磁共振、螢光雙顯影納米凝膠探針及其製備方法與流程

2023-07-02 16:43:31 1

本發明涉及一種功能性納米凝膠探針及其製備方法，具體是一種磁共振螢光雙顯影功能性納米凝膠探針及其製備方法,屬於生物醫用材料技術領域。

背景技術：

納米凝膠的粒徑小，有較大的比表面積，很強的吸附性和生物活性，且穩定性良好，易於在肝臟和淋巴系統匯聚而具有靶向性。納米凝膠容易通過細胞膜進入細胞，可以實現藥物和DNA、RNA等的輸送，並可保護藥物及所載物質，提高運送效率和生物利用度，被廣泛應用於生物醫學領域。因此，對功能性納米凝膠載體在生物體內的運行軌跡、藥物釋放部位、釋放方式、治療效果等進行精確的監測具有十分重要的意義。

然而，由於生物組織對光的高散射和高吸收的制約，傳統的光學成像技術已難以達到要求。近紅外螢光探針具有較大的組織穿透距離，且在650-1000nm的波段範圍內生物組織的自發螢光幹擾較為微弱，使得在一定深度的組織內可獲得較好的近紅外螢光信號，提高細胞顯影的準確性，且相比傳統螢光探針，可降低對生物組織造成的光損傷。文獻(Zhou S,Min X，Dou H,et al.Facile fabrication of dextran-based fluorescent nanogels as potential glucose sensors[J].Chemical Communications,2013,49:9473-9475)公開了一種螢光探針的製備方法，在氮氣保護下，依次加入引發劑、單體、交聯劑後透析得到納米凝膠，最後加入3HF-AM螢光分子製備成螢光顯影探針。但是近紅外顯影的顯示解析度低。

MRI顯影是另外一類廣泛應用的生物醫學顯影方式，文獻(Darras V,Nelea M,Winnik F M,et al.Chitosan modified with gadolinium diethylenetriaminepenta acetic acid for magnetic resonance imaging of DNA/chitosan nanoparticles[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(4):1137-1146.)公開了一種製備磁共振顯影探針的方法，通過在納米粒子中加入螯合有釓離子的DTPA的方法，將核磁顯影試劑連接至殼聚糖納米粒子之上形成磁共振顯影探針。磁共振顯影雖然能夠提供高分辨的組織信息以及三維成像結構，但是其靈敏度和靶向性較差，在臨床應用中受到限制。

現有探針都只具備單功能顯影能力，無法同時實現兩種顯影方式，因此無法積聚兩種顯影方式的優勢於一身。若將兩者結合，製備兼具近紅外光和MRI雙顯影性能的顯影探針，則可實現磁共振顯影的高解析度與光學顯影形成良好的互補，對於疾病的準確診斷無疑具有重要意義。

技術實現要素：

有鑑於現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是如何實現具備近紅外光和MRI雙顯影能力的探針。

為實現上述目的，本發明提供了磁共振螢光雙顯影探針及其製備方法。

技術方案一:

一種磁共振螢光雙顯影功能化納米凝膠的製備方法，包括以下步驟：

步驟1：將納米凝膠與核磁顯影分子偶聯；生成磁共振顯影化納米凝膠；

步驟2：將步驟1生成的磁共振顯影化納米凝膠與螢光分子偶聯，生成磁共振螢光雙顯影功能化納米凝膠。

進一步，所述核磁顯影分子為螯合有釓離子的DTPA或DOTA分子。

進一步，所述螢光分子為甲基菁染料Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7。

進一步，所述納米凝膠以多糖為基體,由對還原性物質或弱酸性環境具有響應性的交聯劑交聯而成；其製備方法包括以下步驟：

步驟N1：在隔絕空氣的條件下，將多糖基體充分溶解後，加入引發劑，所述引發劑為可在多糖上引發自由基的化合物；

步驟N2：在多糖基體反應15-30分鐘後，加入疏水性單體和對還原性物質或弱酸性環境敏感的交聯劑進一步反應；

更進一步，所述多糖基體為葡聚糖、殼聚糖、羧甲基殼聚糖、羧甲基葡聚糖或二乙氨基葡聚糖。

更進一步，所述引發劑過氧化二苯甲醯、N，N-二甲苯基胺、過氧化十二醯、過硫酸銨或硝酸鈰銨。

更進一步，所述單體為丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸羥乙酯或丙烯酸丁酯。

更進一步，所述交聯劑為含有二硫鍵的化合物或N,N-亞甲基雙丙烯醯胺。

更進一步，還包括對所述磁共振螢光雙顯影功能化納米凝膠的透析處理步驟。

技術方案二：

一種磁共振螢光雙顯影功能化納米凝膠，根據技術方案一所述的製備方法製備而成。

技術方案三：

一種探針，所述探針的基體為磁共振螢光雙顯影功能化納米凝膠，根據技術方案一中所述的製備方法製備。

技術效果

本發明的有益效果在於：

1、本發明同步實現了紅外顯影和磁共振顯影，既具有磁共振顯影的高分辨性 又有螢光顯影的高靈敏性，兩者互為輔助，對研究探針在體內的運行軌跡和其上負載藥物的作用機理有極大幫助，從而在生物醫用材料領域具有很大的應用潛力。

2、本方法的基體同時對還原性及弱酸性環境具有響應性，可在腫瘤環境中「解體」從而促進螢光和磁共振顯影信號的突變，在腫瘤的高靈敏度診斷中具有良好的應用前景。

3、本發明合成方法簡單，成本低，且高效便捷。

以下將結合附圖對本發明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發明的目的、特徵和效果。

附圖說明

圖1是本發明的製備示意圖。

具體實施方式

實施例1：

一種磁共振螢光雙顯影探針的製備方法，包括以下步驟：

步驟1：製備納米凝膠；包括以下步驟：

步驟N1：在隔絕空氣的條件下，將殼聚糖加入到一定量的醋酸溶液中，並於室溫下進行磁力攪拌24h，使充分溶解；取50mL的殼聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在30℃油浴下恆溫攪拌後，加入引發劑硝酸鈰銨；在多糖單體反應15分鐘後，用微量進樣器加入單體丙烯酸甲酯0.640mL進行反應；並加入對還原性物質環境敏感的交聯劑DADS；並在在氮氣保護下繼續反應4h；

步驟N2：將反應後的凝膠進行透析，以去除其中的雜質；

步驟2：將製備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯；取15.0mg DTPA，溶於5mL的TEMED/HCL緩衝溶液中，加入14mg的EDC與6mg的NHS；待全部溶解後與殼聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h後轉入透析袋透析；將6.9mg的無水氯化釓加入已偶聯有DTPA的凝膠，磁力攪拌12h後透析；

步驟3：將與所述磁性粒子偶聯的納米凝膠進一步偶聯螢光分子，使其具有螢光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；取10mL步驟2的透析產物與Cy5.5-NHS酯以1:25的質量比混合，在室溫下磁力攪拌24h；反應後將凝膠透析，得到殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。

通過動態光散射在Malvern Zetasizer ZS90上進行表徵，殼聚糖基雙顯影功能化納米凝膠的粒徑在206nm。

實施例2：

一種磁共振螢光雙顯影探針的製備方法，包括以下步驟：

步驟1：製備納米凝膠；包括以下步驟：

步驟N1：在隔絕空氣的條件下，羧甲基葡聚糖加入到一定量的去離子水中，加熱並進行磁力攪拌24h使充分溶解；取50mL的羧甲基葡聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在50℃油浴下恆溫攪拌後，加入引發劑過氧化二苯甲醯；在多糖單體反應30分鐘後，用微量進樣器加入單體甲基丙烯酸甲酯0.360mL進行反應；並加入對還原性物質敏感的交聯劑DADS；在氮氣保護下繼續反應12h；

步驟N2：將反應後的凝膠進行透析，以去除其中的雜質；

步驟2：將製備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯；取8.0mg DTPA，溶於5mL的TEMED/HCL緩衝溶液中，加入25.0mg的EDC與15.0mg的NHS；待全部溶解後與羧甲基葡聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h後轉入透析袋透析；將4.2mg的無水氯化釓加入已偶聯有DTPA的凝膠，磁力攪拌12h後透析；

步驟3：將與所述磁性粒子偶聯的納米凝膠進一步偶聯螢光分子，使其具有螢光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；避光攪拌條件下加入23.5mg的EDC與12.5mg的NHS，後加入含有Cy5螢光染料的DMSO溶液，反應避光過夜，之後轉入透析袋透析，得到殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。

通過動態光散射在Malvern Zetasizer ZS90上進行表徵，羧甲基葡聚糖基雙顯影功能化納米凝膠的粒徑在195nm。

實施例3：

一種磁共振螢光雙顯影探針的製備方法，包括以下步驟：

步驟1：製備納米凝膠；包括以下步驟：

步驟N1：將葡聚糖在加熱及磁力攪拌的情況溶於去離子水配置成一定濃度的葡聚糖溶液。取25mL的葡聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在50℃油浴下恆溫攪拌後，加入引發劑N，N-二甲苯基胺；反應30分鐘後，用加入0.275mL丙烯酸羥乙酯單體反應；並加入N,N-亞甲基雙丙烯醯胺進行交聯；在氮氣保護下繼續反應6h；

步驟N2：將反應後的凝膠進行透析，以去除其中的雜質；

步驟2：將製備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯；取42mg DOTA，溶於20mL的TEMED/HCL緩衝溶液中，加入32.5mg的EDC與20.6mg的NHS；待全部溶解後與葡聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h後轉入透析袋透析；將5.6mg的無水氯化釓加入已偶聯有DOTA的凝膠，磁力攪拌18h後透析；

步驟3：將與所述磁性粒子偶聯的納米凝膠進一步偶聯螢光分子，使其具有螢光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；避光攪拌條件下加入24.5mg的EDC與13.0mg的NHS，後加入含有Cy7螢光染料的DMSO溶液，反應避光48h，之後轉入透析袋透析，得到葡聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。

實施例4：

一種磁共振螢光雙顯影探針的製備方法，包括以下步驟：

步驟1：製備納米凝膠；包括以下步驟：

步驟N1：羧甲基殼聚糖溶於去離子水配置成羧甲基葡聚糖溶液，並於室溫下進行磁力攪拌24h，使充分溶解。取30mL的羧甲基殼聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在30℃油浴下恆溫攪拌後，加入引發劑過硫酸銨；反應15分鐘後，加入0.540mL的單體丙烯酸甲酯進行反應；並加入N,N-亞甲基雙丙烯醯胺進行交聯；在氮氣保護下繼續反應12h

步驟N2：將反應後的凝膠進行透析，以去除其中的雜質；

步驟2：將製備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯；取3.3mg DTPA，溶於3mL的TEMED/HCL緩衝溶液中，加入12.3mg的EDC與6.2mg的NHS；待全部溶解後與羧甲基殼聚糖凝膠混合，磁力攪拌72h後轉入透析袋透析；將4.5mg的無水氯化釓加入已偶聯有DTPA的凝膠，磁力攪拌12h後透析；

步驟3：將與所述磁性粒子偶聯的納米凝膠進一步偶聯螢光分子，使其具有螢光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；取20mL所述步驟2的透析產物與Cy3-NHS酯以1:30的質量比混合，在室溫下磁力攪拌24h。反應後將凝膠透析，得到羧甲基殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。

實施例5：

一種磁共振螢光雙顯影探針的製備方法，包括以下步驟：

步驟1：製備納米凝膠；包括以下步驟：

步驟N1：將二乙氨基葡聚糖加入到一定量的去離子水中，加熱並進行磁力攪拌24h，使充分溶解。取50mL的二乙氨基葡聚糖溶液加入三口燒瓶，氮氣保護，在50℃油浴下恆溫攪拌後，加入引發劑過氧化十二醯；反應30分鐘後，加入0.660mL單體丙烯酸丁酯進行反應；並加入溶於DMSO的DADS進行交聯，在氮氣保護下繼續反應24h；

步驟N2：將反應後的凝膠進行透析，以去除其中的雜質；

步驟2：將製備得到的納米凝膠與含有磁性粒子的核磁顯影分子偶聯；取12.0mg DTPA，溶於10mL的TEMED/HCL緩衝溶液中，加入42.2mg的EDC與24.5mg的NHS；待全部溶解後與二乙氨基葡聚糖混合，磁力攪拌72h後轉入透析袋透析；將8.8mg的無水氯化釓加入已偶聯有DTPA的凝膠，磁力攪拌18h後透析；

步驟3：將與所述磁性粒子偶聯的納米凝膠進一步偶聯螢光分子，使其具有螢光顯影的功能，得到功能化納米凝膠；避光攪拌條件下加入20.1mg的EDC與11.6mg的NHS，後加入含有Cy5.5螢光染料的DMSO溶液，反應避光過夜，之後轉入透析袋透析，得到殼聚糖基雙顯影的功能化納米凝膠。

實施例6：

一種磁共振螢光雙顯影功能化納米凝膠，根據實施例1-5中任一所述的製備方法製備而成。

實施例7：

一種探針，所述探針的基體為磁共振螢光雙顯影納米凝膠，根據實施例1-5中任一所述的製備方法製備而成。

本發明使用的多糖基體在自然界中廣泛易得、其生物相容性好，對人體無毒無害，且具有可降解，其上多有羥基或氨基等官能團，容易進行化學改性，有很好的應用前景，備受研究者青睞。

以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護範圍內。