根據人類hiv病毒株的表型藥物敏感性控制hiv陽性病人化療的方法

2023-05-29 22:05:21 1

專利名稱:根據人類hiv病毒株的表型藥物敏感性控制hiv陽性病人化療的方法
技術領域：
本發明涉及一種控制HIV陽性病人化療的方法，以及醫生根據人類HIV病毒株對HIV pol基因的一種或多種酶的抑制劑的表型藥物敏感性用於治療該病人的臨床控制儀器，以及同時確定HIV pol基因的二種或多種酶對其抑制劑的表型藥物敏感性的方法。
背景技術：
迄今，已形成了一些化療方案用於治療HIV感染的病人。其中某些方案已獲批准用於臨床，其餘的則是不斷進行的臨床試驗的主題。可以設想將被批准的化療方案的數目在不久的將來將穩定地增加。而且，由於在治療期間形成了藥物抗性HIV變異體而使用組合治療或多種藥物治療的方案持續增加。儘管已顯示這些化療方案對HIV疾病的病毒學(病毒負荷)，免疫學及臨床參數產生影響，但是實踐經驗告訴我們這些影響是短暫的。特別是，發現了感染某個病人的HIV病毒株在很短的時間後開始表現出對治療所述病人的藥物和藥物組合的敏感性降低。化療的效力喪失情況隨病人，藥物或藥物組合的不同而變化。已公認對特定類型的化療的效力喪失與感染病人的HIV病毒株的基因組中胺基酸改變的基因型相關。這可能使得這些HIV病毒株對化療的敏感性降低。由於HIV感染的病人在較長的時間內接受一些化療方案，在感染的HIV病毒株基因組中出現更複雜的胺基酸改變形式，這導致目前對感染的病人的進一步治療的理性探索失敗。正如以前的解釋所暗示的，可按常規確定涉及單個或多個抗HIV藥物的不同化療方案的HIV病毒株中出現的基因型改變，但因此更證實了從這些數據信息很難使負責安排化療的醫生確定開始或持續特定的化療方案是否合理。換句話說，在有限規模上獲得的基因型信息不能按常規翻譯成使負責醫生能對病人應優先進行何種化療作出關鍵的決定的表型信息。對於被抗藥性HIV病毒株感染的未用藥的病人也存在該問題。
病毒負荷監測已變成HIV治療的一個常規方面。然而，僅病毒負荷數不能用作決定單獨或者結合使用何種藥物的基礎。
結合化療越來越多地成為化療方案的選擇。當使用結合藥物的病人開始經歷藥物失敗時，不可能確切的知道哪一種藥物在結合中不再有活性。人們不可能簡單地替代所有的藥物，因為目前可使用的藥物數有限。而且如果替換全部化療方案，可能會失去一種或多種對特定病人有活性的藥物。另外，對於對特定抑制劑表現出抗性的病毒也可能表現出對其它抑制劑不同程度的交叉抗性。
因此，理想的是，每次進行病毒負荷試驗並檢測到病毒負荷增加時，也應進行藥物敏感/抗性試驗。除非形成了有療效的治療方案，HIV疾病的處理將仍需要這種試驗。
目前確實存在確定表型方法，它基於從存在供體外周血單核細胞(PBMCs)的血漿的病毒分離和在所說細胞中的隨後表型(Japour，A.J.等，(1993)抗微生物試劑和化療；Vol.37，No.5，p1095-1101)。由AIDS臨床試驗組(ACTG)提倡的這種共同培養方法，特別是對於確定AZT(本文與疊氮胸苷/Retrovir同義(Retrovir是商標))抗性的表型，對於在常規基礎上使用則是費時，昂貴且太複雜。
Kellam，P.和Larder，B.A.(抗微生物試劑和化療，(1994)Vol.38，No.1，p23-30)已建立了表型重組病毒試驗以評價HIV 1型分離株對逆轉錄酶(RT)抑制劑的藥物敏感性。該方法允許經過將PCR產生的RT編碼序列庫同源重組進RT缺失的非感染性原病毒克隆，pHIVΔRTBstEII中來增殖活病毒。對兩個在疊氮胸苷療程期間的病人的分析表明該方案產生與原始感染的PBL DNA表現出完全相同的基因型和表型的病毒。然而，該方法涉及經過共同培養病人血漿或病人PBMCs與供體PBMCs分離病人病毒。這種以前的病毒培養可能改變了原始的病毒組成。而且，該方法儘管允許確定分離株對各種抑制劑的敏感性，但是不能給醫生提供是繼續目前的化療方案還是改變療法的信息。
另外，當僅研究pol基因的一種酶時，該方法不容易使其產生按常規涉及使用一種蛋白酶和兩種RT抑制劑的組合療法的常規表型評價。
在重組病毒試驗中使用的嵌套式PCR(聚合酶鏈式反應)方法可產生的情況是重組病毒不能真實地反應所研究的感染病人的HIV病毒株的情況。該問題起因於DNA序列的同源性和在哺乳動物細胞中同源重組所需的最小同源量(C.Rubnitz，J.和Subramini，S.(1984)分子和細胞生物學Vol.4，No.11，p2253-2258)。因此，以重組病毒研究為基礎的任何表型試驗應努力保證儘可能多地擴增病人的物質且有最大的重組。
因此，採用的RNA提取和嵌套式PCR方法應確保病毒的遺傳物質被擴增，使擴增的物質最大地反應在調查中病人的病毒遺傳多樣性。
因此，在目前的臨床實踐中迫切需要(a)迅速且按常規確定感染特定病人的HIV病毒株的表型藥物敏感性，(b)把由此獲得的數據處理成容易理解的信息，及(c)根據所述信息開始，繼續或調整對所述病人實施的化療。
本發明的公開內容根據本發明的第一個方面，提供了一種控制HIV陽性病人HIV化療的方法，包括用一個經過從病人的生物學材料的樣品分離病毒RNA並逆轉錄所述pol基因的所需區域獲得的HIV pol基因的序列和已缺失該序列的HIV-DNA構建體轉染對HIV感染敏感的細胞系，培養所述轉染的細胞以創造提供循環病毒抗性情況的指示的嵌合病毒的原種，評價所述嵌合病毒對HIV pol基因編碼的所述酶的抑制劑的表型敏感性並對其指定一個值，構建含有所述嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相應值的數據組，重複至少二個其它的抑制劑的敏感性評價從而構建總共至少三個該數據組，以二維或三維圖解形式表示該數據組使各數據組中嵌合型和野生型敏感性之間的區別提供嵌合原種對所述抑制劑處理的抗性的肉眼測量值，以及根據所測量的抗性圖示選擇最佳抑制劑。
根據本發明的方法經濟而快捷地得到大量不同的HIV感染的病人的表型信息。該方法可應用於所有目前可用的化療方案且預期同樣可應用於將來的化療方案。
根據本發明的方法給醫生提供了病人HIV病毒株的表型數據，該數據可立即用於確定是否應開始，繼續或調整特定的化療方案。
優選的是，數據組在多邊形或準圓形圖上表示，該圖含有(a)多個從原點放射延生的標準化軸，每個軸相應於一個數據組或抑制劑或其組合；(b)軸被標準化使野生型HIV對各種抑制劑的敏感性值在各軸上相等，任選表示野生型HIV的數據點並連接起來形成規則多邊形，其頂點在軸上，其中心由原點限定；(c)在各軸上描繪出相應於所述軸的表示嵌合HIV原種對抑制劑敏感性值的數據點，任意連接嵌合數據點以形成規則或不規則的多邊形，其形狀表示嵌合原種對抑制劑範圍的抗性。
多邊形或準園形圖提供的優點是根據表示病人嵌合HIV原種的多邊形與表示野生型病毒株的多邊形之間差異程度確定病人對許多藥物的抗性。多邊形的面積一般在某些區域比在其它區域差別更大，表明在每種情況下對其軸通過所述區域的抑制劑的抗性程度更大或更小。
因此，根據本發明的方法獲得了嵌合HIV原種並提供了該原種對一定範圍的抑制劑的抗性圖譜。以這種方式該圖譜或圖形提供了以常規測量不能獲得的該嵌合原種的一個方面的技術特徵。
在一個優選的實施方案中，標準化軸互相間等角。
另外，優選的是，各軸具有對數刻度。
進而，優選的是，在嵌合多邊形中如果表示了偏心數據點，則鑑定的抑制劑可假定其對病人具有很小或沒有用處，而位於野生型多邊形內，其上或靠近其外側的數據點鑑定的抑制劑可假定其對病人具有很大的用處。
當最壞情況值與嵌合和野生型HIV一起表示時，通常不規則多邊形包圍嵌合和野生型多邊形。上文使用的術語「偏心」的意義是指數據點位於離最壞邊界相當近且離野生型多邊形相當遠。同樣術語「靠近野生型多邊形外側」指與離最壞邊界的距離相比離野生型多邊形相當近。
上文所限定的方法限制的意義在於可測量的對抑制劑的抗性依賴於所用的抑制劑濃度的具體範圍。還必須努力減小生物學可變性的影響。因此，需要獲得最大抗性值或假定給定的抑制劑無效時最壞情況可測量的抗性值。該濃度，例如，100μM，一般是實踐上可試驗的最大濃度，但是也可從，例如，藥理學，毒理學或藥物動力學研究獲得。對研究中病人的抗性水平與最大可測量的抗性的比較決定什麼是研究中病人的明顯抗性水平。在下文所述的線段圖中可適當地顯示最大可測量抗性和實際抗性。
在本發明的另一個優選的實施方案中，所述的三個或更多個數據組中的每一個還含有對所述抑制劑最壞情況可測量抗性的值，在所述的圖示中表示所述的最壞情況值使嵌合原種的數據點可與野生型和最壞情況HIV相比，從而提供對特定情況中抑制劑相對值的評價。
用超過150個病人的樣品進行的實驗揭示了抗性形成與治療史之間的密切關係，如下文在實施例中進一步所述。已發現了根據本發明獲得的數據與經典病毒分離和表型確定技術之間的密切關係。
因此根據本發明的方法可用於個體化且更理性地控制HIV化療。因此使用根據本發明的方法結合適當施用抗HIV藥物應最終導致感染HIV病毒的病人得到更好的治療並存活。
根據本發明的方法特別應用於個別病人已接受了許多不同的藥物且護理醫生不易解釋其突變方式的情況。
根據本發明的另一個方面，提供了一種控制HIV陽性病人的HIV化療的方法，它包括如下步驟(a)以上文所述的方法定期評價病人HIV病毒株的表型敏感性；(b)用選定的抑制劑維持化療，而病人的HIV病毒株保持對選定的化療敏感；(c)如果且當原始抑制劑的敏感性降低時，選擇不同的抑制劑。
根據本發明的另一個方面，提供了一種用於控制HIV陽性病人化療的臨床控制儀器，所述儀器帶有如上文所限定的多個數據組的圖示。
我們給根據本發明的臨床控制儀器創造了術語「抗病毒圖」(antivirogram)，且該術語在下文的說明書中使用。該儀器給醫生提供了不同抑制劑相對變化和敏感性的清楚圖示，可用於不同HIV感染的病人的臨床控制。
優選的是，同時評價所述的嵌合病毒對HIV pol基因所編碼的至少兩個酶的抑制劑的表型敏感性。
在本發明的另一個方面，提供了一種測定病人中個體HIV病毒株對HIV pol基因編碼的至少兩個酶的抑制劑的表型藥物敏感性的方法，它包括用一個經過從病人的生物學材料的樣品分離病毒RNA並逆轉錄所述pol基因的所需區域獲得的HIV pol基因的序列和已缺失該序列的HIV-DNA構建體轉染對HIV感染敏感的細胞系，培養所述轉染的細胞以創造提供循環病毒抗性情況的指示的嵌合病毒的原種，以及評價所述嵌合病毒對HIV pol基因編碼的所述酶的抑制劑的表型敏感性。
所述來自pol基因的序列從其表型藥物敏感性已被測定的病人獲得的生物材料的樣品中分離。許多種類的生物材料可用於分離所需序列。
因此，可從血漿，血清或選自精液和陰道液的無細胞體液選擇生物材料。血漿是特別優選的且相對於上述現有技術所用的PBMCs的應用而言特別具有優勢。
或者，生物材料可以是加入了RNA穩定劑的全血。
在另一個實施方案中，生物材料可以是選自腦組織或淋巴結組織，或活體解剖獲得的其它組織的固體組織材料。
如下文所示，當諸如血漿的生物材料用於分離所需的序列時，可使用最小體積的血漿，典型地是大約100-250μl，更具體的是約200μl。
另外，優選所選的兩種酶選自HIV RT，蛋白酶和整合酶。
以本來已知的方法，例如Boom，R.等的方法(臨床微生物學雜誌(1990)Vol.28，No.3，p495-503)根據本發明可較方便地分離病毒RNA。
如果是血漿，血清和無細胞體液，也可以使用Qiagen集團公司投放市場的QIAamp病毒RNA試劑盒。
優選的是，對HIV感染敏感的細胞系是CD4+T-細胞系。
另外，優選的是，CD4+T-細胞系是MT4細胞系或HeLa CD4+細胞系。
可使用諸如Perkin Elmer投放市場的GeneAmp逆轉錄酶試劑盒的商用試劑盒進行逆轉錄。
所需的病人pol基因的區域優選使用特定的下遊引物逆轉錄。
如果需要逆轉錄的序列是編碼逆轉錄酶或逆轉錄酶與蛋白酶的序列，則下遊引物優選OUT35』-CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATG-3』(SED ID NO1)。
在特別優選的實施方案中，病人的HIV RT基因和HIV蛋白酶基因使用HIV-1特異性的OUT3引物和遺傳改造的喪失了RNA酶H活性的逆轉錄酶進行逆轉錄，使待轉錄的總RNA轉變成cDNA而不被降解。這種遺傳改造的逆轉錄酶，Expand(Expand是商標)逆轉錄酶，可從Boehringer Mannheim GmbH獲得。
Expand逆轉錄酶是一種RNA指導的DNA聚合酶。該酶是莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉錄酶(M-MuLV-RT)的遺傳改造形式。RNA酶H序列內的點突變將RNA酶H活性降低到可檢測的水平之下。使用該遺傳改造的逆轉錄酶使得能夠獲得更大量的全長cDNA轉錄子。
逆轉錄後，使用PCR技術擴增轉錄的DNA。
優選的是，逆轉錄產物使用嵌套式PCR技術擴增。
優選的是，如果感興趣的區域是RT區域，按Kellam，P.和Larder，B.A.(1994，出處同上)所述使用內部和外部引物來應用嵌套式PCR技術。當感興趣的區域是跨越RT和蛋白酶基因的區域時，使用的特定引物優選是OUT3/IN3(下遊)和RVP5(上遊)的組合。
引物RVP5(Maschera，B.等，病毒學雜誌，69，5431-5436)具有序列5』-GGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGG-3』(SEQ ID NO2)。
圖3提供了擴增的圖示且在實施例2中進行更詳細的描述。
蛋白酶cDNA的擴增實際上涉及半嵌套式PCR方法，這從圖3可明顯地看出。
嵌套式PCR技術相對於已知的簡單PCR技術的優勢在於它能夠獲得最特異性的PCR產物。
然而，為了在PCR期間獲得更高的保真性和產率，可利用熱穩定性聚合酶的混合物(Barnes，W.M.(1994)美國科學院學報(Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A，)91，2216-2220)。這種聚合酶混合物可從BoehringerMannheim GmbH獲得，即Expand(Expand是商標)高保真PCR系統。使用該系統我們獲得了提高的敏感性，即比單獨使用Taq聚合酶的常規PCR方法獲得的高10倍或更高的敏感性。
當pol基因的區域是包括RT和蛋白酶基因的區域時，優選HIV-DNA構建體是RT和蛋白酶基因已缺失的構建體且是以保藏號LMBP3590於1996年11月8日保藏在Belgian Coordinated Collectionsof Microorganisms-BCCM LMBP-Collection的質粒pGEMT3ΔPRT。
然而，可採用一些研究產生含具有蛋白酶以及RT基因缺失的HIV-1原病毒的質粒。一種可能性是藉助於寡核苷酸介導的誘變導入所需缺失。然而，下文實施例2中採用的方法涉及利用特定限制性酶和亞克隆方法產生所需構建體，如下文所述。儘管最終結果取決於可獲得的限制性位點，但該方法的主要優勢在於可迅速獲得最終結果。
為了保證最有效的轉染結果，被轉染的PCR產物理想地應以本身已知的方式經陰離子交換旋轉柱純化。合適的試劑盒是Qiagen集團公司投放市場的QIAquick PCR純化試劑盒。
轉染可經電穿孔，或者另選經過使用脂類，特別是陽性脂類，DEAE葡聚糖，CaHPO4等實現。
在脂類轉染的例子中，可利用荷蘭的Invitrogen B.V.of Leek，投放市場的PERFECT(PERFECT是商標)轉染試劑盒。
因此，為進行轉染，已缺失了選自pol基因的一個或多個基因的HIV-DNA構建體用於與擴增後獲得的產物連結。
如果缺失的只是RT基因，則構建體可以是質粒pHIVΔRT(可從醫學研究理事會(MRC)獲得)。當RT和蛋白酶基因都缺失時，合適的HIVDNA構建體是本文所述的質粒pGEMT3-ΔPRT，且它是高拷貝的載體。該質粒在轉染前根據本身已知的方法線性化。
使用編碼超過一個pol基因酶的構建體，例如ΔPRT構建體，的特殊優勢在於在構建體中包括更多的原始病人物質的可能性比使用單個基因時更大，使擴增的物質更大程度地反映所研究的特定病人的病毒遺傳多樣性。
可以理解優選所選定的用於嵌套式PCR的特異性引物位於待擴增和研究的靶酶主體序列外側。還可預料的是RT和蛋白酶的結合很可能比單獨的RT提供更好的研究RT的結果，因為相對於僅用RT的情況病人產生了多出40個的胺基酸。為研究蛋白酶，應知道蛋白酶的前9個胺基酸仍來自構建體(pGEMT3-ΔPRT)的野生型骨架。
當通過電穿孔實現細胞的轉染時，優化所選的參數以實現較好的細胞生長和病毒生產。以大約250μF和300V可較方便地進行電穿孔。優選的是，在大約10μg線型化質粒，例如pHIVΔRTBstEII和大約5μg擴增的PCR產物，例如RT PCR產物存在的條件下進行電穿孔。當成功地進行細胞內同源重組時，在5至10天內形成新嵌合HIV。在形成嵌合HIV前用已知技術的典型培養時間是12-14天。在-70℃或更低溫度下儲存培養上清等分試樣。
顯而易見的是，可使用上述方法分離和擴增其它HIV基因，例如整合酶基因，或一個以上的其它HIV基因，例如，RT和整合酶基因，且用各自的整合酶或RT/整合酶的PCR產物與缺失了相關基因(或多個基因)的合適的線型化的HIV-DNA構建體結合轉染CD4+T細胞。
滴定新形成的嵌合病毒，然後分析其對不同pol基因酶抑制劑的表型敏感性(敏感性)，優選在自動的細胞基礎試驗中進行。
優選的是，嵌合病毒和野生型HIV病毒株(它是適當的重組野生型HIV病毒株)對一種或多種RT，蛋白酶或整合酶抑制劑的表型藥物敏感性被表達為抑制劑濃度(IC值)。
嵌合病毒和野生型HIV病毒株對一種或多種RT抑制劑和/或一種或多種蛋白酶抑制劑和/或一種或多種整合酶抑制劑的敏感性表達為例如50％或90％的抑制劑濃度(IC50或IC90值)。
優選的是，RT抑制劑選自核苷RT抑制劑，例如AZT，ddI(2』，3』-雙脫氧肌苷/Videx(Videx是商標))，ddC(2』，3』-雙脫氧胞苷)，3TC(lamivudine)，d4T(雙脫氧胸苷)，非核苷RT抑制劑，例如delavirdine(U9051125(BMAP)/Rescriptor(Rescriptor是商標))，loviride(α-APA)，nevirapine(B1-RG-587/Viramune(Viramune是商標)和tivirapine(8-C1-TIBO(R86183))，蛋白酶抑制劑，例如saquinavir，indinavir和ritonavir，整合酶抑制劑，例如咖啡酸苯基乙酯(CAPE)。
合適的RT和/或蛋白酶抑制劑和/或整合酶抑制劑選自核苷RT抑制劑，例如AZT，ddI，ddC，3TC，d4T，1592U89和類似物，非核苷RT抑制劑，例如loviride，nevirapine，delaviridine，ateviridine，和tivirapine(8-C1-TIBO)和類似物，蛋白酶抑制劑，例如saquinavir，indinavir和ritonavir和類似物，整合酶抑制劑，例如咖啡酸苯基乙酯(CAPE)以及在WO95/08540和GB2271566中所述類型的HIV整合酶抑制劑。
根據本發明的方法包括用一種或多種RT抑制劑和/或一種或多種蛋白酶抑制劑和/或一種或多種整合酶抑制劑比較病人HIV病毒株與野生型HIV病毒株的表型藥物敏感性的步驟。為便於理解所試驗的不同藥物化合物(或組合)的敏感性相對變化的表示，構建了一種抗病毒圖。
該圖應解釋如下抗病毒圖中的偏心數據點認定為不可能再有利於HIV感染的病人的化療方案，而在參考多邊形內或其上，或僅略微在參考多邊形外的數據點認定為可能有利於HIV感染的病人的化療方案。
根據本發明的方法與施用正確的抗HIV藥物結合應最終導致更好的治療，改進生活質量且提高HIV感染的病人的存活率；即，可防止或阻止無效治療(由於存在或出現抗性HIV病毒株)，以及可即時開始有效化療。
本發明還涉及醫生用於治療HIV感染的病人的臨床控制儀器，它包括以上文所述的方法可獲得的抗病毒圖。
附圖的簡要描述圖1是質粒pGEMT3-ΔPRT之構建的圖示；圖2是質粒pGEMT3-ΔPRT之構建的進一步和補充圖示；圖3是含蛋白酶和RT基因的HIV-HXB2D序列的該部分的圖示；圖4A-H是含蛋白酶和RT基因的HIV-HXB2D序列的該部分的完整序列；圖5是攜帶實施例5所述的3TC抗性HIV病毒株的病人的抗病毒圖；圖6是攜帶實施例6所述的野生型HIV病毒株的未用藥的病人的抗病毒圖；圖7A是顯示實施例7的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖7B是實施例7的受試者病人的抗病毒圖；圖8A是顯示實施例8的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖8B是實施例8的受試者病人的抗病毒圖；圖9A是顯示實施例9的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖9B是實施例9的受試者病人的抗病毒圖；圖10A是顯示實施例10的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖10B是實施例10的受試者病人的抗病毒圖；圖11A是顯示實施例11的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；圖11B是實施例11的受試者病人的抗病毒圖；圖12A是顯示實施例12的病人藥物敏感性相對變化的線段圖；以及圖12B是實施例12的受試者病人的抗病毒圖。
本發明將以下列實施例進一步說明。
實施本發明的方式實施例1方案1.病毒RNA的提取和擴增。
RNA根據Boom，R.(1990，出處同上)所述的方法從100μl血漿中分離並按製造商所述用GeneAmp逆轉錄酶試劑盒(Perkin Elmer)及使用HIV-1特異性下遊引物OUT35』-CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATC-3』(SED ID NO1)進行逆轉錄。按Kellam，P.和Larder，B.A.(1994，出處同上)所述用內部和外部引物對逆轉錄的RNA進行PCR。氯仿提取並在Centricon 100柱上離心或在陰離子交換旋轉柱(Quiagen)上離心後，分離的PCR產物準備用於轉染反應。
2.質粒的生產和分離。
在大腸桿菌中進行pHIVΔRT(MRC)質粒的生產。按製造商所述利用Qiagen柱從過夜培養物中分離質粒DNA。經過A260/280測量(在λ＝260和280nm時的光密度測量)以分光光度法測定分離的質粒產率。從500ml細菌培養物中獲得了大約250μg超純的質粒DNA。以限制性分析證實分離的質粒的同一性。隨後用BstEII使分離的質粒線型化並再用經典的酚/氯仿提取純化。
3.細胞的轉染。
轉染前以250,000個細胞/ml的密度傳代培養MT4細胞(指數生長期)。沉澱細胞並以3.1 10E6個細胞/ml的濃度重懸於磷酸鹽緩衝溶液中。每次轉染使用0.8ml的部分(2.510E6個細胞/ml)。用Bio-Rad Gene脈衝儀，利用0.4cm的電極杯進行轉染。在10μg線型化的pHIVΔRT質粒和大約5μgRT PCR產物存在的條件下以250μF和300V電穿孔細胞，隨後在室溫下培養30分鐘。隨後向細胞懸液中加入10ml新鮮培養基並在37℃下在5％CO2的加溼空氣中進行培養。
4.轉染細胞的培養和跟蹤。
轉染後7至10天期間，監測細胞的細胞致病作用(CPE)的表現。如果不存在，在不同燒瓶中傳代培養細胞。隨後轉染細胞的培養上清液用於產生重組病毒的原種並以1.5ml的等分試樣儲存於-70℃。
5.來自病人病毒RNA的重組病毒的分析。
滴定新病毒後，在系列稀釋的不同HIV抑制劑存在下將原種用於抗病毒實驗。以MT4細胞中病毒的有限系列稀釋滴定測定收穫的上清液滴定度。
具有有用滴定度的病毒用於抗病毒實驗。為達到該目的，用100μl完全培養基充滿96-孔微滴定板。隨後以25μl的體積將化合物儲液加入系列重複孔中。每種藥物(或藥物組合)包括HIV-和偽-感染的細胞樣品。然後將指數生長的MT4細胞以150,000個細胞/ml的密度轉移到微滴定板上。然後將細胞培養物在37℃下在5％CO2的加溼空氣中培養。感染5天後，以在下文第6部分所述的MTT方法(Pauwels，R.等，病毒學方法雜誌(1988)，20309-321)經分光光度法測定偽感染和HIV感染的細胞的存活。
6.MTT測定。
向微滴定板的每孔中加入20μl的MTT溶液(以7.5mg/ml溶於PBS中)。平板在37℃再培養1小時。然後取出150μl培養基而不擾亂含甲晶體的MT4細胞簇。經過加入100μl在酸化異丙醇(每升溶劑5ml濃HCL)中的5％Triton X-100實現甲晶體的溶解。將平板在平板搖床上放置10分鐘後獲得甲晶體的完全溶解。最後在兩個波長(540和690nm)下讀取吸光率。從這些光密度(OD)數據產生50％抑制(IC50)和50％細胞毒性(CC50)濃度。
實施例2具有HIV-1蛋白酶和逆轉錄酶基因缺失的pHIVΔRTBstEII變異體的構建重複實施例1所述的方案，除了感興趣的HIVpol基因的序列是編碼RT和蛋白酶的序列且製備的構建體是下文所述的pGEMT3-ΔPRT。相對於實施例1所述程序的其它修改在下文列出。
為了擴增病毒RNA，用OUT3引物再進行從RNA逆轉錄成DNA。然而，為了進行嵌套式PCR程序，所用的引物如圖3所示。因此，該嵌套式程序在效果上是半嵌套式PCR程序。
pGEMT3-ΔPRT的生產和分離最終的pGEMT3-ΔPRT構建體是pGEM9-Zf(-)(Promega)的衍生物。
簡單地說，經過將所需的插入片斷HIV-HXB2(蛋白酶和逆轉錄酶缺失的原病毒HIV-1克隆，包括側翼的人序列)導入載體pGEM9-Zf(-)的Xbal限制性位點來構建pGEMT3-ΔPRT構建體。原病毒基因組從蛋白酶基因內的AhdI位點(圍繞9號胺基酸)到pHIVΔRT BstEII構建體(MRC保藏參考ADB231)的BstEII位點已缺失。SmaI和BstEII位點位於ΔProRT缺失的接頭處，它們可用於在轉染前將原病毒構建體線型化。pGEMT3-ΔPRT的構建在圖1和圖2中圖示。在500ml細菌培養物中，pGEMT3-ΔPRT的產率是大約1mg。
如上文所述，質粒pGEMT3-ΔPRT以保藏號LMBP3590於1996年11月8日保藏在Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms-BCCM LMBP-Collection。
意想不到的是將原病毒基因組導入另一載體(pGEM9-Zf(-)代替pIB120)會引起主要問題。pIB120是pEMBL8(-)的衍生物(根據柯達科學成相系統提供的信息)，且pGEM9-Zf(-)是相似載體。然而原病毒載體pIB120HIV在recA+大腸桿菌宿主細胞中可能不穩定(Maschera，B.等，病毒學雜誌，(1995)，69，5431-5436)。因此每次新製備質粒後應證實pGEMT3-ΔPRT構建體的穩定性。
HIV-HXIB2序列HIV-HXB2D序列內感興趣的區域(核苷酸1800-4400)在圖3(示意圖)和圖4(完全序列)中表示。還顯示了一些基因，限制性位點，引物和缺失(ΔPro，ΔRT，ΔProRT)的位置。
HIV-1的序列(分離株HXB2，參考基因組，9718bp)從國家生物技術信息中心(NCBI)，國家醫學實驗室，國家衛生所經ENTREZ文件檢索系統獲得。
Genbank名稱HIVHXB2CGGenbank登記號3455NCBI Seq.ID No327742重組區域與RVP5和OUT3/IN3引物產生的RT-PCR片斷組合，pGEMT3-ΔPRT載體可用於按實施例1，第3部分所述轉染MT4細胞。ΔProRT 5』-端的重組區域含188個核苷酸。ΔProRT 3』-端的重組區域與以前所述(Kellam，P.和Larder，B.A.(1994)，出處同上)相似且含有130個核苷酸。
這些重組區域的長度並不是不重要的。以前的資料(Bandyopadhyay，P.K.等，美國科學院學報，(1984)81，3476-3480；Rubnitz，J.和Subramani，S.(1984)出處同上)證實當序列同源性從214減少到163個鹼基對時，重組頻率減少10倍。而且在電穿孔的細胞內應發生足夠的重組事件以保證產生的病毒表型可靠地反映所治療的HIV陽性病人中存在的類似種類。可經過調節用於電穿孔靶細胞的線型化原病毒載體與RT-PCR片斷的比率首先實現重組事件的最優化。因此具有典型結果的標準方法以前由Kellam，P.和Larder，B.A.(1994出處同上)描述。結果確定將大約2μg的PCR產物(與10μg載體)的起始輸入量增加到大約5μg或更多。其結果是在轉染的細胞培養物中反映出更快的可見病毒生長表現(細胞致病作用)。
重組事件最優化的另一選擇是設計產生更長重組序列的引物。
然而，轉染反應中的實際輸入量常常取決於PCR後的產率。一些樣品具有較高的產率，結果在轉染反應中具有更高的擴增物質輸入量(具有更好的重組效率結果)。然而，儘管重組效率更低，當也可轉染具有較低產率的樣品且樣品會產生具有可信反映病毒群體的活病毒。
實施例3用於ProRT序列RT-PCR的選擇引物相對於實施例2中所用的引物設計了新的引物且應在ProRT區域的5』和3』端都產生更長的重組序列。在各自區域的5』和3』端設計了兩個引物以允許進行嵌套式PCR。如圖3和圖4所示，設計各自的引物時考慮到在ProRT區域的5』端存在直接重複。新的引物如下A PRTO-55』-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG(SEQID NO3)B PRTI-55』-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG(SEQ IDNO4)C PRTI-35』-GATATTTCTC-ATGTTCATCT-TGGG(SEQ IDNO5)D PRTO-35』-AGGTGGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC(SEQ IDNO6)實施例4另一ΔProRT載體的構建如上所述，以寡聚核苷酸介導的誘變可實現另一ProRT缺失的載體的構建。然而也可將ProRT缺失從目前的3』-端擴大到RT基因中的下一個KpnI位點(再向下遊的40個鹼基對)。Klenow處理的KpnI位點與Klenow處理的BstEII位點的連接可恢復起始BstEII識別序列。這樣，該另選的載體行為相似於實施例2所述的pGEMT3-ΔPRT載體，但具有略大的RT缺失。
實施例5從1989年12月到未提供文件記載的後期接受AZT及轉換成從1994年2月到1995年10月接受AZT+3TC(1∶1)的組合化療的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照上文實施例1所述的方案測定其對多種RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB在所述的方案中用作參考HIV病毒株。表1顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。抗病毒圖在圖5中顯示。
表1
從這些數據可確定用3TC的單一療法不可能有利於該特定病人。然而，AZT+3TC的組合療法(目前的療法)仍可能產生正面效果。
實施例6未用藥的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照上文實施例1所述的方案測定其對多種RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB在所述的方案中用作參考HIV病毒株。表2顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。製備了抗病毒圖並在圖6中顯示。
表2
從這些數據可確定病人被非常相似於野生型HIV的HIV病毒株感染。沒有一個藥物方案被排除，因此可用諸如AZT的具有陽性記錄的藥物開始化療。
實施例7未用藥的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實施例1所述的方案測定其對多種RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表3顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖7A中表示。還製備了抗病毒圖並在圖7B中顯示。
表3
從這些數據可確定病人被非常相似於野生型HIV的HIV病毒株感染。沒有一個藥物方案被排除，因此可用諸如AZT，3TC或其它具有陽性記錄的藥物開始化療。
實施例8具有包括AZT，3TC和loviride治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表4顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖8A中表示。還製備了抗病毒圖並在圖8B中顯示。
表4
從這些數據可確定病人被表現出對大多數所檢查的核苷和非核苷抗逆轉錄病毒的藥物的敏感性降低的HIV病毒株感染。仍可用D4T或DDC開始治療。可考慮在治療中包括蛋白酶抑制劑的可能性。
實施例9具有包括多種核苷類似物RT-抑制劑治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表5顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖9A中表示。還製備了抗病毒圖並在圖9B中顯示。
表5
從這些數據可確定病人被表現出對所有核苷類似物抗逆轉錄病毒的藥物的敏感性降低的HIV病毒株感染。非核苷抗逆轉錄病毒藥物應未從治療中排除。這裡也可考慮在治療中包括蛋白酶抑制劑的可能性。
實施例10未用藥的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表6顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖10A中表示。還製備了抗病毒圖並在圖10B中顯示。
表6
從這些數據可確定病人被非常相似於野生型HIV的HIV病毒株感染。沒有一個藥物方案被排除，因此可用諸如AZT，3TC或其它具有陽性記錄的藥物開始化療。
實施例11具有包括RT和蛋白酶抑制劑治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性。重組野生型HIV病毒株recIIIB用作參考HIV病毒。表7顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖11A中表示。還製備了抗病毒圖並在圖11B中顯示。
表7
從這些數據可確定病人被表現出對RT抑制劑3TC和蛋白酶抑制劑indinavir及ritonavir敏感性降低的HIV病毒株感染。因此可用諸如AZT或saquinavir的具有陽性記錄的藥物調節化療。
實施例12具有包括RT和蛋白酶抑制劑治療史的HIV感染的病人捐贈出血漿，按照實施例1所述的方案測定其對許多RT抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性。表8顯示了測量的IC50值(μM)和所述值的比率。顯示藥物敏感性的相對變化的線段圖在圖12A中表示。還製備了抗病毒圖並在圖12B中顯示。
表8
從這些數據可確定病人被表現出對RT抑制劑3TC及AZT和蛋白酶抑制劑indinavir，ritonavir及saquinavir的敏感性降低的HIV病毒株感染。
實施例13表型與基因型的相對比較從接受非核苷RT抑制劑(NNRTI)長期單一治療的HIV感染的個體獲得血漿樣品。按實施例1所述提取HIV-RNA，逆轉錄並擴增。從陽性樣品的外部PCR物質開始，擴增RT基因的前785個核苷酸且該物質進一步用於測基因型。
簡單地說，使用來自Amersham(目錄號RPN2438)帶有7-deaze-dGTP的TermoSequenase(TermoSequenase是商標)螢光標記的引物循環測序試劑盒對該785個核苷酸的片斷進行循環測序反應。選擇4個測序引物使得在RT基因核苷酸27至核苷酸681的兩個方向進行序列測定，這些引物用於每個樣品。反應物在ALF(ALF是商標)自動測序儀(Pharmacia)上分析。產生的序列輸出到Power Macintosh上並用GeneWorks 2.5軟體(牛津分子集團公司)進一步分析。將所得的胺基酸序列與實驗室HIV-1克隆HXB2D的相應序列及病人物質中鑑定的抗性相關突變進行比較。結果在表9中顯示，其中使用單字母胺基酸代碼。
表9
P＝病人表9的頂行顯示了在野生型序列中發現的胺基酸(AA)序列及其位置。在下面各行中顯示了各病人在這些位置上的胺基酸改變。僅顯示了在病人物質中觀察到改變的位置。表9的右部分表示對各病人樣品以根據本發明的方法測定的對不同RT抑制劑的抗性倍數。NNRTI1是給病人施用的非核苷RT抑制劑。NNRTI2是另一個非核苷RT抑制劑，觀察到它與第一個具有一定程度的交叉抗性。
對於核苷類似物RT抑制劑的抗性的基因型測定結果如下-M41L，D67N，K70R，T215F/Y和K219Q/E是AZT抗性相關性突變(Larder，B.和Kemp，S.(1989)，科學246，1155-1158；Kellam，P.等PNAS89，1934-1938)。其在從病人物質分離的HIV基因組中單獨或以不同組合的存在與產生的抗病毒圖(病人11和12)確定的表型抗性相關。
-同樣適用於與M184V突變相聯繫的對3TC的抗性(Tisdale，M.等(1993)PNAS90，5653-5656)，僅在顯示出對該藥物的表型抗性的病人(病人11和16)中觀察到該突變。
關於NNRTIs抗性的基因型測定結果如下-三個病人(3，4和12)沒有與突變相關的NNRTI抗性且在表型上對該藥物敏感。
-大多數顯示出對NNRTIs的表型抗性的病人具有與在位置103突變(K103N/S)相關的NNRTI抗性。
-一個病人(9)具有與突變相關的Y181C NNRTI抗性且顯示出對NNRTI1的高表型抗性(＞1432倍)。
-病人13具有一些與突變相關的NNRTI抗性(K101E，部分K103N和部分G190A)。該病人也顯示出對NNRTI1的高表型抗性(＞1466倍)。在該樣品中觀察到的E138A突變至今未與抗性相聯繫。然而，在這一相同位置的另一突變，即，E138K，已證實在對TSAO化合物的抗性中起重要作用(Balzarini，J.等，(1993)PNAS 90，6952-9656)。E138A突變的作用仍需測定。
-病人20具有與突變相關的A98G NNRTI抗性且顯示出對所試驗的NNRTIs的表型抗性。
-病人22具有與突變相關的V108I NNRTI抗性但不顯示出對所試驗的NNRTIs的任何表型抗性。
-病人24顯示出沒有與突變相關的NNRTI抗性(在一些HIV-1野生型基因組中發現K101Q突變)但對所試驗的NNRTIs具有表型抗性。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱VIRCO N.V.
(B)街道Drie Eikenstraat 661(C)城市Edegem(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-2650(A)名稱DE BETHUNE，Marie-Pierre(B)街道Tweeleeuwenstraat 15(C)城市Everburg(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-3078(A)名稱HERTOGS，KURT(B)街道Sint Vincentiusstraat 53(C)城市Antwerpen(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-2018(A)名稱PAUWELS，Rudi(B)街道Damstraat 166(C)城市Weerde(E)國家比利時(F)郵編(ZIP)B-1982(ii)發明名稱根據人類HIV病毒株的表型藥物敏感性控制HIV陽性病人化療的方法(iii)序列數6
(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請號EP 96200175.6(B)申請日1996年1月26日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO1的序列描述CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA
(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO2的序列描述GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO3的序列描述GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO4的序列描述TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO5的序列描述GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG
(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(vi)原始來源(A)生物人類免疫缺陷病毒1型(xi)SEQ ID NO6的序列描述AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC
權利要求
1.一種臨床控制系統，用於控制HIV陽性病人的HIV化療，所述系統包括在多邊形或準圓形圖上圖示多個數據組，其中所述數據組的生成方法是以來自HIV pol基因的序列和已缺失該序列的HIV-DNA構建體體外轉染對HIV感染敏感的細胞系，所述序列通過從病人的生物學材料的樣品分離病毒RNA並逆轉錄所述pol基因的所需區域而獲得的；培養所述轉染的細胞以產生嵌合病毒的原種，評價所述嵌合病毒對HIV pol基因編碼的所述酶的抑制劑的表型敏感性並對其指定一個值，構建含有所述嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相應值的數據組，重複至少二個其它抑制劑的敏感性評價從而構建總共至少三個該數據組，以二維或三維圖解方式圖示該數據組，由此(a)多個從原點放射延伸的標準化軸，每個軸相應於一個數據組或抑制劑或其組合；(b)軸被標準化使野生型HIV對各種抑制劑的敏感性值在各軸上相等，任選表示野生型HIV的數據點並連接起來形成規則多邊形，其頂點在軸上，而其中心由原點限定；(c)在各軸上描繪出相應於所述軸的表示嵌合HIV原種對抑制劑敏感性值的數據點，任意連接嵌合數據點以形成規則或不規則的多邊形，其形狀表示嵌合原種對一定範圍的抑制劑的抗性；以便各數據組中嵌合型和野生型敏感性之間的區別提供嵌合原種對所述抑制劑處理的抗性的肉眼測量值。
2.根據權利要求
1的臨床控制系統，其中各軸上有對數刻度。
3.根據權利要求
1或2的臨床控制系統，其中在嵌合多邊形中如果表示了偏心數據點，則認定的抑制劑可認為其對病人具有很小或沒有用處，而位於野生型多邊形內，其上或靠近其外側的數據點認定的抑制劑可認為其對病人具有實質性用處。
4.根據前面任一權利要求
的臨床控制系統，其中所述的三個或更多個數據組中的每一個還含有對所述抑制劑最壞情況可測量抗性的值，在所述的圖示中表示所述的最壞情況值，使嵌合原種的數據點可與野生型和最壞情況HIV相比，從而提供對特定情況中抑制劑相對值的評價。
專利摘要
一種控制HIV陽性病人化療的方法，包括用一個序列，優選來自從病人獲得的HIV pol基因的編碼RT和蛋白酶的序列和已缺失該序列的HIV－DNA構建體轉染對HIV感染敏感的細胞系，培養轉染的細胞以產生嵌合病毒的原種，評價嵌合病毒對HIV pol基因編碼的酶的抑制劑的表型敏感性並對其指定一個值，構建含有嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相應值的數據組，重複至少二個其它的抑制劑的敏感性評價從而構建總共至少三個該數據組，以二維或三維圖解形式表示該數據組使各數據組中嵌合型和野生型敏感性之間的區別提供嵌合原種對所述抑制劑處理的抗性的肉眼測量值，根據所測量的抗性圖示選擇最適抑制劑。該方法經濟而快捷地得到大量不同的HIV感染的病人的表型信息。該方法可應用於所有目前可得到的化療方案且預期同樣可應用於將來的化療方案。
文檔編號C12N15/86GK1991365SQ200610168506
公開日2007年7月4日 申請日期1997年1月24日
發明者瑪麗－皮埃爾·德貝蒂納, 庫爾特·赫託格斯, 魯迪·保弗爾斯 申請人:沃爾科股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan