癌症的預測和預後以及監控癌症治療的方法

2023-06-10 16:00:41 1

專利名稱：：癌症的預測和預後以及監控癌症治療的方法
技術領域：
：本發明涉及生物標記和生物標記用於癌症的預測與預後的用途以及生物標記監控癌症治療效果的用途。特別地，本發明涉及可溶性VEGF-R2作為多激酶抑制劑的生物標記的用途。
背景技術：
：血管內皮生長因子受體(VEGFR)及其配體，血管內皮生長因子(VEGF)，在內皮細胞遷移和增殖中起到關鍵作用。VEGFR/VEGF系統包括三種受體(VEGFR-l,VEGFR-2和VEGFR-3)和四種配體(VEGF-A,B,C,D和E以及胎盤生長因子)。VEGF-A進一步由四種亞型組成，VEGF-121,VEGF-165,VEGF-185和VEGF-204,它們源自VEGF-A基因的可替換轉錄。受體是具有胞內酪氨酸激酶結構域的血漿跨膜蛋白。與其它蛋白質激酶一樣，VEGFR的激活是調節內皮細胞增殖信號的關鍵機理，並且認為VEGFR/VEGF的異常引起各種人類疾病如牛皮癬和惡性腫瘤中的異常血管形成。在胎盤形成中，VEGFR/VEGF系統是血管系統的正常發育所必需的。在成人中，VEGFR/VEGF在傷口癒合、炎症和血管形成中是重要的。在藥物治療前對患者體內循環的可溶性VEGF-R2水平的非入侵性測定對於治療決策有著潛在的重要輔助作用。儘管總VEGF-A的測定已經用作人類疾病結果的預後指標，但是沒有報導過化療之前患者體內可溶性VEGF-R2水平與治療結果之間的相關性。因此，可溶性VEGF-R2可以作為有價值的預後指標，並作為監測使用多激酶抑制劑的治療效果的生物標記。發明概述本發明涉及生物標記和生物標記用於癌症的預測與預後的用途以及生物標記監控癌症治療效果的用途。特別地，本發明涉及可溶性VEGF-R2作為多激酶抑制劑(例如，索4i非尼(Sorafenib))的生物標記的用途。在一個實施方案中，本發明涉及使用定量免疫測定來測量使用多激酶(例如，索拉非尼)治療前的人體液中可溶性VEGF-R2蛋白質的水平。所述水平作為使用多激酶抑制劑(例如，索拉非尼)治療的癌症患者從這樣的治療中獲益的潛能指標是特別有用的。可溶性VEGF-R2治療後水平的測量以及療程中可溶性VEGF-R2水平的變化在臨床上可以用作患者治療選擇的一種治療學輔助手段，以監控患者體內腫瘤發生前/肺瘤疾病的情況，和/或監控肺瘤發生前/腫瘤疾病患者怎樣應答治療。在一個實施方案中，可溶性VEGF-R2的水平可以用來輔助患者治療的選擇，以及為患者治療的最佳方法作出決定。可以在患者樣品中測定可溶性VEGF-R2的水平，這些樣品如但不限於，血液、血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁、腦脊髓液、淚液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜積液、羊水、膀胱衝洗液和支氣管肺泡灌洗液。在另一個實施方案中，本發明涉及將免疫測定用作選擇有可能獲益於多激酶抑制劑(例如，索拉非尼)治療的患者的方法，通過測量患者樣品中的可溶性VEGF-R2預處理水平和基於可能的患者結果對可溶性VEGF-R2水平的計算圖來評價可能的結果。患者體內與激活的VEGF途徑相關病況的監控方法可以進一步預後疾病，其中患者樣品中的總VEGF蛋白質水平表示患者較好或較弱的治療結果。預後可以是選自應答率(RR)、完全應答(CR)、部分應答(PR)、穩定疾病(SD)、臨床益處[包括完全應答(CR)、部分應答(PR)和穩定疾病(SD)]、進展時間(TTP)、無進展生存(PFS)和總生存率(OS)的臨床結果。這些方法可以是標準格式化的，例如，夾心免疫測定形式的免疫測定，如夾心酶聯免疫分析(ELISA)或等價測定。這些免疫測定法可以使用單克隆抗體，例如，抗可溶性VEGF-R2單克隆抗體。此外，單克隆抗體可以是生物素化的。本發明的另一個實施方案涉及測量患者樣品中總可溶性VEGF-R2蛋白水平連續變化的定量免疫測定，作為患病患者治療選擇的方法，該疾病例如為肺瘤發生前/腫瘤疾病。例如，一種這樣的治療選擇方法可以包括步驟(a)免疫檢測和定量對照群體樣品中總可溶性VEGF-R2蛋白質的水平；(b)免疫檢測和定量隨時間取自患者的樣品中總可溶性VEGF-R2蛋白質的水平；和(c)根據患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質的水平決定使用常規治療和/或多激酶抑制劑(例如，索拉非尼)治療來治療患者。例如，如果發現患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質的水平在70pg/ml以上，可以得出的結論是患者患有可溶性VEGF-R2引起的疾病，並作出使用多激酶抑制劑(例如，索拉非尼)治療來治療患者的結論，該治療可以是單獨的或結合一種或更多其他治療。可溶性VEGF-R2途徑定向治療可以是多激酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、雙芳基脲、VEGFR-2反義抑制劑或單克隆抗體治療等。例如，VEGF途徑定向治療可以是雙芳基脲索拉非尼，其是血管生成抑制劑以及酪氨酸激酶抑制劑，或酪氨酸激酶抑制劑STI571(也稱為曱磺酸伊馬替尼或Gleevec)。本發明的另一個實施方案涉及使用定量免疫測定來檢測可溶性VEGF-R2水平結合一種或多種其他蛋白質水平的變化。這些其他的蛋白質可以包括，例如，抑制劑(例如，金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP國l))、癌蛋白(例如,HER-2/畫,rasp21)、生長因子受體(例如，表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生的生長因子受體a(PDGFR-a))、轉移蛋白(例如，尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA))、腫瘤標記(例如，癌胚抗原(CEA))和腫瘤抑制劑(例如，p53)。這些方法隨後可以用作例如，診斷/預後工具、患病患者的治療選擇、檢測患者的病況和監測患病患者怎樣應答VEGF途徑定向治療或其他治療。測試患者(例如，癌症患者)的總可溶性VEGF-R2和其他蛋白(如激活VEGF途徑的蛋白)的連續改變是有利的，這將作為擴大臨床觀察，治療來源和診斷/預後參數的工具，以便為了最有前景的治療結果來選擇最佳治療組合。在另一個實施方案中，本發明提供了用於監控患者樣品中治療效果的試劑盒，其包括蛋白質特異性抗體。在特定的實施方案中，該試劑盒進一步包括試劑盒的使用說明。在特定的實施方案中，該試劑盒可以進一步包括懸浮或固定細胞的溶液、檢測標記或指示物、提供對抗體結合敏感的多肽的溶液、溶解細胞的溶液或用於純化多肽的溶液。在進一步的實施方案中，抗體是可溶性VEGF-R2特異性的。附圖1說明了患者群體在基線(預治療)和治療過程中的平均可溶性VEGF-R2水平。發明詳述可以理解本發明不限於所述的特定方法、實驗方案、細胞系、動物種或屬、構建體和試劑，同樣可以改變。還可以理解在此所用的術語只是為了描述特定實施方案的目的，並不意味限制本發明的範圍，其只受到所附權利要求的限制。必須注意在此和所附權利要求中所用的單數形式"一個，，，"一種"和"該"包括複數指代物，除非上下文中另外明確地指出。因此，例如，參照"一種基因"指的是一種或多種基因並包括本領域技術人員公知的等價物等。除非另外限定，在此所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義。儘管與在此所述的那些相似或等價的任何方法、設備和材料相似或等同的方法、設備、以及原料可以用於本發明的實施或測試中，但是現在描述優選的方法、設備和材料。在此提及的所有出版物和專利為了描述和公開的目的在此引入作為參考，例如，出版物中描述的構建體和方法可以結合在此所述的本發明使用。只是為了本申請申請日之前的公開內容而提供了以上和整個文中討論的出版物。在此沒有任何內容解釋為本發明人依據先前發明而有權預料這樣的公開內容的容許。定乂為了方便，以下提供了說明書、實施例和所附權利要求中所用的特定術語和短語的意思。在此所用的術語"患者樣品"指的是獲自患者的樣品。樣品可以是任何生物組織或流體。樣品可以是源自患者的樣品。這樣的樣品包括，但不限於，血液、血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁、腦脊髓液、淚液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜積液、腹膜水、羊水、膀胱衝洗液和支氣管肺泡灌洗液、血細胞(例如，白細胞)，組織或活組織檢查樣品(例如，胂瘤活組織檢查)，或其細胞。生物樣品還可以包括組織切片，如出於組織學目的獲取的冷凍切片。術語"生物標記"包括了寬範圍的胞內和胞外情況以及完整生物體生理學變化。生物標記本質上可以代表細胞功能的任何方面，例如，但不限於，信號分子、轉錄因子、代謝產物、基因轉錄產物的生產水平或生產速率以及蛋白質的翻譯後修飾。生物標記可以包括轉錄產物水平的全基因組分析或蛋白質水平的全蛋白組分析和/或修飾。生物標記也可以指的是基因或基因產物，與未處理的患病細胞相比較，其在患病患者的化合物治療過的患病細胞中是上調或下調的。即，基因或基因產物對處理過的細胞是充分特異性的，其可以任選地與其他基因或基因產物一起用於鑑定、預測或檢測小分子。因此，生物標記是患病細胞中化合物功效特徵性的或患病細胞對化合物治療應答特徵性的基因或基因產物。術語"癌症"包括，但不限於，實體肺瘤，如乳房、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、尿路、眼睛、肝、皮膚、頭頸、曱狀腺、副曱狀腺的癌症及其遠端的轉移癌。該術語還包括、淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳癌的實例包括，但不限於，浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、原位導管癌和原位小葉癌。呼吸道癌的實例包括，但不限於，小細胞和非小細胞肺癌以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細胞瘤。腦癌的實例包括，但不限於，腦幹和下丘腦神經膠質瘤，小腦和大腦星形細胞瘤，成神經管細胞瘤、室管膜細胞瘤以及神經外胚層和松果體瘤。男性生殖器官胂瘤包括，但不限於，前列腺和睪丸癌。女性生殖器官腫瘤包括，但不限於，子宮內膜、子宮頸、卯巢、陰道和外陰癌，以及子宮肉瘤。消化道肺瘤包括，但不限於，肛門、結腸、結直腸、食道、膽嚢、胃、胰腺、直腸、小腸和唾液腺癌。尿路腫瘤包括，但不限於，膀胱、陰莖、腎、腎盂、輸尿管、以及尿道癌。眼癌包括，但不限於，眼內黑素瘤和視網膜成神經細胞瘤。肝癌的實例包括，但不限於，肝細胞癌(帶有或不帶有纖維板層變體的肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)和混合型肝細胞膽管癌。皮膚癌包括，但不限於，鱗狀細胞癌，Kaposi's肉瘤，惡性黑色素瘤，默克爾細胞皮膚癌和非黑素瘤皮膚癌。頭頸癌包括，但不限於，喉/舌/鼻咽/口咽癌，以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括，但不限於，AIDS-相關淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，表皮T細胞淋巴瘤，霍奇金氏病和中樞神經系統的淋巴瘤。肉瘤包括，但不限於，軟組織肉瘤，骨肉瘤，惡性纖維組織細胞瘤，、淋巴肉瘤和一黃紋月幾肉瘤。白血病包括，但不限於，急性骨髓性白血病，急性淋巴細胞性白血病，l曼性淋巴細胞性白血病，慢性髓細胞性白血病和毛細胞白血病。在此所用的術語"患者，，或"個體"包括哺乳動物(例如，人和動物)。本發明涉及測量患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質水平的定量免疫測定。這些測定可以用於選擇患有激活的可溶性VEGF-R2途徑相關疾病的患者的治療。如在此所用的，將"活化的VEGF途徑"定義為由可溶性VEGF-R2蛋白的超表達或突變的VEGF途徑，並且同樣包括未調節的和/或突變刺激的VEGF途徑。與激活的VEGF途徑相關的胂瘤疾病，以及導致肺瘤疾病的癌前病變的實例是以下的這些轉移性成神經管細胞瘤、胃腸道間質瘤(GIST)、隆突性皮膚纖維肉瘤(DFSP)、慢性骨髓增生性疾病(CMPD)、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、急性髓細胞性白血病、曱狀腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細胞癌和惡性血液病。因此，可溶性VEGF-R2蛋白的水平，單獨或結合其他蛋白質(例如，其他癌蛋白)的水平，可以用來預測臨床結果和/或作為治療選擇中的輔助手段。因此，本發明公開和要求了免疫測定用來定量測量患者樣品中可溶性VEGF-R2水平(例如，循環可溶性VEGF-R2水平)的申請，以便評估患有癌症的患者從使用多激酶抑制劑(例如，索拉非尼)的治療中獲益的可能性。在本發明的一個實施方案中，在診斷時(例如，腎細胞癌)以及隨後的治療後時間點(例如，第一個治療周期的第31天，第三個治療周期的第l天)定量獲取的病人樣品中的可溶性VEGF-R2蛋白。這樣的患者樣品可以是，例如，血液、血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁、腦脊髓液、淚液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜積液、羊水、膀胱沖洗液和支氣管肺泡灌洗液，以及其它體液樣品。患者樣品可以是新鮮的或冷凍的，並可以是用肝素、檸檬酸鹽或EDTA處理過的。作為可以用於本發明方法中的免疫測定的實例是夾心ELISA。然而，可以知道除了在此公開的那些，其他方法可以用來定量患者樣品中的可溶性VEGF-R2蛋白。此外，許多才全測方法可以用來》見察可溶性VEGF-R2蛋白，如發光標記。許多形式適於與本發明的方法一起使用。例如，可以通過酶聯免疫吸附測定、放射免疫測定、二元抗體夾心測定、凝集測定、螢光免疫測定、免疫電子和掃描顯微鏡檢查與其它本領域公知的其他測定來進行患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白的才全測和定量。可以通過本領域已知的常規方法來適應這些測定中可溶性VEGF-R2蛋白的定量。在一個實施方案中，可以通過夾心測定來檢測和定量循環可溶性VEGF-R2蛋白水平的連續變化，其中已經使用常規技術將捕獲抗體固定於支持物表面上。合適的支持物包括，例如，合成的聚合物支持物，如聚丙烯、聚苯乙烯、取代的聚苯乙婦、聚丙烯醯胺(如聚醯胺和聚氯乙烯)、玻璃珠、瓊脂糖和硝化纖維。可以用於本發明方法中的ELISA夾心免疫測定的實例使用了純化的小鼠抗人可溶性VEGF-R2單克隆抗體作為捕獲抗體以及生物素化山羊抗人可溶性VEGF-R2多克隆抗體作為檢測抗體。將捕獲單克隆抗體固定於微量滴定板孔上。將稀釋的人血清/血漿取樣或可溶性VEGF-R2標準品(例如，重組野生型可溶性VEGF-R2蛋白)在孔中培養以使捕獲單克隆抗體結合可溶性VEGF-R2抗原。孔洗滌後，將固定的可溶性VEGF-R2抗原暴露於生物素化4企測抗體，此後再次洗滌孔。然後加入抗生蛋白鏈菌素辣根過氧化物酶綴合物。在最後洗滌後，將TMB藍色底物加入到孔中來檢測結合的過氧化物酶活性。通過加入2.5N硫酸來終止反應，同時在450nm處測量吸光度。樣品的吸光度值與可溶性VEGF-R2標準品的聯繫使得可以測定以pg/ml計的血清或血漿中的可溶性VEGF-R2的定量值。可以知道其他蛋白質(例如，抑制劑、癌蛋白、生長因子受體、血管生成因子、轉移蛋白、腫瘤標記、腫瘤抑制劑、與VEGF途徑相關的蛋白質)適於結合可溶性VEGF-R2來檢測和定量。例如，適於結合可溶性VEGF-R2測試的其他蛋白質包括金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1)、HER-2/neu、rasp21、表皮生長因子受體(EGFR)、血小板衍生的生長因子受體a、血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA)、癌胚抗原(CEA)和p53。可以使用本領域技術人員已知的測定來檢測這些其它蛋白質。例如，用於HER-2/neu和TIMP-1定量的免疫測定是可購得的，如OncogeneScienceTIMP-1ELISA(OncogeneScience,Cambridge,MA(USA)),其可以才企測人血清或血漿中TIMP-1水平的ng/ml值。監控可溶性VEGF-R2的預治療水平可以表示用多激酶抑制劑(例如，索拉非尼)治療後的臨床結果。一種評估臨床結果的方法可以是應答率(RR)、完全應答(CR)、部分應答(PR)、穩定疾病(SD)、臨床益處(包括完全應答(CR)、部分應答(PR)和穩定疾病(SD))，進展時間(TTP)、無進展生存(PFS)和總生存率(OS)的評估。在此的術語"抗體，，以最寬泛的意思來使用，特別涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段。可以通過常規方法和/或遺傳工程製備根據本發明的方法有用的抗體。例如，根據本發明的抗體包括結合可溶性VEGF-R2的那些抗體。"抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；生物特異性抗體；以及從抗體片段形成的多特異性抗體。在此所用的術語"單克隆抗體"指的是從實質性同源抗體的群體獲得的抗體，即，包含相同群體的單個抗體，除可能少量存在的天然發生的突變。單克隆抗體是高度特異性的，即，針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同抗原決定簇(抗原決定部位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑相反，每個單克隆體抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾語"單克隆"表明該抗體的特徵為獲自基本上同源的抗體群，而不是解釋為需要通過任何特定方法來產生抗體。例如，可以通過由Kohler等(Nature256:495,1975)首先提出的雜交瘤方法，或通過重組DNA方法(參i,辨如，美國專利No.4,816,567)來製備根據本發明所用的單克隆抗體。也可以使用例如Clackson等(Nature352:624-628,1991)和Marks,等(J.Mol.Biol.222:581-597,1991)所述的技術從噬菌體抗體文庫分離單克隆抗體。在此單克隆抗體還包括"嵌合，，抗體(免疫球蛋白)，其中的重鏈和/或輕鏈的一部分與得自特定種或屬於特定抗體類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，同時鏈的剩餘部分與得自其它種或屬於另一個抗體類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，以及這樣的抗體的片段，只要它們呈現出所需的生物活性(參！，辨如，美國專利No.4,816,567;和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855,1984)。非人(如，鼠類)抗體的"人源化"形式是含有得自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對於大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區殘基由來自非人物種(供體抗體)的具有所需特異性，親和性和容量的高變區殘基所代替，這些非人物種如小鼠、大鼠、兔子、或非人類的靈長類動物。在一些情況中，人免疫球蛋白框架區(FR)殘基可以由相應的非人殘基所代替。此外，人源化抗體可以包括受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。形成這樣的修飾以進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體可以基本上包括至少一個或通常兩個可變域的全部，其中對應於那些非人免疫球蛋白和全部或基本上全部FR的全部或基本上全部高變區是人免疫球蛋白的那些。人源化抗體還任選包括至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。對於綜述，參見Jones等，(Nature321:522-525,1986);Reichmann,等(Nature332:323-329,1988);和Presta,(Curr.Op.StructBiol.2:593-596,1992)。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包括抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，Fv多肽進一步在VH和Vl結構域之間包括多肽連接物，其使sFv形成抗原結合所需的結構。對於綜述,參見Pluckthim(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies(單克隆抗體的藥理學)，Vol.113,Rosenburg和Moore編輯，Springer陽Verlag,NewYork,pp.269-315,1994)。術語"雙價抗體"指的是帶有兩個抗原結合位點的小的抗體片段，該片段包括連接相同多肽鏈(Vh-Vl)中的輕鏈可變區(VL)的重鏈可變區(Vh)。使用太短的連接物不能在相同鏈的兩個域之間進行配對，迫使該結構域與另一條鏈的互補結構域配對並形成兩個抗原結合位點。雙價抗體在例如EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448,1993)中有更全面的描述。表述"線性抗體，，指的是Zapata等(ProteinEng.8(10):1057-1062,1995)中描述的抗體。簡而言之，這樣的抗體包括一對串聯Fd部分(Vh-Ch1-Vh-Ch1),其形成一對基因結合區。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。根據本發明有用的代表性單克隆抗體包括設計來測量人可溶性VEGF-R2的鼠抗人總可溶性VEGF-R2單克隆抗體(例如，用於VEGFR畫165的OncogeneSciences夾心ELISA試劑盒)。才艮據本發明有用的單克隆抗體可來鑑定不同實驗室預後測試中例如臨床樣品中的可溶性VEGF-R2蛋白質。描述了在此有用的其他分子生物技術包括抗體製備的綜合性教科書包括Berger和Kimmel(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzvmologv,(分子克隆技術指南，酶學中的方法)Vol.152,AcademicPress,Inc.);Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆:實驗室手冊)(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989)Vol.1-3);CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學中的通用實馬僉方案)(F.M.Ausabel等〔糹扁豐尋〕,CurrentProtocols,GreenPublishingAssociatesInc.和JohnWiley&Sons,Inc.之間的合營，(2000年的增補));Harlow,等，(MonoclonalAntibodies:ALaboratoryManual(單克隆抗體:實驗室手冊)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1988),Paul〔編輯〕；FundamentalImmunology,(基石出免疫學)(LippincottWilliams&Wilkins(1998));和Harlow等(UsingAntibodies:ALaboratoryManual(使用抗體實-驗室手冊)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1998))。可以以任何常規方法來標記根據本發明鑑定可溶性VEGF-R2蛋白質有用的抗體。標記實例是辣根過氧化物酶，以及抗體標記方法的實例是使用生物素-抗生蛋白鏈菌素複合物。中用作示蹤劑的抗體，形成可見或使其可見的信號。可探測標記物質包括放射性元素，如SH、1251和1311;螢光劑，如異硫氰酸焚光素和其它螢光色素、藻膽蛋白、藻紅蛋白、稀土螯合物、德克薩斯紅、丹醯和玫瑰紅；比色試劑(色原體)；不導電物質，如膠體金；生物發光物；化學發光物；染料；酶，如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、a-、(3-半乳糖普酶，及其他的；輔酶；酶底物；酶輔因子；酶抑制劑；酶亞基；金屬離子；自由基；或任何其它提供了檢測或測量形成的免疫複合物的存在或含量的免疫活性或惰性物質。酶底物組合的實例是辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB),以及鹼性磷酸酶和對硝基苯基磷酸酯(pNPP)。根據本發明的另一個檢測和定量系統產生發光信號、生物發光(BL)或化學發光(CL)。在化學發光或(CL)生物發光(BL)測定中，測量強度或總的光發射並且與未知分析物的濃度相關。可以使用光度計(光電倍增管作為檢測器)或電荷耦合掐來定量測定光，或通過拍照或X光片來定性測量。使用該測定的主要優點是簡單和分析靈敏度，使得可以檢測和/或定量非常少量的分析物。示例發光標記是吖啶鏃酯、吖啶條磺醯基曱醯胺(acridiniumsulfonylcarboxamide),魯米諾，傘形酮，異氨基苯二醯魯米諾書f生物，發光蛋白，如水母發光蛋白和來自螢火蟲的螢光素酶，海洋細菌，Vargulla和Renilla。魯米諾可以任選性地與增強分子一起使用，如4-橫苯酚或4-羥基肉桂酸。通常，通過在鹼性條件下使用氧化劑處理來產生CL信號。其他發光檢測系統是其中信號(可探測標記)由底物上的酶促反應產生的那些。已經研發了CL和BL檢測方案，用於測定鹼性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、辣根過氧化酶(HRP)和黃噤呤氧化酶標記，以及其它的。AP和HRP是兩種酶標記，其可以通過CL和BL反應的範圍來定量。例如，AP可以與底物一起使用，如金剛烷基1,2-二嗯丁烷芳基磷酸酯底物(例如AMPPD或CSPD;Kricka,L.J.,"ChemiluminescenceandBioluminescence,Analysisby,"("通過化學發光和生物發光分析")MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference(編輯,R.A.Meyers)(VCHPublishers;N.Y,N.Y.;1995));例如，4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)螺[l,2-二囉丁烷-3,2，-金剛烷]的二鈉鹽，帶有或不帶有如l-(三辛基轔曱基)-4-(三丁基轔曱基)苯二氯化物的增強分子。HRP可以與底物一起使用,如2，,3，,6，-三氟苯基-曱氧基-10-曱基吖啶滿-9-曱酸酯。CL和BL反應不僅適用於酶的分析，而且適用於其他底物、輔因子、抑制劑、金屬離子等。例如，魯米諾、熒火蟲焚光素酶和海洋細菌螢光素酶反應各自是過氧化物、ATP和NADPH產生或消耗的指示反應。它們可以與其它涉及氧化酶、激酶和脫氫酶的反應相結合，並且可以用於測量耦合反應的任何組分(酶、底物、輔因子)。體。可探測標記的間接連接的實例是抗體和標記之間的結合對的4吏用或信號擴大系統的使用。用於連接抗體和可探測標記的結合對的實例是生物素/抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、或抗生物素；抗生物素蛋白/抗-抗生物素蛋白；曱狀腺素/曱狀腺素結合球蛋白；抗原/抗體；抗體/抗-抗體；碳水化合物/凝集素；半抗原/抗半抗原抗體；染料和疏水性分子/疏水蛋白結合位點；酶抑制劑，輔酶或輔因子/酶；多核酸/同源多核酸序列；螢光素/抗螢光素；二硝基酚/解二硝基酚(anti-dinitrophenol);維生素B12/內在因子;可的松、考的松/考的松結合蛋白；和特異性受體蛋白的配體/膜相連的特異性受體蛋白。各種用於將標記直接或間接連接抗體的方法是本領域已知的。例如，可以共價或非共價結合標記。示例的抗體綴合方法描述於Avarmeas等，Scan.J.Immunol.8(增補7):7，1978);Bayer等，Meth.Enzymol.62:308,1979;Chandler等,J.Immunol.Meth.53:187，1982;Ekeke禾口Abuknesha，J.SteroidBiochem.11:1579,1979;Engvall和Perlmann,J,Immunol.109:129，1972;Geoghegan等，Immunol.Comm.7:1,1978;以及Wilson和Nakane,ImmunofluorescenceandRelatedTechniques，Elsevier/NorthHollandBiomedicalPress;Amsterdam(1978)。根據標記的性質，可以使用各種技術用於檢測和定量標記。對於螢光劑，大量螢光劑是可用的。對於化學發光物，光度計或膠巻是可用的。使用酶，可以螢光地、化學發光地、分光光度測量地或在視覺上確定或測量螢光的、化學發光的、或有色的產物。具有吖啶鐿、苯並吖啶鏡或吖啶滿(acridan)型雜環系的各種類型的化學發光化合物是標記的其它實例。吖啶鏃酯的實例包括具有雜環或環系的那些，這些環系含有陽性氧化態的雜原子，包括吖。定鑥、苯並[a]吖啶鏃、苯並[b]吖啶鏃、苯並[c]吖啶鑔、苯並咪唑陽離子、p奎啉鏃、異喹啉鐳、喹。泰櫞、環狀取代喹啉徵、菲啶纖和會喔啉輸這樣的環系。可以通過直接或間接地將吖啶鎩或苯並吖啶鏃酯上的反應性功能基團連接選擇的抗體來製備失蹤物，這是本領域普通技術人員公知的,/咖，Weeks等，Clin.Chem.29(8):1474-1479,1983)。化合物的實例是在芳環的對位或間位存在芳基環離去基團和反應性功能基團的吖啶鏃和苯並吖啶鑔酯(#JE，*如，美國專利No.4,745,181和WO94/21823)。如在此所用的，"VEGF途徑定向治療"包括任何耙向VEGF途徑的治療，VEGF途徑包括VEGF蛋白表達的抑制(例如，反義寡核苷酸)、VEGFR激活必需的膜定位的阻止或VEGFR下遊效應物的抑制(例如，Raf絲氨酸/蘇氨酸激酶)。VEGF途徑定向治療包括多激酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、單克隆抗體和雙芳基脲。激酶抑制劑的實例是雙芳基脲索拉非尼，它是小分子並且是Raf(蛋白質-絲氨酸/蘇氨酸激酶)和VEGFR(血管內皮生長因子受體，受體酪氨酸激酶)的新雙重-作用抑制劑，因此它是腫瘤細^^曾殖和血管生成的承卩製劑(OnyxPharmaceuticals,Richmond,CA和BayerPharmaceuticalsCorporation,WestHaven，CT(USA);Lyons等,Endocrine-RelatedCancer8:219-225，2001)。此外，發現索拉非尼抑制胂瘤進展和新血管生成中涉及的集中其它受體酪氨酸激酶，包括PDGFR-p、Flt-3和c誦KIT。PD166285(Pfizer,Groton，CT),一種常規的酪氨酸激酶，可以對抗PDGF和FGF-2-介導的應答(Bansai等，J.NeuroscienceRes.74(4):486-493,2003)。其它耙向VEGF途徑的示例治療包括Sutent/SU11248,PTK787，MLN518,PKC-412,CDP860和XL9999。Sutent/SU11248(舒尼替尼蘋果酸鹽；巧l咮啉-2-酮)(Pfizer,Groton,CT),耙向受體酪氨酸激酶(RTK),包括PDGFR,具有抗血管生成和抗胂瘤效果。PDGFR通過調節周細胞(支持血管的細胞)的增殖和遷移在培養血管生成中起著重要的作用，認為Sutent/SU11248能抑制PDGFR的血管生成作用。PTK787(Novartis,Basel,Switzerland和ScheringAG,Berlin,Germany)是抗PDGFR以及抗VEGFR和c-Kit酪氨酸激酶受體的口服小分子抗血管生成劑(anilinophthalazine)(Garcia曙Echevera和Fabbro,MiniReviewsinMedicinalChemistry4(3):273-283,2004)。MLN518(之前稱為CT53518;MilleniumPharmaceuticals,Cambridge,MA)是i殳計來抑制包括PDGFR、FLT3、和c-Kit的III型受體酪氨酸激酶(RTK)的口服小分子。PKC-412[米咮妥林；N-苯曱醯-十字孢鹼(十字孢鹼的衍生物，鏈黴菌屬細菌的產物)；Novartis,Basel,Switzerland]抑制PDGFR,VEGFR和多蛋白激酶Cs,"whichmakesitespeciallyattractiveinpatientswithwild-typeKITwithmutationsinPDGFR"("什麼使得它在帶有PDGFR突變的野生型KIT的患者中特別有吸引力")(PKC412-AnInterviewwithCharlesBlanke,MD,FACP(www.gistsupport.org/pkc412.html);^7^#JSReichardt等，J,Clin.Oncol.23(16S):3016,2005)。XL999(來自Exelixis(SouthSanFrancisco,CA,USA)的幾種光語選擇性激酶抑制劑(SpectrumSelectiveKinaseInhibitors!SSKI))之一)4中制VEGFR,以及其它RTK,長口PDGFR畫j3、FGFR1和FLT3。實施例在此所述的結構、材料、組合物和方法是本發明的代表性實施例，並且理解本發明的範圍並不為實施例的範圍所限定。本領域的普通技術人員知道可以根據公開的結構、材料、組合物和方法以各種變化來實踐本發明，並且將這些變化視為在本發明的範圍內。-滋*/.於乂A*務^塔初關五Zi&4用於通過可溶性VEGF-R2ELISA分析的合適樣品包括用肝素、檸檬酸鹽或EDTA處理的人血漿。由於可能的幹擾因子，在人血清和血漿的製備和測定中需要特別的小心。在稀釋之前應當通過微量離心從樣品中除去任何的絮凝劑物質。待檢查的血清或血漿樣品的初始濃度應該是12-13%(樣品在樣品稀釋液中為1:8的稀釋度)。例如，40^1的樣品稀釋於280)li1的樣品稀釋劑中，並將100nl加入微量培養板孔中。以下ELISA實馬全方案是用於夾心ELISA(OncogeneScience,Cambridge,MA)來測量人血漿和血清中的人VEGFR-165。1、製備平板洗塗的工作溶液(IX)(作為測定試劑盒的一部分來提供)。2、對於每個樣品和標準品，通過使用乾淨的移液管尖吸移100至適當的孔中來加入預先稀釋的樣品和對照，以及六個可溶性VEGF-R2165標準品(0至8000pg/mL)中的每一個，重複兩份。將標準品0加入另一個孔中以用作底物空白的測定。3、用乾淨的塑料包裝或封膜蓋住孔。在37。C培養微量滴定板1.5小時。4、小心的移除塑料包裝或封膜。使用300^L/孔洗滌孔，平板洗滌緩衝液六次循環(洗滌三個循環，將平板翻轉180°,再洗滌另三個循環)。5、將100檢測抗體吸移至所有孔中，除了底物空白孔，其是留下空的。用新的塑料包裝片蓋住孔。在37。C培養微量滴定板1小時。6、通過將適當體積的綴合濃縮物(1:50的稀釋度)稀釋至綴合物稀釋劑中來製備工作綴合物。7、如步驟4所述清洗孔。立即進行步驟8。8、將100nL工作綴合物吸移至所有孔，除了底物空白孔，其是留下空的。用新的塑料包裝蓋住孔。在室溫(20-27。C)培養微量滴定板1小時。9、通過混合等份的溶液A和溶液B來製備工作底物。每個標準品的6mL溶液將提供12mL工作底物，足以產生一個微量滴定板。#>據所用條帶的數量來調節工作底物的體積。混合孔。10、將工作底物分配至乾淨的試劑槽中，並讓其達到室溫。11、如步驟5所述清洗孔。注意不要讓平板變幹。立即進行步驟12。12、將lOOpL工作底物吸移至所有的孔中，並用塑料包裝或封膜蓋住孔。在室溫(20-27°C)培養微量滴定板45分鐘。13、將100^L終止溶液吸移至所有孔中。14、使用分光光度平板讀數器在650nm的波長測量每個孔中的吸光度。應當在加入終止溶液後的30分鐘內對孔進行讀數。標準曲線通過使用0、150、1000、3000、5000和8000pg/ml6個不同濃度的可溶性VEGF-R2標準品(例如，重組人可溶性VEGF-R2)構建標準曲線來進行定量分析。人血清和血漿樣品在用索拉非尼治療前，從證實腎細胞癌的患者獲得冷凍血漿樣品。々薩勿應膚J者的A《依照製造商的指導使用可溶性VEGF-R2ELISA(R&DSystems,Minneapolis,MN)將一式兩份的樣品用來測量可溶性VEGF-R2水平。對於每個患者，測定一式兩份的測量值的平均值。對於使用索拉非尼治療的患者組和使用安慰劑治療的患者組，表1中給出了三個時間點的可溶性VEGF-R2的平均水平，三個時間點是基線(預治療)，第1個周期第21天和第3個周期第1天。圖l中顯示了相同的數據。結果表明索拉非尼治療的患者組在兩個時間點具有從基線顯著降低的可溶性VEGF-R2水平(使用配對t檢驗，p<0.05)。表1:可溶性VEGFR-2tableseeoriginaldocumentpage22為了說明和描述的目的，已經呈現了本發明之前描述的實施方案。但是這不意味著是窮舉或限制所公開的精確形式，同時根據以上的教導顯然可有很多改進和變化。為了解釋本發明的原理，選擇和描述了實施方案，並且它的實踐因此能夠使本領域技術人員可以在不同的實施方案中以不同的改進來利用本發明，以此適於所考慮的特定用途。將在此引用的所有參考文獻引入作為參考。權利要求1.監控患者體內與可溶性VEGF-R2途徑相關病況，和/或監控患有所述疾病的患者如何應答治療的方法，所述方法包括在免疫上檢測並定量隨著時間抽取的患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質水平的連續改變，其中可溶性VEGF-R2蛋白質隨時間的遞增水平表明疾病進展或對所述治療的負面應答，並且其中可溶性VEGF-R2蛋白隨時間的遞減水平表明疾病減輕或對所述治療的正面應答。2.權利要求1的方法，其中所述治療選自多激酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制、單克隆抗體和雙芳基脲。3.權利要求l的方法，其中所述治療是VEGF途徑定向治療。4.權利要求3的方法，其中所述VEGF途徑定向治療是酪氨酸激酶抑制劑曱磺酸伊馬替尼或雙芳基脲索拉非尼。5.權利要求l的方法，其中所述疾病是腫瘤發生前/腫瘤疾病。6.權利要求5的方法，其中所述腫瘤發生前/腫瘤疾病選自轉移性成神經管細胞瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、胃腸間質腫瘤、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、甲狀腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細胞癌、惡性血液病和導致上述癌症的初期癌。7.權利要求1的方法，其進一步是所述疾病的預後，其中患者樣品中的所述可溶性VEGF-R2蛋白水平表示所述患者更好或更差的預後。8.權利要求7的方法，其中所述預後是選自應答率(RR)、完全應答(CR)、部分應答(PR)、穩定疾病(SD)、進展時間(TTP)、無進展生存(PFS)、總生存率(OS)和臨床益處的臨床結果，臨床益處包括完全應答(CR)、部分應答(PR)和穩定疾病(SD)。9.權利要求l的方法，其中所述患者樣品是預治療樣品。10.權利要求1的方法，其中所述的患者樣品選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、精液、乳汁、腦脊髓液、淚液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜積液、羊水、膀胱沖洗液和支氣管肺泡灌洗液。11.權利要求l的方法，其中所述患者樣品是血清或血漿。12.權利要求1的方法，其中所述免疫檢測和定量是通過夾心ELISA或等價測定形式的免疫測定來實現的。13.權利要求12的方法，其中夾心ELISA或等價測定包括使用一種或多種選擇性結合可溶性VEGF-R2蛋白的單克隆體抗體。14.權利要求1的方法，進一步包括使用免疫測定來檢測或檢測並定量患者樣品中的一種或多種其他蛋白質的水平。15.權利要求14的方法，其中所述的其他蛋白是選自抑制劑、癌蛋白、生長因子受體、血管生成因子、轉移蛋白、胂瘤標記和胂瘤抑制劑的一種或多種。16.權利要求15的方法，其中所述抑制劑是金屬蛋白酶-1(TIMP-1)的組織抑制劑，所述癌蛋白選自HER-2/neu和rasp21,所述生長因子受體選自表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生的生長因子受體a(PDGFR-a),所述血管生成因子是血管內皮生長因子(VEGF),所述轉移蛋白是尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA),所述肺瘤標記是癌胚抗原(CEA),以及所述腫瘤抑制劑是p53。17.患病的人患者的治療選擇的方法，所述方法包括(a)免疫檢測和定量取自對照群體個體的對照樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質的平均水平；(b)免疫檢測和定量隨時間取自患者的相等患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質水平的連續變化；(c)比較患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白的水平和對照樣品中可溶性VEGF-R2蛋白的平均水平；和(d)根據患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質水平和對照樣品中可溶性VEGF-R2蛋白的平均水平之間的差異，並且考慮到患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質水平的連續變化，決定是否使用常規治療和/或VEGF途徑定向治療來治療患者。18.權利要求17的方法，其中所述患者樣品是預治療樣品。19.權利要求17的方法，其進一步是所述疾病的預後，其中患者樣品中的所述可溶性VEGF-R2蛋白水平表示所述患者更好或更差的預後。20.權利要求19的方法，其中所述預後是選自應答率(RR)、完全應答(CR)、部分應答(PR)、穩定疾病(SD)、進展時間(TTP)、無進展生存(PFS)、總生存率(OS)和臨床益處的臨床結果，臨床益處包括完全應答(CR)、部分應答(PR)和穩定疾病(SD)。21.權利要求17的方法，其中所述疾病是腫瘤發生前/腫瘤疾病。22.權利要求21的方法，其中所述腫瘤發生前/腫瘤疾病選自轉移性成神經管細胞瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、胃腸間質腫瘤、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、曱狀腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細胞癌、惡性血液病和導致上述癌症的初期癌。23.權利要求17的方法，其中患者樣品是來自對治療無應答的癌症患者。24.權利要求17的方法，進一步包括使用免疫測定來檢測或檢測並定量患者樣品中一種或多種其他蛋白質的水平。25.權利要求24的方法，其中所述的其他蛋白是選自抑制劑、癌蛋白、生長因子受體、血管生成因子、轉移蛋白、腫瘤標記和腫瘤抑制劑的一種或多種。26.權利要求25的方法，其中所述抑制劑是金屬蛋白酶-1(TIMP-1)的組織抑制劑，所述癌蛋白選自包含HER-2/neu和rasp21，所述生長因子受體選自表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生的生長因子受體a(PDGFR-a),所述血管生成因子是血管內皮生長因子(VEGF),所述轉移蛋白是尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA),所述腫瘤標記是癌胚抗原(CEA),以及所述腫瘤抑制劑是p53。27.檢測患者與VEGF相關疾病的診斷方法，所述方法包括(a)免疫檢測和定量取自對照群體個體的對照樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質的平均水平；(b)免疫檢測和定量隨時間取自患者的患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白質水平的連續變化；(c)比較患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白水平和對照樣品中可溶性VEGF-R2蛋白的平均水平；其中患者樣品中可溶性VEGF-R2蛋白水平超過對照樣品中可溶性VEGF-R2蛋白的平均水平表示患者體內激活的VEGF途徑和疾病的存在。28.權利要求27的方法，其中所述步驟(a)和(b)的免疫^r測和定量是通過夾心ELISA或等價測定形式的免疫測定來實現的。29.權利要求27的方法，其進一步是所述疾病的預後，其中患者樣品中的所述可溶性VEGF-R2蛋白水平表示所述患者更好或更差的預後。30.權利要求29的方法，其中所述預後是選自應答率(RR)、完全應答(CR)、部分應答(PR)、穩定疾病(SD)、進展時間(TTP)、無進展生存(PFS)、總生存率(OS)和臨床益處的臨床結果，臨床益處包括完全應答(CR)、部分應答(PR)和穩定疾病(SD)。31.權利要求27的方法，其中所述疾病是腫瘤發生前/腫瘤疾病。32.權利要求31的方法，其中所述腫瘤發生前/腫瘤疾病選自轉移性成神經管細胞瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、胃腸間質胂瘤、結腸直腸癌、結腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、曱狀腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細胞癌、惡性血液病和導致上述癌症的初期癌。33.權利要求27的方法，進一步包括使用免疫測定來檢測或檢測並定量患者樣品中一種或多種其他蛋白質的水平。34.權利要求33的方法，其中所述的其他蛋白是選自抑制劑、癌蛋白、生長因子受體、血管生成因子、轉移蛋白、腫瘤標記和腫瘤抑制劑的一種或多種。35.權利要求34的方法，其中所述抑制劑是金屬蛋白酶-1(TIMP-1)組織抑制劑，所述癌蛋白選自包含HER-2/neu和rasp21,所述生長因子受體選自表皮生長因子受體(EGFR)和血小板衍生的生長因子受體a(PDGFR-a)，所述血管生成因子是血管內皮生長因子(VEGF)，所述轉移蛋白是尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA),所述腫瘤標記是癌胚抗原(CEA),以及所述胂瘤抑制劑是p53。全文摘要本發明涉及生物標記和生物標記用於癌症的預測和預後的用途，以及生物標記用於監控癌症治療效果的用途。特別地，本發明涉及可溶性VEGF-R2作為多激酶抑制劑的生物標記的用途。文檔編號G01N33/574GK101351708SQ200680049920公開日2009年1月21日申請日期2006年11月1日優先權日2005年11月2日發明者D·比格伍德,J·J·埃爾廷,P·J·哈默,W·P·卡尼申請人:拜爾健康護理有限責任公司