腹瀉性貝類毒素標準樣品及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-29 20:31:21

專利名稱：腹瀉性貝類毒素標準樣品及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種貝類毒素標準樣品及其製備方法和應用，具體地說，涉及一種腹瀉性貝類毒素標準樣品及其製備方法和應用。
背景技術：
貝類毒素屬海洋天然有機物，它的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關。據文獻報導，能形成赤潮的微藻約有184 267種,其中有毒微藻約為60 78種。有毒藻類產生的毒素往往通過食物鏈進入貝類體內，因而通常稱這些毒素為貝毒，人們食用帶有貝毒的貝類造成中毒。貝類毒素的種類很多，目前發現的主要有麻痺性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisons,DSP)、神經性貝類毒素(NSP)和記憶缺失性貝類毒素 (ASP)四大類。腹瀉性貝類毒素(DSP)是海洋中藻類或微生物產生的一類脂溶性次生代謝產物， 在貝體內性質非常穩定，一般的烹調加熱不能使其破壞。人類誤食會產生以腹瀉為主要特徵的中毒症狀，嚴重者可出現黃疸、急性萎縮性肝壞死。被DSP毒化的貝類與當地海洋汙染有關，與赤潮關係密切。可被DSP毒化的貝類是雙殼貝類，主要是扇貝、貽貝、雜色蛤、文蛤、 牡蠣等，不論什麼貝類，DSP —般均局限在中腸腺。近年來，由DSP所引起的食物中毒事件在世界各地不斷有報導，DSP在海洋生物毒素中，尤其是在貝類毒素中佔據重要地位，已成為影響貝類養殖業和食品衛生的一個嚴重問題。近年來貝類毒素已成為一個重要的公共衛生問題，已有多個國家對食品中貝毒限量進行控制，WHO也發布了關於預防貝毒危害、保護公共衛生的草案。我國是海洋經濟貝類生產和出口大國，年產貝類約1100萬噸，佔世界總量70%。近10多年來，由於工業汙染等原因導致我國近海赤潮頻發，嚴重影響了海洋水產養殖發展和出口貿易。歐盟自1995年發生食用中國進口貝類中毒事件以後，對我國的貝類進口已採取無限期閉關；韓國、日本、美國等國也對我國進口貝類及相關產品制定了嚴格的限制措施。貝類毒素已成為妨礙我國沿海漁業經濟發展的一大公害，貝類食品的安全是重大公共衛生問題，是制約我國海洋漁業經濟發展的一個重要因素。目前，人們對赤潮及貝類毒素還無法進行有效的控制，因此預防和預報是減輕其危害的有效手段。WHO推薦的最有效的預防方法是對水源或收穫區域開展控制監測程序。 在貝類生產的各個環節，隨時監測貝類毒素的變化是至關重要的。已經建立了很多檢測DSP 的方法，如生物檢測法、免疫分析法、細胞毒性檢測法及化學分析法等，但每一種方法都必須使用標準樣品或質控樣品來作質控和定量。貝類毒素標準樣品很難獲得，一則因其為劇毒物質，世界各國對貝類毒素的出入境有嚴格的控制管理規定；另外貝類毒素種類繁多，極不穩定，很難保存。這勢必極大限制了對貝毒有效監測，從而會給貝類養殖企業造成無法彌補的損失。我國對於具有溯源、有證、實物標樣的腹瀉性貝類毒素標準樣品或質量控制樣品製備技術是個空白，尚未見有關腹瀉性貝類毒素標準樣品的研製報導。研製腹瀉性貝類毒素實物標準樣品可以滿足對貝類毒素標準樣品不斷日益擴大的市場需求，解決國內外貝類產品檢測實驗室的嚴重缺乏貝類毒素標準樣品的需求，對提高食品安全檢測技術、解決技術壁壘、保障食品安全起到重大的作用，同時也提高我國在國際上的影響力。

發明內容
本發明的一個目的在於提供一種腹瀉性貝類毒素標準樣品的製備方法。本發明另一目的在於提供本方法製備的該腹瀉性貝類毒素標準樣品。本發明的第三個目的在於提供該腹瀉性貝類毒素標準樣品的應用。為了達到上述目的，本發明腹瀉性貝類毒素標準樣品的製備方法，包括以下步驟A)將貝類樣品去雜質取中腸腺；B)在所述中腸腺樣品中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均質、混勻後得到勻漿液；C)將所述勻漿液預冷後進行冷凍乾燥得到粗樣；D)研磨所述粗樣後過篩，得到貝類凍乾粉；E)向所述貝類凍乾粉中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混勻，預冷後再次進行冷凍乾燥得到標準樣品；F)封裝所述標準樣品；G)檢驗所述標準樣品的均勻性和穩定性；H)對所述標準樣品的DSP含量進行定值；其中，所述貝類樣品包含DSP陽性或陰性的貝類樣品。優選方式下，所述步驟B中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 2 5 1，所述混合溶液的體積量為加入蒸餾水體積的1/10 1/5 ;蒸餾水的加入量與所述腸腺樣品等體積。所述步驟E中向所述貝類凍乾粉中加入五倍體積蒸餾水，加入一倍體積的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液；所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 : 2 5 : I。最優方式下，所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液甲醇丙酮乙醚體積比為3:2:1。此外，優選方式下，所述步驟C中的預冷溫度為_196°C _20°C，相應預冷時間為 30min 24h ;所述步驟E中的預冷溫度為-196°C _20°C，相應預冷時間為IOmin 6h。 所述步驟D中，過篩的目數為30 60目。本發明方法製備的腹瀉性貝類毒素標準樣品，其毒素組分包括0A，PTX2 ；DSP總含量為 I. O 15 μ g/go本發明提供了上述製備方法製備的腹瀉性貝類毒素標準樣品。本發明製備方法製備的腹瀉性貝類毒素標準樣品，用於實驗室間腹瀉性貝類毒素測試項目的能力驗證活動，還用於定量或定性檢測腹瀉性貝類毒素，以及用於檢測方法的驗證、測試儀器的校準、測試結果的質量控制與考核等。本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品及其製備方法，填補國內外空白，原料成本低， 且製備方法簡單，不涉及昂貴的工藝設備，得到的標準樣品為實物標準樣品，均勻穩定，易保存，不僅解決了 DSP成分極易降解的難題，而且勢必使得到的腹瀉性貝類毒素標準樣品的價格遠遠小於目前市場上銷售的腹瀉性貝類毒素標準純品的價格，確保貝毒檢測的有效性，有利於對貝毒有效監測。本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品可用於實驗室間腹瀉性貝毒測試能力驗證，用於定量或定性檢測麻痺性貝類毒素，適合於食品、漁監、環保、質檢、漁業、衛生等各個部門使用，可促進水產養殖、加工和貿易發展，確保食品安全，將帶來顯著的社會效益和經濟效益。


圖I是腹瀉性貝類毒素OA組分的化學結構式；圖2是腹瀉性貝類毒素PTX2組分的化學結構式；圖3是本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品製備工藝流程示意圖；圖4是本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品的LC-MS譜圖。
具體實施例方式如圖I和圖2所示腹瀉性貝類毒素的化學結構式。如圖3所示，本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品的製備方法，包括以下步驟(A) 取樣、去雜質；(B)勻漿；(C)冷凍乾燥；(D)研磨、篩分；(E)混樣，再次冷凍乾燥；(F)封裝; (G)均勻性和穩定性檢驗；⑶確定DSP含量。一種優選實施方式中，本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品的製備方法，包括以下步驟㈧取DSP陽性貽貝，用清水徹底清洗貝類外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內部去除泥沙及其他異物，取出貝肉(避免破壞中腸腺)，仔細切取全部中腸腺備用。(B)在中腸腺樣品中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均質、混勻後得到勻漿液。優選方案，加入等體積蒸餾水。甲醇-丙酮-乙醚體積比為3 6 : 2 5 : 1， 最優體積比3 2 1，甲醇-丙酮-乙醚混合溶液加入的體積量為蒸餾水的1/10 1/5。(C)將所述勻漿液預冷後進行冷凍乾燥得到粗樣。優選方法，將勻漿液置於_196°C _20°C相應預冷30min 24h後進行冷凍乾燥， 得到DSP陽性粗樣。(D)將凍幹後的DSP陽性粗樣進行研磨、預粉碎、細磨後過30 60目篩，得到貽貝凍乾粉。(E)向所述貝類凍乾粉中加入水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混勻後，預冷後再次進行冷凍乾燥得到標準樣品。優選方案，加入五倍體積蒸餾水，加入一倍體積的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液； 所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 : 2 5 : 1， 最優體積比3 : 2 : I。此外，預冷溫度為_196°C -20°C，相應預冷時間為IOmin 6h。(F)在恆溫恆溼、無菌操作間中，將上述方式獲得的標準樣品分裝於無菌避光瓶中封蓋密封。(G)對樣品的均勻性和穩定性檢驗是驗證樣品製備過程有效性的主要方法，將封裝後的樣品進行均勻性和穩定性檢驗。(H)對標準樣品的DSP含量進行定值。
在另一優選實施方式中，本發明的腹瀉性貝類毒素標準樣品的製備方法，包括以下步驟(A)分別取DSP陽性、陰性的貽貝，用清水徹底洗淨貝類外殼，切斷閉殼肌，開殼， 用清水淋洗內部去除泥沙及其他異物，取出貝肉(避免破壞中腸腺)，仔細切取全部中腸腺備用;(B)將切取的貝類中腸腺加入蒸餾水，及加入甲醇-丙酮-乙醚(體積比為 3:2:1)的混合溶液，均質，混勻得到勻漿液；(C)將勻漿液置於-196°C _20°C相應預冷30min 24h後進行冷凍乾燥，得到 DSP陽性或陰性粗樣；(D)將凍幹後的DSP陽性、陰性粗樣進行研磨、預粉碎、細磨後過30 60目篩；(E)混合DSP陽性凍乾粉、陰性凍乾粉，其中所述DSP陽性凍乾粉佔凍乾粉總重的 1% 99%，加入五倍體積蒸餾水和I倍體積甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，攪拌，混勻，置於-196°C _20°C相應預冷IOmin 6h後再次進行冷凍乾燥，徹底除去水分得到DSP標準樣品；(F)在恆溫恆溼、無菌操作間中，將上述方式獲得的標準樣品分裝於無菌避光瓶中封蓋密封；(G)對樣品的均勻性和穩定性檢驗是驗證樣品製備過程有效性的主要方法，將封裝後的樣品進行均勻性和穩定性檢驗；(H)對標準樣品的DSP含量進行定值。此外，以DSP陰性的貽貝和DSP陽性的貽貝的中腸腺為原料，採用本發明的製備方法也可得到腹瀉性貝類毒素標準樣品(此時可省略步驟E中混合DSP陽性、陰性凍乾粉的步驟)。在本發明中，按SN/T 1996-2007貝類中腹瀉性貝類毒素檢驗方法，酶聯免疫吸附法，對貽貝中的DSP進行確定實驗，採用的新鮮貽貝的DSP含量> O. 16 μ g/g,說明是DSP陽性的樣品，採用的新鮮貽貝的DSP < O. 16 μ g/g，說明是DSP陰性的樣品。以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例I :取DSP陽性的貽貝，其DSP含量為O. 56 μ g/g(新鮮貝肉)，用清水將貝殼外表徹底洗淨，切斷閉殼肌，開殼，用蒸餾水淋洗內部去除泥沙及其他外來物等雜質， 將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，取出全部貝肉，仔細切取全部中腸腺。向切取中腸腺中加入等體積的蒸餾水，及佔蒸餾水體積1/10體積的甲醇-丙酮-乙醚混合溶液(體積比為3 2 I)，混勻後置於-80°c預凍至少4小時，採用真空冷凍乾燥機(CHRiST Epsilon 2-6D)進行冷凍乾燥，之後進行組織研磨，預粉碎，採用高鋁瓷球磨機細磨，過 40目篩，得到DSP陽性粗粉，加入蒸餾水和甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，攪拌，混勻，置於-196°C _20°C相應預冷IOmin 6h後再次進行冷凍乾燥，徹底除去水分得到DSP標準樣品。在恆溫恆溼、無菌操作間中，將上述方式獲得的貽貝凍乾粉分裝於經160°C乾熱處理 2小時的潔淨的5ml棕色西林瓶中封蓋密封。實施例2-5重複實施例I中的製備過程，不同之處僅在於原料的DSP含量、甲
6醇-丙酮-乙醚混合溶液體積比及用量(與蒸餾水體積比)、預冷溫度、預冷時間及過篩目數，具體實驗條件如表I所示。表I實施例2-5的實驗條件
權利要求
1.一種腹瀉性貝類毒素標準樣品的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟A)將貝類樣品去雜質取中腸腺；B)在所述中腸腺樣品中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均質、混勻後得到勻漿液；C)將所述勻漿液預冷後進行冷凍乾燥得到粗樣；D)研磨所述粗樣後過篩，得到貝類凍乾粉；E)向所述貝類凍乾粉中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混勻，預冷後再次進行冷凍乾燥得到標準樣品；F)封裝所述標準樣品；G)檢驗所述標準樣品的均勻性和穩定性；H)對所述標準樣品的DSP含量進行定值；其中，所述貝類樣品包含DSP陽性或陰性的貝類樣品。
2.如權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟B中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 2 5 1，所述混合溶液加入體積量為蒸餾水的 1/10 1/5 ;蒸餾水的加入量與所述腸腺樣品等體積；所述步驟E中向所述貝類凍乾粉中加入五倍體積蒸餾水，加入一倍體積的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液；所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 2 5 I。
3.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3:2:1。
4.如權利要求1-3任一所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟C中的預冷溫度為-196 V -20 °C,相應預冷時間為30min 24h ;所述步驟E中的預冷溫度為-196。。 -20 °C，相應預冷時間為IOmin 6h。
5.如權利要求I所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟D中，過篩的目數為30 60目。
6.根據權利要求I 5任一項所述的製備方法製備的腹瀉性貝類毒素標準樣品。
7.如權利要求6所述的腹瀉性貝類毒素標準樣品，其特徵在於，所述標準樣品的毒素組分為0A、PTX2。
8.如權利要求6所述的腹瀉性貝類毒素標準樣品，其特徵在於，所述標準樣品的DSP含量為 I. O 15 μ g/go
9.根據權利要求I 5中任一項所述的製備方法製備的腹瀉性貝類毒素標準樣品的應用，其特徵在於，用於實驗室間腹瀉性貝類毒素測試項目的能力驗證活動。
10.根據權利要求I 5中任一項所述的製備方法製備的腹瀉性貝類毒素標準樣品的應用，其特徵在於，所述標準樣品用於定量或定性檢測腹瀉性貝類毒素。
全文摘要
本發明公開了一種腹瀉性貝類毒素標準樣品及其製備方法和應用，通過將包含DSP陽性的新鮮貝類去殼後取中腸腺，加入有機溶劑，勻漿，初次冷凍乾燥得到粗樣，將粗樣研磨過篩，得到凍乾粉，將凍乾粉再次分散至有機溶劑中，冷凍乾燥後製得，具有較好的均勻性和穩定性，可用於實驗室間腹瀉性貝類毒素測試項目的能力驗證活動及定性、定量檢測腹瀉性貝類毒素，也可用於檢測方法的驗證、測試儀器的校準、測試結果的質量控制與考核。本發明原料成本低，且製備方法簡單，得到的標準樣品為實物標準樣品，均勻穩定，易保存，有利於對貝毒的有效監測。
文檔編號G01N33/00GK102584861SQ20121000980
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優先權日2011年9月28日
發明者曹際娟, 王秋豔, 田苗, 程根武, 趙昕 申請人:王秋豔