磁性納米粘土載體固定化酶及其再生的方法

2023-07-02 05:48:16

專利名稱：磁性納米粘土載體固定化酶及其再生的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及磁性納米粘土載體固定化酶及其再生的方法。
背景技術：
固定化酶允許酶的重複或是連續使用，易於底物和產物的回收、易於純化，在一定、程度上改進了生物催化劑的性能。近年來，納米材料如納米粘土作為固定化酶的載體引起了人們很大的關注，原因在於其成本低、粒徑小，且具有獨特的插層性質；另外ー個重要原因是粘土表面的矽羥基經過不同官能團活化後，可作為生物大分子的附著位點。然而，在這些研究中存在的最大問題就是固定化酶完成催化反應後載體很難被分離，而磁性材料的多相催化可以滿足生物催化劑的高效分離和催化過程的持續進行，因此，磁性納米材料改性的粘土有望成為固定化酶的優良載體材料。已經有文獻報導過磁性氧化鐵/粘土納米複合材料,然而，以往的這些研究結果顯示，磁性納米顆粒往往被固定在粘土表面，那麼作為固定化酶附著位點的矽羥基便可能會被掩蓋，這就限制了磁性納米粘土材料在固定化酶領域的應用。此外，所製備這些磁性納米材料的磁強度也非常低，不易分離，這也大大限制了其應用。就酶固定化而言，在吸附、交聯、包埋和共價偶聯四種主要的載體固定化酶方法中，除吸附法外其它三種方法所製備的固定化酶，其載體都不能再生，隨著酶的失活而被丟棄，這就造成了環境汙染、資源浪費以及生產成本増加。雖然傳統的吸附法所製備的固定化酶其載體可以再生，但載體與酶結合不牢固、酶的損失比較嚴重，這也就限制了它的應用。因此，設計、開發和製備可再生的載體材料就成為本課題的研究重點之一，目前有關這方面的工作罕有報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種磁性納米粒子對粘土表面影響較小的磁性納米粘土載體固定化酶。本發明所要解決的另一個技術問題是提供該磁性納米粘土載體固定化酶的製備方法。本發明所要解決的第三個技術問題是提供該磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法。為解決上述問題，本發明所述的磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對象為糖化酶和相應固定化酶的載體，並以共價偶聯法為固定化方法製成，其特徵在於所述載體為磁性納米Fe3O4O粘土複合材料,該磁性納米Fe3O4O粘土複合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成，且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。所述磁性納米Fe3O4O粘土複合材料是指首先將FeCl3 · 6H20以I :2(Tl :50的料液重量體積比溶解於こニ醇中形成澄清溶液；然後將NaAc、聚こニ醇加入到所述澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到所述澄清溶液中，超聲分散I飛h，得到混合液；最後將所述混合液加入到聚四氟こ烯襯裡的不鏽鋼反應釜中，維持16(T210°C反應5 24h即得；其中所述NaAc與所述澄清溶液的重量體積比為I :7 1 18 ;所述聚こニ醇與所述澄清溶液的重量體積比為I :2(Tl :50 ;所述鹽酸活化的納米粘土與所述澄清溶液的重量體積比為I :60 1 :150。
所述鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :2(T30的料液重量體積比放入濃度為廣3 M的HCl溶液中，在2(T40°C溫度下超聲0.5 2 h進行活化後，經離心分離並洗滌至上清液呈中性，再離心分離後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥至恆重後研磨、過3(T60Mm篩子即得。如上所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特徵在於所述納米粘土為凹凸棒、高嶺土、蒙脫土中的任意ー種。如上所述的磁性納米粘土載體固定化酶的製備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土複合材料以I :4(Tl :80的料液重量體積比浸泡在ニ甲苯溶液中2 4h，使其充分溶脹，然後在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基矽烷加入到所述ニ甲苯溶液中；在9(T130°C下油浴加熱回流，且隊保護下反應6 15h，反應結束後こ醇洗滌三次，經磁分離後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥至恆重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，記為Fe3O4O粘土-NH2 ;其中所述Y-氨基丙基三こ氧基矽烷與所述ニ甲苯溶液的重量體積比為I :8 1 12 ；
⑵在質量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液中加入所述Fe3O4O粘土-NH2,於室溫下反應2 8h ；然後進行磁分離，得到沉澱物，該沉澱物經蒸餾水洗滌數次去除未反應的戊ニ醛；最後用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌沉澱物，並將該沉澱物記作Fe3O4O粘土 -GA ;所述Fe3O4O粘土 -NH2與所述戊ニ醛溶液的重量體積比為I :30飛0 ；
⑶將所述Fe3O4O粘土 -GA載體按I :10 20的料液重量體積比加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液中，在2(T40°C反應2 8小時進行酶的固定化；固定化後經離心分離並經濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌兩次後，即得固定化酶；
⑷所述固定化酶放置在在4°C下保存即可。如上所述的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶；
②在所述失活的固定化酶中加入其重量5 10倍的丙酮/こ醇超聲半小吋，然後在8(Tl00°C下煮沸20 60分鐘，得到預處理的載體；所述預處理的載體用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌數次後，按I :30飛0的料液重量體積比加入到質量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液或環氧氯丙烷溶液中，於室溫下反應2 8h，即得再生載體；
③所述再生載體用濃度為50mM、pH值為5.5的醋酸緩衝溶液洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. fO. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在2(T40°C空氣浴固定化2 8 h，即完成酶的再次固定化；所述再生載體與所述糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比為I :10 20。用下述製備方法代替所述步驟②在所述失活的固定化酶中加入其重量1(T20倍、且濃度為0. 5^10 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩0. 5飛h後，經離心分離即得再生載體。本發明與現有技術相比具有以下優點
I、由於本發明採用溶劑熱法製備納米磁性粘土，因此，磁性納米粒子對粘土表面影響較小，且所製備的磁性納米粘土具有較高磁強度。2、由於本發明考慮到酶是ー種蛋白質，其是由胺基酸組成，因此，其側鏈以及端基有大量的反應性基團(如氨基、羧基、巰基以及咪唑基等)，因而固定化酶失活後，以共價鍵連接的載體還可以再生，載體再生方法簡單易行，並具有廣譜適用性。3、由於本發明採用溶劑熱法製備納米磁性粘土，因此，磁性納米Fe3O4O粘土複合材料相對於以往的研究而言在特定位點改性粘土可以減少外界材料對粘土本身性能的影響，並具有較高的磁強度使其易與反應液分離。
4、由於本發明中用到的固定化酶載體具有磁性，並且考慮到酶是ー種蛋白質，其是由胺基酸組成，其側鏈以及端基有大量的反應性基團(如氨基、羧基、巰基以及咪唑基等)，因此，本發明固定化酶不僅在於可以對共價鍵結合的載體進行再生，而且在於它的易於回收和循環使用。固定化酶重複使用性能的測試方法如下磁性納米Fe3O4O粘土複合材料和再生載體固定化的糖化酶催化水解澱粉後被回收，用醋酸緩衝溶液(50 mM, pH= 5.5)洗滌三次，再次進入新一輪的催化反應。經十次反應周期完成後，磁性納米Fe3O4O粘土複合材料和再生載體固定化糖化酶的殘留活力都接近於60%。其活力的損失主要是由於使用過程中吸附到載體表面的部分酶蛋白分子脫落，以及催化過程中部分酶蛋白變性所致。顯然，將酶固定在磁性納米Fe3O4O粘土複合材料上増加了它的操作穩定性。此外，可再生載體固定化酶優良的可重複性進一步證明了載體再生戰略的可行性。5、通過對磁性納米Fe3O4O粘土複合材料進行透射電鏡測試(FEI Tecnai G20)，可以看出平均粒徑為150 nm的Fe3O4附著在層狀高嶺土的不同位置，歸納起來有三種不同結構的Fe3O4O高嶺土納米複合材料，也就是說，Fe3O4納米粒子可以固定在粘土層狀結構的邊緣和表面，或是插入兩層之間(參見圖I)。6、通過對磁性納米Fe3O4O粘土複合材料進行VSM測試(LAKESH0RE-7304，USA),在室溫下Fe3O4O粘土複合材料具有超順磁性的特性，由於其具有很高的磁效應，因而對於外部磁場有很快的磁響應，這也說明納米複合材料的飽和磁強度已經足夠滿足固定化酶的需求。此外，可以看出純Fe3O4納米粒子的飽和磁強度出現在88. 97 emu/g。然而由於粘土的存在，Fe3O4O高嶺土納米複合材料的磁飽和強度降低到38. 56 emu/g, Fe3O4OATP下降到40. 85 emu/g,這基本上與Fe3O4在納米複合材料中的比例相一致。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進ー步詳細的說明。圖I為本發明中Fe3O4O高嶺土納米複合材料的投射電鏡照片。
具體實施例方式實施例I 磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對象為糖化酶和相應固定化酶的載體，並以共價偶聯法為固定化方法製成。載體為磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土複合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成,且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。其中磁性納米Fe3O4O粘土複合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :20的料液重量體積比(kg/L)溶解於こニ醇中形成澄清溶液；然後將NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到澄清溶液中，超聲分散(40kHz) lh，得到混合液；最後將混合液加入到聚四氟こ烯襯裡的不鏽鋼反應釜中，維持160°C反應24h即得。NaAc與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :7 ;聚こニ醇與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :20 ;鹽酸活化的納米粘土與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :60。鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :20的料液重量體積比放入濃度為I M、的HCl溶液中，在20°C溫度下超聲(40kHz)2 h進行活化，以去除粘土表面殘留的碳和鈉離子。活化完成後，經離心分離(4000轉/min)並用蒸餾水反覆洗滌至上清液呈中性，再離心分離(4000轉/min)後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥(50°C，24小吋)至恆重後研磨、過30Mm篩子即得。實施例2 磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對象為糖化酶和相應固定化酶的載體，並以共價偶聯法為固定化方法製成。載體為磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土複合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成,且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。其中磁性納米Fe3O4O粘土複合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :50的料液重量體積比(kg/L)溶解於こニ醇中形成澄清溶液；然後將NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到澄清溶液中，超聲分散(40kHz) 5h，得到混合液；最後將混合液加入到聚四氟こ烯襯裡的不鏽鋼反應釜中，維持210°C反應5h即得。NaAc與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :18 ;聚こニ醇與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :50 ;鹽酸活化的納米粘土與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :150。鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :30的料液重量體積比放入濃度為3 M的HCl溶液中，在40°C溫度下超聲(40kHz)0.5 h進行活化，以去除粘土表面殘留的碳和鈉離子。活化完成後，經離心分離(4000轉/min)並用蒸餾水反覆洗滌至上清液呈中性，再離心分離(4000轉/min)後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥(50°C，24小吋)至恆重後研磨、過60Mm篩子即得。實施例3 磁性納米粘土載體固定化酶,包括固定對象為糖化酶和相應固定化酶的載體，並以共價偶聯法為固定化方法製成。載體為磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土複合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成,且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。其中磁性納米Fe3O4O粘土複合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :35的料液重量體積比(kg/L)溶解於こニ醇中形成澄清溶液；然後將NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到澄清溶液中，超聲分散(40kHz)3 h，得到混合液；最後將混合液加入到聚四氟こ烯襯裡的不鏽鋼反應釜中，維持185°C反應15h即得。NaAc與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :12 ;聚こニ醇與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :35 ;鹽酸活化的納米粘土與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :110。鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :26的料液重量體積比放入濃度為2 M的HCl溶液中，在30°C溫度下超聲分散(40kHz)l h進行活化，以去除粘土表面殘留的碳和鈉離子。活化完成後，經離心分離(4000轉/min)並用蒸餾水反覆洗滌至上清液呈中性，再離心分離(4000轉/min)後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥(40°C，48小吋)至恆重後研磨、過45Mm篩子即得。上述實施例廣3中的納米粘土為凹凸棒、高嶺土、蒙脫土中的任意ー種。實施例4 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的製備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土複合材料以I :40的料液重量體積比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中2h，使其充分溶脹，然後在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基矽烷加入到ニ甲苯溶液中；在90°C下油浴加熱回流，且N2保護下反應6h，反應結束後こ醇洗滌三次，經磁鐵將其分離後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥(40°C，48小吋)至恆重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，記為Fe3O4O粘土 -NH2。該Fe3O4O粘土 -NH2通過Vario EL元素分析儀測出(C、H和N)元素的含量，結果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分別為0. 6mmol/g 和 0.9 mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基矽烷與ニ甲苯溶液的重量體積比(kg/L)為I :8。⑵在質量濃度為2%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,於室溫下反應2h ;然後經磁鐵將其分離，得到沉澱物，該沉澱物經蒸餾水洗滌數次去除未反應的戊ニ醛；最後用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌沉澱物，並將該沉澱物記作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2與戊ニ醛溶液的重量體積比(kg/L)為I :30。⑶將Fe3O4O粘土 -GA載體按I :10的料液重量體積比(kg/L)加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液中，在20°C反應2小時進行酶的固定化；固定化後經磁鐵將其分離並經濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌兩次後，即得固定化酶。反應後的溶液和洗滌液合併，用來測定未固定的酶蛋白含量。⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。實施例5 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的製備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土複合材料以I :80的料液重量體積比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中4h，使其充分溶脹，然後在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基矽烷加入到ニ甲苯溶液中；在130°C下油浴加熱回流，且隊保護下反應15h，反應結束後こ醇洗滌三次，經磁鐵將其分離後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥(40°C，48小吋)至恆重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，記為Fe3O4O粘土 -NH2。該Fe3O4O粘土 -NH2通過Vario EL元素分析儀測出(C、H和N)元素的含量，結果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分別為0. 8 mmol/g 和 1.2 mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基矽烷與ニ甲苯溶液的重量體積比(kg/L)為I :12。⑵在質量濃度為10%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,於室溫下反應8h ;然後經磁鐵將其分離，得到沉澱物，該沉澱物經蒸餾水洗滌數次去除未反應的戊二醛；最後用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌沉澱物，並將該沉澱物記作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2與戊ニ醛溶液的重量體積比(kg/L)為I :60。⑶將Fe3O4O粘土 -GA載體按I :20的料液重量體積比(kg/L)加入到濃度為50mM、 pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液中，在40°C反應8小時進行酶的固定化；固定化後經磁鐵將其分離並經濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌兩次後，即得固定化酶。反應後的溶液和洗滌液合併，用來測定未固定的酶蛋白含量。
⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。實施例6 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的製備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土複合材料以I :60的料液重量體積比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中3h，使其充分溶脹，然後在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基矽烷加入到ニ甲苯溶液中；在110°C下油浴加熱回流，且隊保護下反應10h，反應結束後こ醇洗滌三次，經磁鐵將其分離後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥(40°C，48小吋)至恆重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，記為Fe3O4O粘土 -NH2。該Fe3O4O粘土 -NH2通過Vario EL元素分析儀測出(C、H和N)元素的含量，結果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分別為0. 7 mmo I /g ネロ I. I mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基矽烷與ニ甲苯溶液的重量體積比(kg/L)為I :10。⑵在質量濃度為6%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,於室溫下反應5h ;然後經磁鐵將其分離，得到沉澱物，該沉澱物經蒸餾水洗滌數次去除未反應的戊ニ醛；最後用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌沉澱物，並將該沉澱物記作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2與戊ニ醛溶液的重量體積比(kg/L)為I :40。⑶將Fe3O4O粘土 -GA載體按I :15的料液重量體積比(kg/L)加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液中，在30°C反應5小時進行酶的固定化；固定化後經磁鐵將其分離並經濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌兩次後，即得固定化酶。反應後的溶液和洗滌液合併，用來測定未固定的酶蛋白含量。⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。實施例7 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量5倍的丙酮/こ醇超聲半小時，然後在80°C下煮沸60分鐘，得到預處理的載體；預處理的載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，按I :30的料液重量體積比(kg/L)加入到質量濃度為2%的戊ニ醛溶液或環氧氯丙烷溶液中，於室溫下反應2h，即得再生載體。③再生載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在20°C空氣浴固定化8h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比(kg/L)為I :10。實施例8 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量10倍的丙酮/こ醇超聲半小時，然後在100°C下煮沸20分鐘，得到預處理的載體；預處理的載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，按I :60的料液重量體積比(kg/L)加入到質量濃度為10%的戊ニ醛溶液或環氧氯丙烷溶液中，於室溫下反應8h，即得再生載體。③再生載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在40°C空氣浴固定化2h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比(kg/L)為I :20。實施例9 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量8倍的丙酮/こ醇超聲半小時，然後在90°C下煮沸40分鐘，得到預處理的載體；預處理的載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，按I :40的料液重量體積比(kg/L)加入到質量濃度為6%的戊ニ醛溶液或環氧氯丙烷溶 液中，於室溫下反應5h，即得再生載體。③再生載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在30°C空氣浴固定化5h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比(kg/L)為I :15。實施例10 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量10倍、且濃度為0. 5mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩0. 5h後，經離心分離(4000轉/min)即得再生載體。③再生載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在20°C空氣浴固定化2h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比(kg/L)為I :10。實施例11 上述實施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量20倍、且濃度為10 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩6h後，經離心分離(4000轉/min)即得再生載體。③再生載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在40°C空氣浴固定化8 h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比(kg/L)為I :20。實施例12 上述實施例廣3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量15倍、且濃度為5 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩3h後，經離心分離(4000轉/min)即得再生載體。
③再生載體用醋酸緩衝溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在30°C空氣浴固定化5h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比(kg/L)為I :15。應該理解，這裡討論的實施例和實施方案只是為了說明，對熟悉該領域的人可以提出各種改進和變化 ，這些改進和變化將包括在本申請的精神實質和範圍以及所附的權利要求範圍內。
權利要求
1.磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對象為糖化酶和相應固定化酶的載體，並以共價偶聯法為固定化方法製成，其特徵在於所述載體為磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土複合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成，且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。
2.如權利要求I所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特徵在於所述磁性納米Fe3O4O粘土複合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :2(Tl :50的料液重量體積比溶解於こニ醇中形成澄清溶液；然後將NaAc、聚こニ醇加入到所述澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到所述澄清溶液中，超聲分散I飛h，得到混合液；最後將所述混合液加入到聚四氟こ烯襯裡的不鏽鋼反應釜中，維持16(T210°C反應5 24h即得；其中所述NaAc與所述澄清溶液的重量體積比為I :7 1 18 ;所述聚こニ醇與所述澄清溶液的重量體積比為I :2(Tl :50 ；所述鹽酸活化的納米粘土與所述澄清溶液的重量體積比為I :6(Tl :150。
3.如權利要求2所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特徵在於所述鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :2(T30的料液重量體積比放入濃度為廣3 M的HCl溶液中，在2(T40°C溫度下超聲0.5 2 h進行活化後，經離心分離並洗滌至上清液呈中性，再離心分離 後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥至恆重後研磨、過3(T60Mffl篩子即得。
4.如權利要求3所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特徵在於所述納米粘土為凹凸棒、高嶺土、蒙脫土中的任意ー種。
5.如權利要求I所述的磁性納米粘土載體固定化酶的製備方法，包括以下步驟 ⑴將磁性納米Fe3O4O粘土複合材料以I :4(Tl :80的料液重量體積比浸泡在ニ甲苯溶液中2 4h，使其充分溶脹，然後在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基矽烷加入到所述ニ甲苯溶液中；在9(T130°C下油浴加熱回流，且隊保護下反應6 15h，反應結束後こ醇洗滌三次，經磁分離後得到沉澱物，該沉澱物經真空乾燥至恆重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土複合材料，記為Fe3O4O粘土-NH2 ;其中所述Y-氨基丙基三こ氧基矽烷與所述ニ甲苯溶液的重量體積比為I :8 1 12 ； ⑵在質量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液中加入所述Fe3O4O粘土-NH2,於室溫下反應2 8h ；然後進行磁分離，得到沉澱物，該沉澱物經蒸餾水洗滌數次去除未反應的戊ニ醛；最後用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌沉澱物，並將該沉澱物記作Fe3O4O粘土 -GA ;所述Fe3O4O粘土 -NH2與所述戊ニ醛溶液的重量體積比為I :30飛0 ； ⑶將所述Fe3O4O粘土 -GA載體按I :10 20的料液重量體積比加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液中，在2(T40°C反應2 8小時進行酶的固定化；固定化後經離心分離並經濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌兩次後，即得固定化酶； ⑷所述固定化酶放置在在4°C下保存即可。
6.如權利要求I所述的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟 ①使經數次使用後的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶； ②在所述失活的固定化酶中加入其重量5 10倍的丙酮/こ醇超聲半小吋，然後在.8(Tl00°C下煮沸20 60分鐘，得到預處理的載體；所述預處理的載體用濃度為50mM、pH值為.5.5的醋酸緩衝溶液洗滌數次後，按I :30飛0的料液重量體積比加入到質量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液或環氧氯丙烷溶液中，於室溫下反應2 8h，即得再生載體；③所述再生載體用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩衝溶液洗滌數次後，然後加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. f0. 6 mg的糖化酶醋酸緩衝液，採用搖床在2(T40°C空氣浴固定化2 8 h，即完成酶的再次固定化；所述再生載體與所述糖化酶醋酸緩衝液的重量體積比為I :10 20。
7.如權利要求6所述的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，其特徵在於用下述製備方法代替權利要求6中所述步驟②在所述失活的固定化酶中加入其重量1(T20倍、且濃度為0.5 10 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩0. 5飛h後，經離心分離即得再生載體。
全文摘要
本發明涉及一種磁性納米粘土載體固定化酶，該固化酶包括固定對象為糖化酶和相應固定化酶的載體，並以共價偶聯法為固定化方法製成，其特徵在於所述載體為磁性納米Fe3O4@粘土複合材料，該磁性納米Fe3O4@粘土複合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成，且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。本發明採用溶劑熱法製備了超順磁性的Fe3O4@粘土納米複合材料，經γ-氨丙基三乙氧基矽烷對其進行表面改性後，利用戊二醛作為偶聯劑將糖化酶共價固定於載體表面，並設計了兩種新穎的載體再生策略。再生載體固定化糖化酶後依然保持著固定化酶原有的活性、熱穩定性以及可重複使用性等優良性能。本發明還可適用於其它以共價偶聯法固定化酶載體的再生。
文檔編號C12N11/14GK102649954SQ20121015210
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者李彥鋒, 王建芝, 趙光輝, 金新亮 申請人:蘭州大學