此圖中，泳道+/+表示野生型，+/-表示雜合子，-/-表示Kir6.2基因缺陷型純合子。Southern印跡分析是這樣進行的用EcoRⅠ和BglⅡ消化10微克抽提的基因組DNA，用位於Kir6.2基因中XhoⅠ位點下遊約4kb處的約0.6kb Kir6.2基因片段(該片段並不包含在導向載體中)探針進行探測。
從Kir6.2基因缺陷型純合小鼠和對照小鼠的胰腺、心臟和腦中進行組織採樣，用GTC法製備RNA。以RNA為基礎，用隨機6聚引物製備單鏈DNA。以單鏈DNA為模板，在選自Kir6.2基因內的引物協助下進行PCR(RT-PCR)，證實了在Kir6.2基因缺陷型純合小鼠中Kir6.2基因沒有轉錄。
圖3顯示了對Kir6.2+/+和Kir6.2-/-小鼠的胰腺、心臟和腦分別進行RT-PCR分析的結果。從每種組織中抽提總共10微克RNA來製備cDNA。在Kir6.2+/+型組織中發現了Kir6.2轉錄物，但是在Kir6.2-/-型組織中沒有發現。Kir6.2 RT-PCR產物的預計長度為245鹼基對。
Kir6.2-/-小鼠可正常地生長，具有繁殖力，而且在總體外觀或行為方面沒有明顯異常。這樣獲得的Kir6.2-/-小鼠可通過它們之間相互的雜交而維持。此外，Kir6.2基因缺陷型雜合小鼠(Kir6.2+/-)可以通過Kir6.2-/-小鼠和Kir6.2+/+小鼠的雜交而產生。電生理學和胞內鈣濃度的測定
為了證實在Kir6.2基因缺陷型純合小鼠中缺乏有功能的KATP通道，我們檢查了正常(Kir6.2+/+)胰腺β-細胞和Kir6.2-/-細胞中全細胞膜電流、單個通道電流和胞內鈣濃度。
用膠原酶消化法(Wollheim,C等人，Meth.In Enzymology,Fleischer,SFleischer B.編輯，(Academic Press Inc.,San Diego),vol.192,p.188-223(1990))，分離出胰島，將分散的胰島細胞培養於添加有10％FCS的DMEM培養基中，接著接種至含CEL Locate Coverslips(Eppendorf,Hamburg,Germany)的3.5釐米培養皿中，37℃孵育24-72小時，然後進行實驗。
按照以前所述的方法(Miki T.等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),94,11969-11973(1997))，對單個胰腺β-細胞進行全細胞記錄，單個通道記錄，和胞內鈣濃度測量。
參見圖4，在-70mV的維持電壓下，每隔2秒鐘，將±10mV的交流電脈衝施加於胰腺β-細胞，持續時間為200毫秒。用無ATP的移液管溶液(pipette solution)對Kir6.2+/+胰腺β-細胞進行胞內透析(貫通)，這導致膜的K+傳導性進行性增加。這種增加可被500μM甲苯磺丁脲迅速抑制，該特性是胰腺β-細胞中KATP通道所特有的。與之相反，在透析或用甲苯磺丁脲處理之後在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中沒有觀察到K+傳導性的增加。
在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中KATP通道活性的完全喪失還得到了單通道分析的證實。在Kir6.2+/+胰腺β-細胞的40個斑點(patch)中有39個檢測到單式KATP通道電流(39/40=97.5％)，而在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中沒有檢測到電流(0/40=0％)。在Kir6.2-/-小鼠中KATP通道活性的缺乏還在骨骼肌中得到證實。這些結果表明，Kir6.2表達蛋白是KATP通道發揮功能所必需的亞基。圖5顯示了胰腺β-細胞的KATP通道傳導性。為了消除細胞之間不同膜區域的影響，通過將記錄的ATP-敏感性傳導性除以各細胞的膜電容而使其歸一化。
圖6顯示了Kir6.2+/+胰腺β-細胞和Kir6.2-/-胰腺β-細胞的靜息膜電位和胞內Ca2+基礎濃度([Ca2+]i)。靜息膜電位在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中明顯高於正常的Kir6.2+/+胰腺β-細胞[Kir6.2-/-:-36.1±1.88mV(n=59)；Kir6.2+/+:-65.5±1.99mV(n=59):p＜0.001]。在2.8mM葡萄糖存在時，注意到反覆發生動作電位的爆發(數據未示出)。在相同葡萄糖濃度下，在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中胞內Ca2+基礎濃度自發地波動，但其平均值在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中明顯升高[Kir6.2-/-:179±13.1nM(n=34)；Kir6.2+/+:70.9±4.31nM(n=16):p＜0.001]。與Kir6.2+/+胰腺β-細胞(在該細胞中高濃度的葡萄糖(16.7mM)誘導膜的去極化)相反，用16.7mM葡萄糖並不改變Kir6.2-/-胰腺β-細胞的膜電位(數據未示出)。這些結果表明，胰腺β-細胞的靜息膜電位是由KATP通道所決定的。
因為葡萄糖和甲苯磺丁脲導致胰腺β-細胞中KATP通道的關閉，從而導致膜的去極化和鈣流入，因此我們還檢查了對不同的促分泌物刺激反應時β細胞中胞內Ca2+濃度的變化。所用的促分泌物是葡萄糖(16.7mM)、甲苯磺丁脲(100μM)、乙醯膽鹼(100μM)和K+(30mM)。
圖7顯示了對於典型實施例，這些胰島素促分泌劑分別對Kir6.2+/+和Kir6.2-/-胰腺β-細胞的胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)的作用。在圖中的水平標杆表示施用促分泌劑的時間。這些圖顯示，上述所有的促分泌劑在所示濃度下都使Kir6.2+/+胰腺β-細胞的胞內Ca2+濃度升高；與之相反，在和Kir6.2-/-胰腺β-細胞中儘管乙醯膽鹼和K+使Ca2+濃度升高至與Kir6.2+/+胰腺β-細胞中相當的水平，但是葡萄糖和甲苯磺丁脲不引起Kir6.2-/-胰腺β-細胞中胞內Ca2+濃度的任何變化。
這些結果證實，在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中，胞內鈣從肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)-敏感性Ca2+儲藏區(reservoir)移出，以及通過電壓依賴型鈣通道而流入Ca2+的情況是正常的，同時還表明，在正常胰腺β-細胞中葡萄糖和甲苯磺丁脲所引發的Ca2+升高需要關閉KATP通道。
批量培養中胰島素分泌的反應
在體外，通過批量孵育成年小鼠的胰島來測定對葡萄糖和甲苯磺丁脲的胰島素分泌反應。
根據Okamoto等人的方法(Okamoto,Y.等人，糖尿病(Diabetes),41,1555-1561(1992))並稍作修改，進行批量孵育。簡而言之，將胰島(每管中10個胰島)在37℃於HEPES-Krebs中預孵育60分鐘，然後在400微升含不同胰島素分泌刺激劑的緩衝液中孵育30分鐘。
圖8顯示了在批量孵育的Kir6.2+/+和Kir6.2-/-胰島中的胰島素分泌情況。柱上方括號中的各個數字表示實驗的次數。儘管在Kir6.2-/-胰腺β-細胞中胞內Ca2+的基礎水平上升，但是批量孵育的Kir6.2-/-胰島中胰島素分泌的基礎水平卻與Kir6.2+/+細胞沒有差別[Kir6.2+/+:0.42±0.05ng/10個胰島/30分鐘；Kir6.2-/-:0.35±0.04ng/10個胰島/30分鐘]。在Kir6.2+/+胰島中，對於16.7mM葡萄糖的反應是導致胰島素分泌增加了7.2倍，而且添加100μM甲苯磺丁脲，可使分泌進一步增加。與之相反，在Kir6.2-/-胰島中16.7mM葡萄糖和加入100μM甲苯磺丁脲都不導致胰島素分泌。與此相反的是，100μM乙醯膽鹼和60mM K+兩者都引發胰島素分泌(數據未示出)。
這些結果表明，對於葡萄糖誘導的或甲苯磺丁脲誘導的胰島素分泌而言，至關重要的是胞內Ca2+濃度的迅速上升而不是持續升高。
在灌流實驗中胰島素分泌的反應
接著，在體外通過對成年小鼠的胰島進行灌注來測定胰島素分泌對葡萄糖和甲苯磺丁脲的反應。
根據Wollheim等人的方法(Wollheim,C等人，Meth.In Enzymology,Fleischer,SFleischer B.編輯，(Academic Press Inc.,San Diego),vol.192,p.188-223(1990))，對胰島進行灌流。簡而言之，將150隻胰島置於裝有Bio-Gel P-2(Bio-Rad,CA,USA)的柱中，然後用含118.4mM氯化鈉、4.7mM氯化鉀、1.2mM磷酸二氫鉀、2.4mM氯化鈣、1.2mM硫酸鎂、20mM碳酸氫鈉、2.8mM葡萄糖和10mM HEPES，並補充有0.2％(w/v)牛血清白蛋白的充氣(gassed)HEPES-Krebs緩衝液在37℃，以0.5毫升/分鐘恆定流速連續地灌流。在預孵育60分鐘之後，添加不同的胰島素分泌刺激劑。
圖9顯示了在灌流的Kir6.2+/+和Kir6.2-/-胰島中的胰島素分泌對葡萄糖和甲苯磺丁脲的反應的時間進程。對於每次實驗，分別從3-5隻Kir6.2+/+和Kir6.2-/-動物中分離出胰島。分別根據Kir6.2+/+和Kir6.2-/-動物的4和5次實驗而獲得平均值和標準差。圖中的水平標杆表示施用各物質的時間。當存在2.8mM葡萄糖時，胰島素分泌的基礎水平沒有明顯差別[Kir6.2+/+:2.04±0.50pg/1個胰島/分鐘；Kir6.2-/-:1.92±0.41pg/1個胰島/分鐘]。在Kir6.2+/+胰島的灌流中，在第一階段對於16.7mM葡萄糖僅觀察到痕量胰島素分泌，而在第二階段觀察不到分泌。在16.7mM葡萄糖存在時100μM甲苯磺丁脲不刺激Kir6.2-/-的胰島素分泌。在體內Kir6.2-/-胰島僅表現出對葡萄糖很有限的胰島素反應，這表明KATP通道在葡萄糖誘導的胰島素分泌的第一和第二階段都很關鍵。
葡萄糖耐受性測試
在禁食16小時後，將葡萄糖(1克/千克)注射入麻醉小鼠(10-16周齡)的腹腔內，然後測定血糖水平和血清胰島素濃度。
圖10顯示葡萄糖耐受性測試的結果。上圖顯示血糖水平的變化，而下圖顯示血清胰島素濃度的變化。對於Kir6.2+/+，禁食的血糖水平為132±6mg/dl(n=11)；而對於Kir6.2-/-為121±8mg/dl(n=11)。在葡萄糖負荷後60和120分鐘，Kir6.2-/-的血糖水平稍高於Kir6.2+/+[分別為332±16mg/dl和279±8mg/dl(60分鐘)(n=11)；268±14mg/dl和192±8mg/dl(120分鐘)(n=11)；P＜0.01]。比較葡萄糖負荷之前和之後的情況，血清胰島素濃度表明，對於Kir6.2+/+從0.34±0.09ng/ml變為2.05±0.17ng/ml(n=6；p＜0.001)，對於Kir6.2-/-從0.42±0.07ng/ml變為0.70±0.05ng/ml(n=6；p＜0.001)。
因此，出乎意料的是，儘管在葡萄糖誘導的胰島素分泌方面存在缺陷，但是發現在Kir6.2-/-小鼠中葡萄糖耐受性僅受到輕微損害。此外，在Kir6.2-/-小鼠(12周)中隨機測量的血糖水平與年齡匹配的正常鼠並沒有差別[Kir6.2-/-:191±6.4mg/dl(n=33)；Kir6.2+/+:188±3.8mg/dl(n=29)]。
胰島素負荷測試
因為對於Kir6.2-/-小鼠的結果可以解釋為胰島素的降葡萄糖效應的增強了，因此，為了檢查該假設，我們用較低劑量的胰島素(0.1單位/千克)進行注射，然後檢查血糖水平的改變情況。圖11顯示胰島素負荷測試的結果。在禁食16小時後，將胰島素(0.1單位/千克)注射入麻醉的成年小鼠(10-16周齡)腹腔內。
在葡萄糖負荷後90分鐘和120分鐘，在Kir6.2+/+中的血糖水平明顯低於Kit6.2+/+中的血糖水平[Kir6.2-/-為67.4±3.4％而Kir6.2+/+為84.7±3.9％(90分鐘)；Kir6.2-/-為66.0±3.8％而Kir6.2+/+為83.7±2.8％(120分鐘)；*p＜0.01]。如這些結果所示，與Kir6.2+/+小鼠相比，胰島素的降葡萄糖效應在Kir6.2-/-小鼠中明顯增強。
葡萄糖誘導型和磺醯脲誘導型胰島素分泌是否依賴於KATP通道，這仍然存在爭論(Cook,D.L.等人，「糖尿病」，37:495-498(1988)；Takasawa,S.等人，科學(Science),259:370-373(1993)；Gembal,M.等人，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.),91:871-880(1993)；Komatsu,M.等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),92:10728-10732(1995)；Eliasson,L.等人，科學(Science),271:812-815(1996))。如上所述，已發現在Kir6.2-/-中高濃度的葡萄糖並不刺激胰島素分泌，而且即使在高濃度葡萄糖存在下甲苯磺丁脲也不引發胰島素分泌。這強烈暗示，葡萄糖代謝本身對於葡萄糖誘導的或甲基磺丁脲誘導的胰島素分泌是不夠的。上述結果表明，葡萄糖誘導型和磺醯脲誘導型胰島素分泌都需要KATP通道關閉而導致的胞內Ca2+濃度的快速上升。
本研究表明，破壞KATP通道可增加體內胰島素所誘導的葡萄糖耗用。使人感興趣的是，除了刺激胰島素分泌之外，已表明磺醯脲可增強骨骼肌(Simpson,I.A.等人，生物化學年報(Ann.Rev.Biochem.),55:1059-1089(1986))，葡萄糖耗用的主要部位(Wang,P.H.等人，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.),84:62-67(1989))中胰島素所刺激的葡萄糖轉移，這也暗示骨骼肌KATP通道調節了胰島素刺激的葡萄糖轉移。
人體中SUR1或Kir6.2的突變可導致嬰兒持續性高血胰島素低血糖症(PHHI)，這種病的特徵是失調的胰島素分泌(Thomas,P.M.等人，科學(Science),268:426-429(1995)；Kane,C.等人，「自然醫學」(Nature Med.),2:1344-1347(1996)；Nichols,C.G.等人，科學(Science),272:1785-1787(1996)；Dunne,M.I.等人，新英格蘭醫學雜誌(N.Engl.J.Med.),336:703-706(1997)；Nestorowicz,A.等人，「糖尿病」，46:1743-1748(1997))。我們的數據顯示在新生Kir6.2-/-動物中有暫時的低血糖。因為SUR1是β-細胞KATP通道的特異性亞基而且Kir6.2是β-細胞和骨骼肌KATP通道兩者的亞基，因此SUR1和Kir6.2突變的後果會在胰島素作用方面出現差異。
如上所述，在胰腺β-細胞中的KATP通道是葡萄糖誘導型和磺醯脲誘導型胰島素分泌所必需的。此外，在骨骼肌中KATP通道調控了胰島素的作用，其機理有待闡明。
序列表(2)SEQ ID NO:1:
(ⅰ)序列特徵(A)長度1173鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO:1:ATGCTGTCCC GAAAGGGCAT TATCCCTGAG GAATATGTGC TGACCCGGCT GGCAGAGGAC 60CCTGCAGAGC CCAGGTACCG TACTCGAGAG AGGAGGGCCC GCTTCGTGTC CAAGAAAGGC120AACTGCAACG TCGCCCACAA GAACATTCGA GAGCAGGGCC GCTTCCTGCA GGATGTGTTC180ACCACGCTGG TGGACCTCAA ATGGCCACAC ACTCTGCTCA TTTTCACCAT GTCCTTCCTG240TGCAGCTGGC TGCTCTTTGC CATGGTCTGG TGGCTCATCG CCTTCGCCCA CGGTGACCTG300GCCCCCGGAG AGGGCACCAA TGTGCCCTGC GTCACAAGCA TCCACTCCTT TTCATCTGCC360TTCCTTTTCT CCATCGAGGT CCAGGTGACC ATTGGTTTCG GCGGGCGCAT GGTGACAGAG420GAATGTCCCC TGGCCATCCT CATTCTCATT GTGCAGAATA TCGTCGGGCT GATGATCAAC480GCCATCATGC TGGGCTGCAT CTTCATGAAA ACGGCCCAGG CCCATCGGCG GGCAGAAACC540CTCATCTTCA GCAAGCATGC TGTGATCACC CTGCGCCATG GCCGCCTGTG CTTCATGCTG600CGCGTAGGGG ACCTCCGAAA GAGCATGATC ATTAGCGCCA CCATCCACAT GCAGGTGGTG660CGCAAGACCA CCAGCCCCGA GGGCGAAGTT GTGCCTCTCC ACCAGGTAGA CATCCCCATG720GAGAATGGCG TGGGTGGTAA CGGCATCTTC CTGGTGGCCC CACTCATCAT CTACCACGTC780ATCGACTCCA ACAGCCCGCT CTACGACCTG GCTCCTAGTG ACCTGCACCA CCACCAGGAC840CTGGAGATCA TTGTCATCTT GGAAGGCGTG GTAGAAACCA CGGGCATCAC CACCCAGGCC900CGCACCTCCT ACCTAGCTGA CGAGATTCTA TGGGGGCAGC GCTTTGTCCC CATTGTGGCC960GAGGAGGACG GCCGCTATTC TGTGGACTAC TCCAAATTTG GTAACACCAT TAAAGTGCCC 1020ACACCACTCT GCACAGCCCG CCAGCTTGAT GAGGACCGCA GTCTGCTGGA TGCCCTGACC 1080CTCGCCTCGT CGCGGGGGCC CCTGCGCAAG CGCAGTGTGG CTGTGGCGAA GGCCAAGCCC 1140AAGTTTAGCA TCTCTCCAGA TTCCTTGTCC TGA117權利要求
1．一種純合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物，其特徵在於，兩個等位基因座上都缺失了ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因。
2．如權利要求1所述的純合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物，其特徵在於，該哺乳動物是小鼠。
3．一種雜合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物，其特徵在於，兩個等位基因座上只有一個基因座缺失了ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因。
4．如權利要求3所述的雜合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物，其特徵在於，該哺乳動物是小鼠。
5．如權利要求1所述的哺乳動物的組織。
6．如權利要求5所述的組織，其特徵在於，它選自下組胰腺組織、骨骼肌組織、心肌組織、垂體腺組織和血管內皮組織。
7．如權利要求3所述的哺乳動物的組織。
8．如權利要求7所述的組織，其特徵在於，它選自下組胰腺組織、骨骼肌組織、心肌組織、垂體腺組織和血管內皮組織。
9．如權利要求1所述的哺乳動物的細胞。
10．如權利要求9所述的細胞，其特徵在於，它選自下組郎格罕氏β-細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、垂體腺細胞和血管內皮細胞。
11．如權利要求3所述的哺乳動物的細胞。
12．如權利要求11所述的細胞，其特徵在於，它選自下組郎格罕氏β-細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、垂體腺細胞和血管內皮細胞。
13．一種純合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物的ES細胞系，其特徵在於，它衍生自純合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物，其中兩個等位的基因座上都缺失了ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因。
14．一種產生純合的Kir6.2基因缺陷型非人哺乳動物的方法，其中在兩個等位的基因座上都缺失了ATP-敏感性鉀通道Kir6.2基因，其特徵在於，該方法包括步驟用cDNA探針，從該非人動物基因組文庫中分離出含Kir6.2基因的克隆，通過在該Kir6.2基因中插入可供選擇的標記基因，破壞該分離出的克隆的DNA序列中的Kir6.2基因，構建導向載體，該載體含有包含該被破壞Kir6.2基因的DNA序列，將該導向載體引入培養的ES細胞中，從而發生同源重組，分離和鑑別出已發生同源重組的克隆，從懷孕動物獲得胚泡，並將分離和鑑別出的克隆的細胞注入胚泡，將該胚泡移植入代理母親動物的子宮內，獲得嵌合動物，將該嵌合動物與野生型動物雜交獲得F1動物，將該F1動物相互雜交，獲得F2動物，和選擇純合的Kir6.2基因缺陷型動物。
全文摘要
提供了Kir6.2基因缺陷型的非人哺乳動物(尤其是小鼠)，及其組織和細胞，其中在一個或兩個等位基因座上缺失了ATP－敏感性鉀通道Kit6.2基因，它是胰腺β－細胞分泌胰島素所必需的K
文檔編號C07K14/705GK1238385SQ9910861
公開日1999年12月15日 申請日期1999年6月9日 優先權日1998年6月10日
發明者清野進, 三木隆司, 宮崎純一 申請人:日本化學研究株式會社, 清野進