外切酶－納米孔的單分子核酸測序方法
2023-06-10 20:51:21 2
專利名稱：外切酶－納米孔的單分子核酸測序方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的測定方法，特別是一種外切酶—納米孔的單分子核酸測序方法。
背景技術：
隨著後基因組世代的到來，對DNA和RNA等生物大分子序列測定的需求量大量增加，但目前的測序方法速度慢、費用高、有缺口，嚴重妨礙了相關學科的發展，如基因組測序，2006年6月NCBI公布的結果，已完成真核生物基因組測序的21個，完成組裝的100個，正在進行的164個。實際上，這僅僅是拉開了大量基因組測序的序幕，因為對基因組測序的需要是多方面的。但是，用目前的方法滿足上述多種測序的需求，還很不現實，主要是當前的方法存在許多缺陷，可簡單地歸結為速度慢、費用高和有大量缺口。所以，要實現上述各種「夢想」，必須研發新的測序技術以替代當前的測序方法。
經對現有文獻檢索發現，Astier，Y.et al.，(2006)Toward singlemolecule DNA sequencingDirect identification of ribonucleoside anddeoxyribonucleoside 5』-monophosphates by using an engineered proteinnanopore equipped with a molecular adapter.Journal of the AmericanChemical Society 1281705-1710。在《美國化學協會雜誌》以「朝向單分子DNA測序用適配分子工程化蛋白納米孔直接鑑別核苷和脫氧核苷5』一磷酸鹽」為題，報導了其研究結果。認為，通過檢測外切酶降解而釋放的核苷5』一磷酸有可能對核酸單分子測序，用工程化的α-蛋白孔識別核苷和脫氧核苷5』一磷酸鹽，準確率為93-98％。因採用的是蛋白質納米孔，不能耐受較高的電壓、易老化，錯誤率太高，還不能用於測序。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種外切酶—納米孔的單分子核酸測序方法。使其測定核酸(包括DNA和RNA)序列，測定速度快、測定質量高、測定費用低、基本不留缺口，可滿足以DNA序列為基礎的動植物及微生物的遺傳改良、有害微生物的控制和各種生物基因組的大規模核酸測序的各種需求。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟①單核苷酸的電信號檢測，建立標準曲線；所述的單核苷酸的電信號檢測，是將電泳槽加入電泳液，在電泳槽中間，用帶有單個納米孔(直徑1-2nm，孔深在1-20μm)薄膜的傳感器將兩級隔開，分別檢測磷酸基團位置固定3』或者5』脫氧腺苷—磷酸dAMP、脫氧鳥苷一磷酸dGMP、脫氧胞苷一磷酸dCMP和脫氧胸苷一磷酸dTMP，4種脫氧核苷一磷酸(dNMPs)、dmetCMP(甲基化脫氧胞苷一磷酸)或腺苷一磷酸rAMP、鳥苷一磷酸rGMP、胞苷一磷酸rCMP和尿苷一磷酸rUMP，4種核苷一磷酸(rNMPs)在穿越納米孔時留下的電信號，由於不同的核苷酸dNMPs或rNMPs(簡稱nt)的分子量和三維結構的差異，當穿越筒型納米孔時，它們穿越納米孔的時間(實驗條件控制在約1000個穿越事件/秒)以及對離子流的阻力也各異，因此用膜片鉗檢測電信號時，將電信號轉換為各自的「筆跡」，並建立標準曲線。
②膜片鉗檢測電信號；所述的膜片鉗檢測電信號，在負極，將1條雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA(以下統稱靶核酸)的3』或5』端固定，用每次只降解1個核苷酸、核苷酸降解物上磷酸基團位置固定、每秒降解約1000個核苷酸、延續性長的雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA外切酶(以下統稱外切酶)降解靶核酸，在外加電場作用下，降解產物按它們在原靶核酸中的相對位置，有序地自負極向正極移動過程中穿越納米孔，膜片鉗檢測電信號。
③根據標準曲線，將電信號轉換為具體的核苷酸，並根據外切酶的切割方向，獲得靶核酸的鹼基序列。
所述的根據標準曲線，將電信號轉換為具體的核苷酸，是指將一個核酸分子固定於電泳槽負極，用外切酶從自由端逐個降解並釋放核苷酸，在外加電場作用下，核苷酸有序地自負極向正極移動時穿越納米孔，膜片鉗記載各核苷酸的筆跡，根據標準曲線將電信號轉換為鹼基，再根據外切酶的切割方向，實現核酸的單分子測序。
所述的標準曲線，採用一根單壁碳納米管包埋於聚合物中的薄膜直徑和孔深作為二維可控的單孔傳感器，在外加電場作用下，膜片鉗檢測各種核苷和脫氧核苷5』(或3』)一磷酸自負極向正極移動過程中穿越納米孔時產生的電信號(穿孔時間和產生的電阻)，將各種鹼基的筆跡分開，建立標準曲線。
上述的每一個納米孔作為一個測序單元，將該單元組裝成陣列(如10×100或100×100)，構成高通量測序儀。
如果核酸為dsDNA(雙鏈DNA)，測序後還可用ssDNA(單鏈DNA)外切酶對其互補鏈測序，進一步提高測序的準確性，此外，還可通過對甲基化脫氧胞苷(dmetC)一磷酸筆跡的識別，為高等生物來源於不同組織器官細胞的DNA甲基化模式研究提供新的診斷工具。
本發明採用的是直徑和孔深均可控制的單壁碳納米管(SWCNT)包埋於多聚物的筒型單納米孔，硬度高、表面光潔、無靜電，可耐受較高的電壓、更經久耐用、信噪比更高，所以，對核苷和脫氧核苷一磷酸的識別準確性更高，本發明不僅可檢測核苷和脫氧核苷5』一磷酸，還可以檢測3』一磷酸，而且還可檢測天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。
圖1.本發明測序示意圖具體實施方式
實施例1DNA片段測序①dNMPs筆跡的檢測將兩級與膜片鉗連接的電泳槽中加入電泳液，用直徑和孔深可控的納米元件從中間將電泳槽隔開，每次只加入一種超稀釋的核苷酸，打開電源記載單個核苷酸穿越納米孔時的電信號；如此對各類核苷酸的穿孔電信號進行檢測，最後確定各自特異的筆跡，建立標準曲線，並編寫軟體。
②計算核苷酸的泳動速度，求出鹼基序列的外切酶最遠作用點；當每次上述檢測結束時，將正負電極相互轉換，使聚集在原正極的核苷酸向新的正極泳動，計算電極轉換至核苷酸到達納米孔的時間，獲得特定條件下它們在電泳液中的泳動速度，求出在確保外切酶產物達到納米孔時仍保留原靶核酸的鹼基序列的外切酶最遠作用點。
③單分子操作採用磁珠捕獲法；1.將單細胞破壁後提取DNA，再經超聲波破碎為大片段DNA備用；將抗生物素包衣的磁珠按Margulies等(Genome sequencing in microfabricatedhigh-density picolitre reactors.2005，Nature 437376-380.刊物名稱自然；題目「在微型製作的高密度皮升反應器中的基因組測序」)的方法與長度、序列已知和末端用生物素標記的DNA片段按1∶1連接，即每個磁珠只連接1個片段；連接在磁珠上的DNA片段與靶核酸片段用連接酶連接，顯微獲取單個磁珠。
④單分子DNA片段的固定將帶有1個靶核酸分子的磁珠固定到安裝在一個測序單元電泳槽負極端的磁鐵上，磁鐵與納米孔的距離不超過步驟②中所稱的外切酶最遠作用點，將一條靶核酸一端固定，最後使整個陣列的每一個測序單元都有一條靶核酸。
⑤序列檢測在電泳槽負極添加外切酶，待單個酶分子與DNA結合後，添加鎂離子，立即打開電源，收集電信號，並用軟體讀取DNA序列，完成序列組裝。
⑥互補鏈序列的檢測待dsDNA外切酶降解結束後，再用ssDNA外切酶降解剩下的ddDNA互補鏈，如果降解dsDNA的外切酶為5』→3』，則需選用3』→5』ddDNA外切酶，反之亦然。此次檢測互補鏈，除可與上一步測序結果相互印證外，在不能直接檢測dmetCMP筆跡是，還可通過此步驟檢測DNA中胞苷的甲基化狀態。
效果在目前儀器的分辨能力下(1個事件/毫秒)，適於本發明的外切酶活性以500-1000nts/秒為宜，即每個測序單元每秒檢測500-1000個鹼基序列，每小時最快檢測360kb(千鹼基對)。
高通量核酸測序儀的測序速度＝陣列中的測序單元數×測序單元測序速度，如果是100×100陣列，則測序儀的測序最高速度為3600mb(百萬鹼基對)，也即人類的8C(單倍體細胞基因組大小)基因組可在7小時以內完成測序，費用在1萬元以內，測序準確性在99％以上，還能檢測高等生物不同組織器官來源細胞的甲基化狀態。
實施例2完整染色體測序①單分子操作本例中的核苷酸筆跡檢測、外切酶最遠作用點同實施例1。
用顯微鏡、流式細胞儀或其他方法輔助，提取單條染色體，按實施例1的方法將染色體固定在磁珠上。
②染色體固定將帶有1條完整染色體的磁珠固定到安裝在一個測序單元電泳槽負極端的磁鐵上，磁鐵與納米孔的距離不超過外切酶最遠作用點，最後使整個陣列的每一個測序單元都有一條染色體。
③序列檢測在電泳槽負極添加核酸外切酶，待單個酶分子與DNA結合後，添加鎂離子，立即打開電源，收集電信號，並用軟體讀取DNA序列。
④互補鏈序列的檢測同實施例1。
效果以整條染色體為底物進行測序，雖然陣列的作用得不到像實施例1那樣的充分發揮如人類體細胞有46條染色體，因此只有46個測序單元的陣列就可滿足測序，人類最長的第一染色體約245,203,898bp(鹼基對)，在外切酶活性為1000nts/秒，約需680小時，雖然速度會下降，但最後的序列無需拼接和組裝，可解決當前測序方法中存在的缺口問題。
實施例3RNA測序①rNMPs筆跡的檢測同實施例1，根據它們產生的特異電信號建立標準曲線。
②按照實施例1的方法將RNA單分子固定到電泳槽負極，用RNA外切酶逐個降解核苷酸，膜片鉗記載筆跡，根據標準曲線將電信號轉換為序列信息。
③亦可以RNA為模板，通過反轉錄酶合成cDNA(互補DNA)，再按實施例1的步驟獲得RNA的序列。
實施效果適於本發明的RNA/DNA外切酶活性在1000nts/秒為宜，如檢測mRNA序列，按mRNA平均長度1000nts計，100×100的陣列，即每秒可完成10000個mRNA或cDNA序列的測定。
權利要求
1.一種外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特徵在於，包括如下步驟①單核苷和脫氧核苷一磷酸以及dmetCMP的電信號檢測，建立標準曲線；②DNA/RNA的酶切，單個核苷和脫氧核苷一磷酸穿越納米孔，膜片鉗記載電信號；③根據標準曲線，將電信號轉換為具體的核苷酸，結合外切酶的切割方向，獲得靶核酸的鹼基序列。
2.根據權利要求1所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特徵是，所述的單核苷酸的電信號檢測，電泳槽加入電泳液，在電泳槽中間，用帶有單個納米孔薄膜的傳感器將兩級隔開，分別檢測磷酸基團位置固定3』或者5』脫氧腺苷一磷酸dAMP、脫氧鳥苷一磷酸dGMP、脫氧胞苷一磷酸dCMP和脫氧胸苷一磷酸dTMP4種脫氧核苷一磷酸(dNMPs)、dmetCMP(甲基化脫氧胞苷一磷酸)或腺苷一磷酸rAMP、鳥苷一磷酸rGMP、胞苷一磷酸rCMP和尿苷一磷酸rUMP等4種核苷一磷酸(rNMPs)在穿越納米孔時留下的電信號，由於不同的核苷酸dNMPs或rNMPs的分子量和三維結構的差異，當穿越筒型納米孔時，將給出不同的電信號，用膜片鉗記載電信號，將電信號轉換為各自的「筆跡」，並建立標準曲線。
3.根據權利要求2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特徵是，所述的單個納米孔，其直徑1-2nm，孔深在1-20μm。
4.根據權利要求2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特徵是，所述的穿越筒型納米孔，穿越時間的實驗條件控制在平均穿越1000nts/秒，符合當前膜片鉗的解析度。
5.根據權利要求1所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特徵是，所述的膜片鉗檢測電信號，在負極，將靶核酸1條雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA的3』或5』端固定，用每次只降解1個核苷酸、核苷酸降解物上磷酸基團位置固定、每秒降解約500-1000個核苷酸、延續性長的雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA外切酶降解靶核酸，在外加電場作用下，降解產物按它們在原靶核酸中的相對位置，有序地自負極向正極移動過程中穿越納米孔時，膜片鉗檢測電信號。
6.根據權利要求1或者2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特徵是，所述的標準曲線，採用一根單壁碳納米管包埋於聚合物中的薄膜直徑和孔深作為二維可控的單孔傳感器，在外加電場作用下，膜片鉗檢測各種核苷酸和脫氧核苷酸5』(或3』)一磷酸自負極向正極移動過程中穿越納米孔時產生穿孔時間和產生的電阻的電信號，將各種鹼基的筆跡分開，建立標準曲線。
7.根據權利要求1或者2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特徵是，所述的根據標準曲線，將電信號轉換為具體的核苷酸，是指將一個核酸分子固定於電泳槽負極，用核酸外切酶從自由端逐個降解並釋放核苷酸，在外加電場作用下，核苷酸有序地自負極向正極移動時穿越納米孔，膜片鉗記載各核苷酸的筆跡，根據標準曲線將電信號轉換為鹼基序列，實現核酸的單分子測序。
8.根據權利要求2或者3或者4所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特徵是，所述的納米孔，每一個納米孔作為一個測序單元，將該單元組裝成陣列。
9.根據權利要求1或者2或者5所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特徵是，如果核酸為dsDNA，測序後還可用ssDNA外切酶對其互補鏈測序。
全文摘要
本發明涉及的是一種生物技術領域的外切酶－納米孔的單分子核酸測序的方法。包括如下步驟①單分子核苷酸的電信號檢測，建立標準曲線；②將核酸固定在電泳槽負極，外切酶逐個降解核苷酸，穿越納米孔時，膜片鉗檢測電信號；③根據標準曲線，將電信號轉換為具體的核苷酸，根據外切酶的切割方向，獲得靶核酸的鹼基序列。本發明採用的是直徑和孔深均可控制的單壁碳納米管包埋於多聚物的筒型單納米孔，硬度高、表面光潔、無靜電，可耐受較高的電壓、更經久耐用、信噪比更高，所以，對核苷和脫氧核苷一磷酸的識別準確性更高，本發明不僅可檢測核苷和脫氧核苷5』一磷酸，還可檢測核苷和脫氧核苷3』一磷酸，而且還可檢測天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。
文檔編號C12Q1/68GK1932039SQ20061011629
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月21日 優先權日2006年9月21日
發明者王志民 申請人:上海交通大學