大瀧六線魚細胞系的構建方法
2023-07-02 07:19:21 3
專利名稱：大瀧六線魚細胞系的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞系的構建方法，特別是一種大瀧六線魚細胞系的構建方法。
背景技術：
大瀧六線魚^fera^ra^ms otakii又稱歐式六線魚，俗名黃魚，屬近海冷溫性底層魚類，在我國黃、渤海以及日本、朝鮮和俄羅斯遠東諸海都有分布，其肉味鮮美，肉質細嫩， 有「北方石斑」之稱。大瀧六線魚適應能力強，耐低溫，又有性成熟早和世代交替快的生物學特徵，棲息於近海巖礁和島嶼附近，洄遊活動範圍小，因此是礁灣養殖的理想魚種。近年來，對大瀧六線魚的市場需求日益增大，野生大瀧六線魚種群數量遠遠不能滿足供應，其海水養殖業有待發展。大瀧六線魚細胞系的建立能滿足大瀧六線魚病毒學、病理學、毒理學、 免疫學、遺傳育種和種質保存等理論研究以及病毒疫苗研製等應用研究的需要。
發明內容
本發明的目的是提供一種步驟簡單、易操作的大瀧六線魚細胞系的構建方法，以滿足對大瀧六線魚理論研究以及病毒疫苗研製等應用研究的需要。本發明的大瀧六線魚細胞系的構建方法，包括如下步驟 ⑴、製備細胞培養液
選擇DMEM/F12培養基，向培養基內分別加入胎牛血清、人鹼性成纖維細胞生長因子、I 型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清佔總體積的20%，人鹼性成纖維細胞生長因子的濃度為5ng/ml，I型胰島素樣生長因子的濃度為40ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為20ug/ ml ；
在4°C的環境下存放； ⑵、原代培養
在超淨工作檯上取大瀧六線魚的組織，用青黴素和鏈黴素的混合液進行浸泡處理，青黴素的濃度為100IU/ml，鏈黴素的濃度為lOOug/ml，處理時間為30分鐘；再用PBS漂洗後， 於少量5%FBS-DMEM/F12 (Ph7. 2)中剪成0. 8 1. 2mm3的塊狀，經上述處理的組織塊均勻接種於25cm2細胞培養瓶中，加入培養液3 ml，在25°C CO2培養箱中啟動原代培養； ⑶、傳代培養
待細胞長成單層後，吸出培養瓶中的培養液，加入0. 25%的胰蛋白酶溶液lml，消化 lmin，細胞変圓後，吸去胰蛋白酶溶液，將之前吸出的舊培養液加回，用吸管吹打培養瓶底， 製成細胞懸液；向細胞懸液內補入新的培養液，細胞懸液與培養液的體積比為1:2，然後接種於兩個培養瓶內；在2510)2培養箱中培養。待細胞再次長成單層後，仍按照上述方法進行傳代。本發明的大瀧六線魚細胞系的構建方法，其中所述的原代培養步驟還需對塊狀組織用0. 5%透明質酸酶和0. 2%11型膠原酶聯合消化30min。本發明的大瀧六線魚細胞系的構建方法，工藝步驟簡單，操作容易；所構建的大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟組織細胞系(HOF、H0L、Η0Κ)形態均為纖維樣，可以連續傳代並直接應用於病原特性研究、疫苗研製及功能基因研究，滿足了對大瀧六線魚理論研究以及病毒疫苗研製等應用研究的需要；該構建方法也適用於其他魚類構建魚鰭、吻端和腎臟的細胞系。
具體實施例方式實施例1
⑴、製備細胞培養液
選擇Hyclone公司的DMEM/F12培養基，向培養基內分別加入胎牛血清、人鹼性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清佔總體積的20%，人鹼性成纖維細胞生長因子的濃度為5ng/ml，I型胰島素樣生長因子的濃度為40ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為20ug/ml ； 在4°C的環境下存放； ⑵、原代培養
在超淨工作檯上取大瀧六線魚的魚鰭組織，用青黴素和鏈黴素的混合液進行浸泡處理，青黴素的濃度為100IU/ml，鏈黴素的濃度為lOOug/ml，處理時間為30分鐘；再用PBS漂洗後，於少量5%FBS-DMEM/F12 (Ph7. 2)中剪成0. 8 1. 2mm3的塊狀，再用0. 5%透明質酸酶和0. 2%11型膠原酶對塊狀魚鰭組織聯合消化30min ；
經上述處理的組織塊均勻接種於25cm2細胞培養瓶中，加入培養液3 ml，在2510)2培養箱中啟動原代培養； ⑶、傳代培養
待細胞長成單層後，吸出培養瓶中的培養液，加入0. 25%的胰蛋白酶溶液lml，消化 lmin，細胞変圓後，吸去胰蛋白酶溶液，將之前吸出的舊培養液加回，用吸管吹打培養瓶底， 製成細胞懸液；向細胞懸液內補入新的培養液，細胞懸液與培養液的體積比為1:2，然後接種於兩個培養瓶內；在2510)2培養箱中培養。待細胞再次長成單層後，仍按照上述方法進行傳代。實施例2
⑴、製備細胞培養液
選擇Hyclone公司的D M E M /F12培養基，向培養基內分別加入胎牛血清、人鹼性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清佔總體積的20%，人鹼性成纖維細胞生長因子的濃度為5ng/ml，I型胰島素樣生長因子的濃度為405ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為20ug/ml ； 在4°C的環境下存放； ⑵、原代培養
在超淨工作檯上取大瀧六線魚的吻端組織，用青黴素和鏈黴素的混合液進行浸泡處理，青黴素的濃度為100IU/ml，鏈黴素的濃度為lOOug/ml，處理時間為30分鐘；再用PBS漂洗後，於少量5%FBS-DMEM/F12 (Ph7. 2)中剪成0. 8 1. 2mm3的塊狀，再用0. 5%透明質酸酶和0. 2%11型膠原酶對塊狀魚鰭組織聯合消化30min ；
經上述處理的組織塊均勻接種於25cm2細胞培養瓶中，加入培養液3 ml，在2510)2培養箱中啟動原代培養； ⑶、傳代培養
待細胞長成單層後，吸出培養瓶中的培養液，加入0. 25%的胰蛋白酶溶液lml，消化 lmin，細胞変圓後，吸去胰蛋白酶溶液，將之前吸出的舊培養液加回，用吸管吹打培養瓶底， 製成細胞懸液；向細胞懸液內補入新的培養液，細胞懸液與培養液的體積比為1:2，然後接種於兩個培養瓶內；在2510)2培養箱中培養。待細胞再次長成單層後，仍按照上述方法進行傳代。實施例3
⑴、製備細胞培養液
選擇Hyclone公司的D M E M /F12培養基，向培養基內分別加入胎牛血清、人鹼性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清佔總體積的20%，人鹼性成纖維細胞生長因子的濃度為5ng/ml，I型胰島素樣生長因子的濃度為405ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為20ug/ml ； 在4°C的環境下存放； ⑵、原代培養
在超淨工作檯上取大瀧六線魚的腎臟組織，用5%FBS-DMEM/F12(W!7. 2)漂洗一次後剪成0. 8 1. 2mm3的塊狀；(內臟組織可不用雙抗和聯合消化處理)。經上述處理的組織塊均勻接種於25cm2細胞培養瓶中，加入培養液3 ml，在 250C CO2培養箱中啟動原代培養；
⑶、傳代培養
待細胞長成單層後，吸出培養瓶中的培養液，加入0. 25%的胰蛋白酶溶液lml，消化 lmin，細胞変圓後，吸去胰蛋白酶溶液，將之前吸出的舊培養液加回，用吸管吹打培養瓶底， 製成細胞懸液；向細胞懸液內補入新的培養液，細胞懸液與培養液的體積比為1:2，然後接種於兩個培養瓶內；在2510)2培養箱中培養。待細胞再次長成單層後，仍按照上述方法進行傳代。對上述構建的細胞凍存與復甦
配置Iml細胞凍存保護液分別取0. 2mlFBS, 0. 6ml DMEM/F12和0. 2mlDMS0,混勻置於 4°C冰箱內備用。細胞凍存取同一代數的處於對數生長期的細胞，經上述胰酶消化後收穫細胞， IOOOrpm離心lOmin，棄掉上清液。向細胞沉澱中加入已配置好的的Iml凍存保護液，重懸， 調整細胞濃度至IX IO6個/ml，將細胞懸液轉移到無菌凍存管中，並按一下程序降溫4°C 冰箱中放置30min、-20°C冰箱放置lh、_80°C冰箱過夜，最後放入液氮(_196°C )中長期保存。細胞復甦將水浴鍋溫度分別調至40°C和25°C，迅速把細胞凍存管從液氮罐中取出，放入40°C水浴中，待細胞凍存液融化後轉入25°C水浴中。然後無菌條件下將細胞凍存管中細胞懸液轉移至IOml離心管中，並加入等量DMEM/F12培養液，IOOOrpm離心lOmin，去上清，收集細胞。用培養液重懸細胞，並轉移到細胞培養瓶中，25°C CO2培養箱中培養，1 後全量換培養液，繼續進行培養，4-5天後細胞即可長成單層。
權利要求
1.一種大瀧六線魚細胞系的構建方法，其特徵在於包括如下步驟⑴、製備細胞培養液選擇DMEM/F12培養基，向培養基內分別加入胎牛血清、人鹼性成纖維細胞生長因子、I 型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，使胎牛血清佔總體積的20%，人鹼性成纖維細胞生長因子的濃度為5ng/ml，I型胰島素樣生長因子的濃度為40ng/ml，硫酸軟骨素的濃度為20ug/ ml ；在4°C的環境下存放；⑵、原代培養在超淨工作檯上取大瀧六線魚的組織，用青黴素和鏈黴素的混合液進行浸泡處理，青黴素的濃度為100IU/ml，鏈黴素的濃度為lOOug/ml，處理時間為30分鐘；再用PBS漂洗後， 剪成0. 8 1. 2mm3的塊狀，經上述處理的組織塊均勻接種於25cm2細胞培養瓶中，加入培養液3 ml，在25°C CO2培養箱中啟動原代培養；⑶、傳代培養待細胞長成單層後，吸出培養瓶中的培養液，加入0. 25%的胰蛋白酶溶液lml，消化 lmin，細胞変圓後，吸去胰蛋白酶溶液，將之前吸出的舊培養液加回，用吸管吹打培養瓶底， 製成細胞懸液；向細胞懸液內補入新的培養液，細胞懸液與培養液的體積比為1:2，然後接種於兩個培養瓶內；在25°C CO2培養箱中培養；待細胞再次長成單層後，仍按照上述方法進行傳代。
2.根據權利要求1所述的大瀧六線魚細胞系的構建方法，其特徵在於所述的原代培養步驟還需對塊狀組織用0. 5%透明質酸酶和0. 2%11型膠原酶聯合消化30min。
全文摘要
本發明公開了一種大瀧六線魚細胞系的構建方法，包括如下步驟⑴選擇DＭＥＭ/F12培養基，並加入胎牛血清、人鹼性成纖維細胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素製備細胞培養液，在4℃的環境下存放；⑵在超淨工作檯上取大瀧六線魚的組織進行雙抗和漂洗處理，在培養瓶中進行原代培養；⑶待細胞長成單層後製成細胞懸液並加入培養液進行傳代培養。本發明的方法，步驟簡單，易操作；構建的大瀧六線魚鰭、吻端和腎臟組織細胞系形態為纖維樣，可以連續傳代並直接應用於病原特性研究、疫苗研製及功能基因研究，滿足了對大瀧六線魚理論研究及病毒疫苗研製等應用研究的需要；該構建方法也適用於其他魚類構建魚鰭、吻端和腎臟的細胞系。
文檔編號C12N5/071GK102492650SQ20111037759
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者姜志強, 李霞, 秦豔傑, 郭瑩 申請人:大連海洋大學