一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿...的製作方法

2023-05-29 20:24:16 1

專利名稱：一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物學技術和汙染土壤生物修復技術交叉領域，具體的說一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法。
背景技術：
石油是一種含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳香烴、脂環烴)及少量其他有機物(硫化物、氮化物、環烷酸類等)的複雜混合物，是人類最主要的能源之一。但是，隨著石油開採和使用量的增加，大量的石油及其加工品進入環境，其中原油開採和冶煉過程中的工業汙水排放和溢油洩漏事故是導致土壤石油烴汙染的主要原因，不僅破壞了生態環境，還可通過食物鏈的生物富集作用而直接危害人類健康。特別是多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAHs)，由於其生物可利用度差、半衰期較長，並且大多具有致畸、 致癌和致突變效應，因此成為人類健康的巨大威脅。我國石油工業發展迅速，但也隨之帶來嚴重的環境汙染問題，有近千萬畝的耕地受到不同程度的石油烴汙染。因此，對石油烴汙染土壤進行修復、恢復其生態功能以保障農產品安全是一項十分迫切的任務。環境中的微生物由於其高度的遺傳多樣性和功能多樣性，在汙染物降解過程中發揮著重要作用，從實驗室分離高效功能微生物並投加到環境中加速汙染物的代謝是目前主要採用的微生物修複方式。但由於接種的高效降解菌與土著微生物在營養和空間上的競爭及環境中的各種不利條件，往往導致接種的功能微生物很難存活，不能持久發揮生物修復作用。這一問題成為制約生物修復技術高效、持久發揮作用的「瓶頸」。為解決上述「瓶頸」問題，一些學者提出接種攜帶特定降解基因的廣宿主可自我轉移質粒(Self-transmissible broad host range plasmids)，接種後，隨著廣宿主代謝質粒在環境中的水平基因轉移，代謝基因轉移至土著細菌並在其中表達，可使具有競爭性的土著微生物獲得降解能力，從而不必考慮供體菌的存活條件。這種由廣宿主質粒水平基因轉移介導的生物修復提出了與傳統生物修復技術完全不同的思路和概念，有望成為一種新的汙染物生物修復途徑。所謂的「廣宿主質粒」被定義為至少能夠在變性細菌(Proteobacteria)兩個亞綱 (例如β_，Y")之間互相轉移並穩定傳代的質粒。廣宿主質粒的結構一般由兩個區域組成，一個是質粒骨架(與質粒的複製、穩定性和可轉移性有關)，一個是裝配基因(能夠賦予宿主特定的表型，例如抗藥性、金屬抗性、降解汙染物特性等)。這兩個區域一般形成「嵌合」結構(如附圖ι所示)，並都具有遺傳多樣性。目前僅有少數廣宿主質粒進行了全序列分析或者遺傳特性鑑定，在2004年以前進行全序列分析的廣宿主質粒僅有7個。並且研究比較透徹的可自我轉移廣宿主質粒，大都是從可培養的宿主中分離的，提取質粒後進行廣宿主性和遺傳多樣性分析，即所謂的「內源分離法」。但這種方法存在著很大的局限性，首先，大部分細菌是不可培養的，因此這種傳統的從可培養宿主中分離質粒的方法大大降低了發現新的廣宿主質粒的機率；其次，這種方法不涉及質粒的轉移過程，因此在分離過程中不能確定所分離質粒的自我轉移特性。為了避免這一問題，發展了「外源質粒分離」方法，其中在國外應用較早的是「雙親配對法」。雙親外源質粒分離法的基本原理是，環境樣品本源微生物群落作為廣宿主質粒供體，通過與合適受體菌之間的接合轉移，然後通過質粒所編碼的特定表型特徵(例如重金屬抗性或者降解汙染物的能力)篩選接合子，從而從環境樣品中獲得廣宿主質粒。但這種方法的局限性在於所分離的質粒必須具有特定的表型特徵，才能作為篩選接合子的標記。

發明內容
本發明目的在於提供一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法的方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，選用不同的ftOtecAacteria亞綱的染色體帶有選擇標記的受體菌與攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+)並帶選擇標記質粒的供體菌，通過與樣品三親配對接合，供體菌的質粒在樣品中的可自轉(Tra+Mob+)廣宿主質粒的協助下進入受體菌，，接合子通過受體菌和供體菌帶有的篩選標記進行篩選，再將篩選的含有可自轉廣宿主質粒的接合子在以石油烴為唯一碳源的培養基中培養，篩選能夠降解石油烴的廣宿主質粒。所述篩選方法具體為1)製備微生物細胞懸液取待測樣品加入生理鹽水中在搖床上震蕩，而後將懸浮液靜置，取上清液進行離心；沉澱置於LB液體培養基中重懸，充分渦流，待用；2)供體菌和受體菌的活化和液體培養分別將凍存的攜帶不能自我轉移 (Tra-Mob+)，並帶選擇標記質粒的供體菌和染色體帶有選擇標記的受體菌在含有相應選擇標記的LB固體培養基30°C下過夜培養；而後上述供體菌、受體菌單菌落分別接種於不含有選擇標記的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養，待用；3)三親配對用稀釋10倍的LB培養液將步驟2、中生長充分的供體菌和受體菌培養液分別稀釋至10_2倍；分別取上述稀釋後供體菌和受體菌與微生物細胞懸液混合，而後離心並用1/10LB液體培養基重懸上述沉澱，重懸後培養液滴至LB固體培養基中30°C下過夜培養，待用；4)接合子篩選刮取步驟幻中生長的菌苔，於無菌生理鹽水中重懸培養物，用無菌生理鹽水在無菌條件下稀釋至10_4，取0. Iml稀釋度為IOtl-KT1的上述重懸培養物塗布含受體菌的選擇標記和供體菌質粒的選擇標記的雙選擇標記的LB固體培養基中，置於30°C 恆溫培養箱中，過夜培養；5)質粒小量製備和多樣性驗證挑取步驟4)中接合子單菌落，接入上述含雙選擇標記的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養；而後採用SDS-鹼解法提取接合子的質粒，並通過瓊脂糖凝膠電泳，篩選廣宿主質粒；獲得質粒DNA後，選取常用限制性內切酶對所分離的質粒進行酶切分析，一般認為經兩種以上內切酶切割後，不同的電泳指紋圖譜代表不同的質粒。6)質粒石油烴代謝功能驗證將上述所得接合子接種於以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基中培養，具有石油烴降解能力的接合子在液體培養基中會表現出生長，待培養液中培養基變渾濁，0D600明顯變化，即為該接合子含有以石油烴為唯一碳源的廣宿主石油烴代謝質粒；或將上述所得接合子點種在以多環芳烴組分為唯一碳源的固體雙層平板上30°C 培養，具有石油烴降解能力的接合子在液體培養基中會表現出生長，並將固體平板在紫外光下，菌落周圍培養基在紫外光下的吸收減弱，菌落周圍出現降解暗圈，即該接合子含有以多環芳烴為唯一碳源的廣宿主石油烴代謝質粒。所述LB液體培養基配方為胰蛋白腖10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，用蒸餾水定容至1000ml，pH 7. 2-7. 4 ；LB固體培養基配方為在LB液體培養基中加入2%重量的瓊脂粉。以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基取5g/L石油烴組分母液(丙酮或水配製)，0. 22 μ m濾膜除菌，量取50-200 μ 1母液，加入50ml滅菌的液體無機鹽培養基，使底物的終濃度為50-200mg L—1。所述以多環芳烴組分為唯一碳源的固體雙層平板為無菌的平皿中先傾入20ml 下層培養基，下層培養基為固體無機鹽培養基；待下層培養基凝固後，再加入IOml上層培養基，上層培養基為含有多環芳烴的固體無機鹽培養基即以多環芳烴為唯一碳源的固體無機鹽培養基。液體無機鹽培養基配方為=K2HPO42g、KH2PO4 0.5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgSO4 0.2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液lml，用蒸餾水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方為 FeSO2 · 7H20 2g、MnSO2 · H2O 2g、Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g, ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 · 6H20 0. 2g，用蒸餾水定容至 1000ml ；固體無
機鹽培養基配方為液體無機鹽培養基中加入2%重量的瓊脂粉。所述供體菌為E. coli JM109 (pBBRlMCS)(質粒編碼氯黴素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farri s, R.Mart in Roop II and Kenneth M. Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166(1995)175-176.，E.coli JMlO9 (pBBRlMCS-5)(質粒編碼慶大黴素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farris, R. Martin Roop II and Kenneth M. Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene, 166 (1995) 175-176.或 Ε. coli DH5 (pSU4814)(質粒編碼氯黴素抗性)[Belen Mftez and Fernando de la Cruz. Two atypical mobilization proteins are involved in plasmid CloDF13 relaxation. Molecular Microbiology (2001) 39 (4)，1088-1099;受體菌為 Ε· coli K12rif (利福平抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990, 2471-2479.、E. coli K12nal (萘啶酸抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology,1990，2471-2479.、、P. putida UW3 (利福平抗性)Winnie Dejonghe, Johan Goris, Said el Fantroussi, Menica Hof te, Paul de Vos, Willy Verstraete, and Eva M. Top. Effect of Dissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2,4~D)Degradation Plasmids on 2,4-D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons. Applied and Enironmental Microbiology,2000,3297-3304
或C.necator JMP228 (利福平抗性)Eva Μ. Top, William E.Holben，and Larry J. Forney. Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation. Applied and Enironmental Microbiology,1995，1691-1698。上述供體菌或受體菌可參見文獻中記載其所帶質粒。本發明中，所選取的代表性的石油烴底物包括正構烷烴(正辛烷)、單環芳烴(苯、 甲苯)、多環芳烴(萘、芴、菲)及其主要代謝中間產物(水楊酸、鄰苯二酚)為底物。多環芳烴的降解能力可通過固體雙層平板法驗證，其他底物可採用液體搖瓶法驗證。三親配對接合法原理為一個攜帶質粒的供體菌，該質粒可被移動但不能自我轉移(Tra-Mob+)，並帶有一定選擇標記；一個染色體帶有選擇標記的受體菌，該受體菌與供體菌在遺傳分類上最好是屬於不同的I^rotecAacteria亞綱，這樣就能增加分離廣宿主質粒的機率；第三個元素就是含有廣宿主可自我轉移質粒(Tra+Mob+)的土壤樣品。當三方進行接合配對時，供體菌的質粒(Tra-Mob+)在土壤本源微生物群落所含有的廣宿主質粒的協助下轉移進入受體菌，通過特定的篩選標記，就能夠得到同時獲得供體菌質粒 (Tra-Mob+)和土壤樣品中的廣宿主質粒(Tra+Mob+)的接合子，從而大大擴展了所分離質粒的範圍(如附圖2所示)。本發明的有益效果如下1.本發明採用三親配對接合法從土壤樣品中直接篩選得到廣宿主代謝質粒，可以直接從土壤樣品中獲得由廣宿主質粒攜帶的降解基因資源，並有望開發一種由廣宿主質粒水平基因轉移介導的新的生物修復途徑。2.本發明所採用的三親配對接合法，參與配對的供體菌和受體菌在遺傳分類上一般屬於不同的ftOtecAacteria亞綱，增加了分離廣宿主質粒的機率。3.與傳統「內源分離法」和「雙親配對接合法」相比，本發明三親配對接合技術不必考慮質粒原來的宿主是否可培養，也不必預先知道質粒本身所攜帶的表型特徵(例如某種石油烴組分的降解能力)。4.實驗室研究表明，採用本發明提供的「三親配對接合法」，能夠從石油汙染土壤中篩選降解正辛烷、多環芳烴萘、芴和菲的廣宿主代謝質粒，從而為進一步採用該質粒進行汙染土壤生物修復提供了遺傳材料。


圖1為廣宿主質粒的「嵌合」結構示意圖。圖2為本發明實施例提供的採用三親配對接合法從環境樣品中分離自轉移廣宿主質粒示意圖。圖3為本發明實施例提供的質粒PSF2-1和質粒pSFl_3瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
圖4為本發明實施例提供的質粒PSF2-1和質粒pSFl_3 pstl酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖5為本發明實施例提供的質粒pSFl-3在芴雙層平板上形成的降解暗圈(紫外燈下觀察)。圖6為本發明實施例提供的質粒PSF2-1在菲雙層平板上形成的降解暗圈(紫外燈下觀察)。圖7為本發明實施例提供的質粒pSF5-22、pSF5_M和pSF6_21瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖8為本發明實施例提供的質粒pSF5-22、pSF5-24和pSF6_21 EcoR I酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖9為本發明實施例提供的質粒PSF5-22和pSF5_M在萘雙層平板上形成的降解暗圈(紫外燈下觀察)。圖10為本發明實施例提供的質粒PSF6-21在菲雙層平板上形成的降解暗圈(紫外燈下觀察)。
具體實施例方式本發明篩選路線為土壤樣品採集一土壤微生物細胞懸液製備一供體菌、受體菌活化和液體培養一三親配對接合一篩選接合子一提取接合子質粒、酶切驗證質粒多樣性一驗證廣宿主質粒的石油烴代謝能力。詳細實施步驟為1) 土壤樣品採集和保存採集表層(0-20cm) 土壤樣品，過Imm篩，4°C冰箱保存；2)製備土壤微生物細胞懸液將5g 土壤樣品加入盛有25ml生理鹽水(0. 85% NaCl溶液)的IOOml三角瓶中，在搖床上震蕩1小時；懸浮液靜置約30min，將上清液倒到 30ml無菌離心管中，10，OOOrpm 4°C離心IOmin ；沉澱置於:3ml 1/10LB液體培養基中重懸， 充分渦旋；3)供體菌和受體菌的活化和液體培養將凍存的供體菌、受體菌甘油管從-70°C 冰箱中取出，分別在含有相應選擇標記的LB固體平板上劃線，置於30°C過夜培養。受體菌與供體菌在遺傳分類上最好是屬於不同的I^rotecAacteria亞綱，這樣就能增加分離廣宿主質粒的機率。用滅菌接種針將上述培養好的供體菌、受體菌菌落分別接種於5ml不含抗生素的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養。所述供體菌攜帶質粒，該質粒可被移動但不能自我轉移(Tra-Mob+)，並帶有一定選擇標記；受體菌染色體帶有選擇標記。4)三親配對接合用1/10LB培養液將步驟幻中生長充分的供體菌和受體菌培養液稀釋至10_2倍；對照組分別為移取500 μ 1稀釋後的供體、受體和步驟幻中的土壤細胞懸液至1. 5ml管中，共3組對照；配對組需將上述三方各500 μ 1移至同一管中。對照組和配對組均以10，OOOrpm離心2_;3min。50 μ 1 1/10LB液體培養基重懸上述沉澱，滴至LB固體平板上，30°C過夜培養。(土壤和配對懸浮液會含有土壤顆粒，50 μ 1可能很難重懸，儘可能的將所有的懸浮液轉移至LB平板上)。5)接合子篩選刮取步驟4)中生長的對照組和配對組菌苔，於2ml無菌生理鹽水中重懸培養物，用無菌生理鹽水在無菌條件下稀釋至10_4，取0. Iml稀釋度為10_3-10_4的對照組塗布含相應抗生素選擇標記的LB固體平板，取0. Iml稀釋度為IOtl-KT1的配對組塗布含相應雙抗生素(受體菌的抗生素抗性和供體菌質粒的抗生素抗性)標記的LB固體平板， 置於30°C恆溫培養箱中，過夜培養。6)質粒小量製備和多樣性驗證挑取步驟幻中接合子單菌落，接入5ml含相應抗生素的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養。採用SDS-鹼解法提取接合子的質粒，瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜上除顯示供體菌的較小質粒(Tra-Mob+)分子量，還顯示一較大分子質量的質粒，即為該接合子含有從樣品內轉入的廣宿主質粒。獲得質粒DNA後，選取常用限制性內切酶對所分離的質粒進行酶切分析，一般認為經兩種以上內切酶切割後，不同的電泳指紋圖譜代表不同的質粒。7)質粒石油烴代謝功能驗證將上述所得接合子接種於以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基中或點種在以多環芳烴組分為唯一碳源的固體雙層平板上培養，具有石油烴降解能力的接合子(所攜帶的質粒上有降解基因)會表現出生長，在固體平板上菌落周圍會出現降解暗圈(肉眼可辨，但在紫外燈下更加清晰)；即該接合子含有能夠降解石油烴的廣宿主質粒。本發明中，可使用的供體菌為E. coli JM109(pBBRlMCS)(質粒編碼氯黴素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farris, R.Martin Roop II and Kenneth M.Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166(1995) 175-176.，E.coli JMlO9 (pBBRlMCS-5)(質粒編碼慶大黴素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farris, R. Martin Roop II and Kenneth M. Peterson. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene, 166 (1995) 175-176.或 Ε. coli DH5 (pSU4814)(質粒編碼氯黴素抗性)[Belen Mftez and Fernando de la Cruz. Two atypical mobilization proteins are involved in plasmid CloDF13 relaxation. Molecular Microbiology (2001) 39 (4)，1088-1099;受體菌為 Ε· coli K12rif (利福平抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990, 2471-2479.、E. coli K12nal (萘啶酸抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990,2471-2479·、、P. putida UW3 (利福平抗性)[Winnie Dejonghe，Johan Goris, Said el Fantroussi, Monica Hof te, Paul de Vos, Willy Verstraete, and Eva M. Top. Effect of Dissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2,4~D)Degradation Plasmids on 2,4_D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons. Applied and Enironmental Microbiology,2000,3297-3304
或C.necator JMP228 (利福平抗性)Eva Μ. Top, William E.Holben，and Larry J. Forney.Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation. Applied and Enironmental Microbiology, 1995，1691-1698。上述供體菌或受體菌可參見文獻中記載其所帶質粒。本發明中，用於質粒多樣性分析的常用限制性內切酶，通常選取如EcoR I，BamH I, pst I 等。本發明中，LB液體培養基配方為胰蛋白腖10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉 20g，用蒸餾水定容至1000ml，pH 7. 2-7. 4。LB固體培養基配方為LB液體培養基，加入2% 重量的瓊脂粉。本發明中，以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基配製方法取5g/L石油烴組分母液(丙酮或水配製)，0. 22 μ m濾膜除菌，量取50-200 μ 1母液，加入50ml滅菌的液體無機鹽培養基，使底物的終濃度為50-200mg廠1。本發明中，多環芳烴固體雙層平板製備方法在無菌的平皿中先傾入20ml下層培養基，既固體無機鹽培養基；待下層培養基凝固後，再加入IOml上層培養基，既以多環芳烴為唯一碳源的固體無機鹽培養基。本發明中，液體無機鹽培養基配方為=K2HPO4 2g、KH2PO4 0. 5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgS04 0. 2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液1ml，用蒸餾水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方為FeS02 · 7H20 2g、MnSO2 · H2O 2g、Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g、ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 · 6H20 0. 2g，用蒸餾水定容至 1000ml。固體無機鹽培養基配方為液體無機鹽培養基，加入2%重量的瓊脂粉。實施例1採集瀋撫灌區石油汙水灌溉50餘年的稻田表層(0-20cm) 土壤，過Imm篩，4°C冰箱保存。稱取土壤樣品5g (乾重)加入盛有25ml生理鹽水(0. 85% NaCl溶液)的100ml 三角瓶中，在搖床上震蕩1小時；懸浮液靜置約30min，將上清液倒到30ml無菌離心管中， 10，OOOrpm 4°C離心IOmin ；沉澱置於:3ml 1/10LB液體培養基中重懸，充分渦旋。選取合適的供體菌和受體菌組合，保證二者帶有不同的遺傳選擇標記，並最好來源於不同的I^rotecAacteria亞綱。將甘油管凍存的供體菌、受體菌株從-70°C冰箱中取出， 在含有相應選擇標記的LB固體平板上劃線，置於30°C過夜培養。用滅菌接種針將上述培養好的供體菌、受體菌菌落接種於5ml不含抗生素的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養。用1/10LB培養液將上述中生長充分的供體菌和受體菌過夜培養液稀釋至10_2倍； 對照組分別為移取500 μ 1稀釋後的供體、受體和土壤細胞懸液均裝在1. 5ml管中；配對組需將上述三方各500 μ 1移至同一管中。10，OOOrpm離心2-3min。50 μ 1 1/10LB液體培養基重懸上述沉澱，滴至LB固體平板上，30°C過夜培養。(土壤和配對懸浮液會含有土壤顆粒，50 μ 1可能很難重懸，儘可能的將所有的懸浮液轉移至LB平板上)。可供選擇的供體菌為Ε. coli JM109 (pBBRlMCS)(質粒編碼氯黴素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farri s, R.Mart in Roop II and Kenneth M. Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166(1995)175-176.，E.coli JMlO9 (pBBRlMCS-5)(質粒編碼慶大黴素抗性)Michael Ε. Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill, Gregory T. Robertson, Michael A.Farris, R. Martin Roop II andKenneth Μ.Peterson.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166 (1995) 175-176.或 Ε. coli DH5 (pSU4814)(質粒編碼氯黴素抗性)[Belen Mftez and Fernando de la Cruz. Two atypical mobilization proteins are involved in plasmid CloDF13 relaxation. Molecular Microbiology (2001) 39 (4)，1088-1099;受體菌為 Ε· coli K12rif (利福平抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990, 2471-2479.、E. coli K12nal (萘啶酸抗性)Eva Top, Max Mergeay, Dirk Springael and Willy Verstraete. Gene Escape Model Transfer of Heavy Metal Resistance Genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on Agar Plates and in Soil Samples. Applied and Enironmental Microbiology, 1990,2471-2479.、P.putida UW3(利福平抗性)[Winnie Dejonghe, Johan Goris, Said el Fantroussi, Monica Hof te, Paul de Vos, Willy Verstraete, and Eva M. Top. Effect of Dissemination of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2,4~D)Degradation Plasmids on 2,4-D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons. Applied and Enironmental Microbiology,2000,3297-3304
或C.necator JMP228 (利福平抗性)Eva Μ. Top, William E.Holben，and Larry J. Forney. Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation. Applied and Enironmental Microbiology,1995，1691-1698。LB液體培養基配方為胰蛋白腖10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1000ml，pH 7. 2-7. 4。LB固體培養基配方為LB液體培養基，加入2%重量的瓊脂粉。實施例2刮取實施例1中在LB平板上生長的對照組和配對組菌苔，於2ml無菌生理鹽水中重懸培養物，用無菌生理鹽水在無菌條件下稀釋至10_4，取0. Iml稀釋度為10_3-10_4的對照組塗布含相應抗生素選擇標記的LB固體平板，取0. Iml稀釋度為IOtl-KT1的配對組塗布含相應雙抗生素(受體菌的抗生素抗性和供體菌質粒的抗生素抗性)標記的LB固體平板，置於30°C恆溫培養箱中，過夜培養。挑取接合子單菌落，接入5ml含相應抗生素的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養。採用SDS-鹼解法提取各接合子的質粒，瓊脂糖凝膠電泳電泳圖譜上除顯示供體菌的較小質粒(Tra-Mob+)分子量，還顯示一較大分質量的質粒，即為該接合子含有從樣品內轉入的廣宿主質粒。獲得質粒DNA後，選取常用限制性內切酶，如EcoR I, BamH I，pst I 等，對所分離的質粒進行酶切分析，一般認為經兩種以上內切酶切割後，不同的電泳指紋圖譜代表不同的質粒。實施例3選取實施例2中含不同質粒的接合子菌株，接種於LB液體培養基，培養至OD6tltl = 0. 6-0. 8，按質量百分比10%接種量接入以某石油烴組分(正辛烷、苯、甲苯)及其主要代謝中間產物(水楊酸、鄰苯二酚)為底物為唯一碳源的液體無機鹽培養基中，置於30°C恆溫搖床上ISOrpm培養5_10天(培養時間根據不同石油烴組分而定)。觀測含接合子的菌株是否能以這些石油烴組分生長(測定菌體密度0D600值)。以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基配製方法取5g/L石油烴組分母液(丙酮或水配製)，0. 22 μ m濾膜除菌，量取 50-200 μ 1母液，加入50ml滅菌的液體無機鹽培養基，使底物的終濃度為50_200mg L—1。對於多環芳烴(萘、芴、菲)降解能力的驗證，將實施例2中含不同質粒的接合子菌株，用滅菌牙籤點種於以某多環芳烴組分唯一碳源的固體雙層平板上，培養一段時間，具有降解能力的接合子(所攜帶的質粒上有降解基因)會在固體平板上菌落周圍會出現降解暗圈(肉眼可辨，但在紫外燈下更加清晰)。多環芳烴固體雙層平板製備方法在無菌的平皿中先傾入20ml下層培養基，既固體無機鹽培養基；待下層培養基凝固後，再加入IOml上層培養基，既以多環芳烴為唯一碳源的固體無機鹽培養基。液體無機鹽培養基配方為=K2HPO42g、KH2PO4 0.5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgSO4 0.2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液lml，用蒸餾水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方為 FeSO2 · 7H20 2g、MnSO2 · H2O 2g、Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g, ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 · 6H20 0. 2g，用蒸餾水定容至 1000ml。固體無機鹽培養基配方為液體無機鹽培養基，加入2%重量的瓊脂粉。應用例1採集瀋撫灌區石油汙水灌溉50餘年的稻田表層(0-20cm) 土壤作為供試土壤，採用本發明提供的「三親配對接合法」，選取的供體菌/受體菌組合為E. coli DH5(pSU4814) (質粒編碼氯黴素抗性)/P. putida UW3(利福平抗性)。通過與土壤懸液進行三親配對，採用含氯黴素和利福平LB選擇平板篩選接合子，獲得了 2個含廣宿主大質粒的接合子，將這兩個質粒分別命名為PSF1-3和pSF2-l。質粒的電泳圖譜如附圖3所示。採用限制性內切酶pst I對質粒進行消化，酶切圖譜如附圖4所示，表明這兩個質粒為兩個不同的質粒。採用液體搖瓶法檢測質粒pSFl-3和pSF2-l對正辛烷、苯、甲苯、水楊酸和鄰苯二酚的降解能力，結果表明，質粒PSF1-3能夠利用正辛烷、苯、甲苯、水楊酸和鄰苯二酚作為唯一碳源生長；在芴雙層平板上出現了降解暗圈(參見圖5)，但不能降解萘和菲。質粒 PSF2-1隻能利用苯、水楊酸和鄰苯二酚作為唯一碳源生長；但在菲雙層平板上可見降解暗圈(參見圖6)。應用例2採集瀋撫灌區石油汙水灌溉50餘年的稻田表層(0-20cm) 土壤作為供試土壤，採用本發明提供的「三親配對接合法」，選取的供體菌/受體菌組合為E. coli JM109(pBBRlMCS4)(質粒編碼慶大黴素抗性VC.necator JMP228 (利福平抗性)。通過與土壤懸液進行三親配對，採用含慶大黴素和利福平的LB選擇平板篩選接合子，獲得了 3個含廣宿主大質粒的接合子，將這3個質粒分別命名為pSF5-22、pSF5-24和pSF6_21。質粒的電泳圖譜如圖7所示。採用限制性內切酶EcoR I對該質粒進行消化，酶切圖譜如圖8所示，表明這3個質粒為不同的質粒。採用液體搖瓶法檢測質粒pSF5-22、pSF5-24和pSF6_21對石油烴組分的降解能力，結果表明，質粒PSF5-22和pSF5-24能夠在萘雙層平板上出現降解暗圈，但不十分清晰 (參見圖9)；質粒PSF6-21能夠在含菲的雙層平板上出現比較明顯的降解暗圈(參見圖10)。
權利要求
1.一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於選用不同的ftOtecAacteria亞綱的染色體帶有選擇標記的受體菌與攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+)並帶選擇標記質粒的供體菌，通過與樣品三親配對接合，供體菌的質粒在樣品中的可自轉(Tra+Mob+)廣宿主質粒的協助下進入受體菌，接合子通過受體菌和供體菌帶有的篩選標記進行篩選，再將篩選的含有可自轉廣宿主質粒的接合子在以石油烴為唯一碳源的培養基中培養，篩選能夠降解石油烴的廣宿主質粒。
2.按權利要求1所述的利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於所述篩選方法具體為1)製備微生物細胞懸液取待測樣品加入生理鹽水中在搖床上震蕩，而後將懸浮液靜置，取上清液進行離心；沉澱置於LB液體培養基中重懸，充分渦流，待用；2)供體菌和受體菌的活化和液體培養分別將凍存的攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+) 並帶選擇標記質粒的供體菌和染色體帶有選擇標記的受體菌在含有相應選擇標記的LB固體培養基30°C下過夜培養；而後上述供體菌、受體菌單菌落分別接種於不含有選擇標記的 LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養，待用；3)三親配對用稀釋10倍的LB培養液將步驟2、中生長充分的供體菌和受體菌培養液分別稀釋至10_2倍；分別取上述稀釋後供體菌和受體菌與微生物細胞懸液混合，而後離心並用1/10LB液體培養基重懸上述沉澱，重懸後培養液滴至LB固體培養基中30°C下過夜培養，待用；4)接合子篩選刮取步驟幻中生長的菌苔，於無菌生理鹽水中重懸培養物，用無菌生理鹽水在無菌條件下稀釋至10_4，取0. Iml稀釋度為IOtl-KT1的上述重懸培養物塗布含受體菌的選擇標記和供體菌質粒的選擇標記的雙選擇標記的LB固體培養基中，置於30°C恆溫培養箱中，過夜培養；5)質粒小量製備和多樣性驗證挑取步驟4)中接合子單菌落，接入上述含雙選擇標記的LB液體培養基中，30°C搖床過夜培養；而後採用SDS-鹼解法提取接合子的質粒，並通過瓊脂糖凝膠電泳，篩選廣宿主質粒；6)質粒石油烴代謝功能驗證將上述所得接合子接種於以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基中培養，具有石油烴降解能力的接合子在液體培養基中會表現出生長，待培養液中培養基變渾濁，0D600明顯變化，即為該接合子含有以石油烴為唯一碳源的廣宿主石油烴代謝質粒；或將上述所得接合子點種在以多環芳烴組分為唯一碳源的固體雙層平板上30°C培養， 具有石油烴降解能力的接合子在液體培養基中會表現出生長，並將固體平板在紫外光下， 菌落周圍培養基在紫外光下的吸收減弱，菌落周圍出現降解暗圈，即該接合子含有以多環芳烴為唯一碳源的廣宿主石油烴代謝質粒。
3.按權利要求2所述的利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於所述LB液體培養基配方為胰蛋白腖 10g，酵母浸粉5g, NaCl 10g，用蒸餾水定容至1000ml, pH 7. 2-7. 4 ；LB固體培養基配方為 在LB液體培養基中加入2%重量的瓊脂粉。
4.按權利要求2所述的利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於所述供體菌為Ε. coli JM109 (pBBRlMCS)(質粒編碼氯黴素抗性)，E. coli JM109 (pBBRlMCS-5)(質粒編碼慶大黴素抗性)或E. coli DH5(pSU4814)(質粒編碼氯黴素抗性)；受體菌為E. coli K12rif (利福平抗性)、E. coli mnal (萘啶酸抗性)、P. putida UW3(利福平抗性)或C. necator JMP228 (利福平抗性)。
5.按權利要求2所述的利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基取5g/L石油烴組分母液，0. 22 μ m濾膜除菌，量取50-200 μ 1母液，加入50ml滅菌的液體無機鹽培養基，使底物的終濃度為50-200mg L—1。
6.按權利要求2所述的利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於所述以多環芳烴組分為唯一碳源的固體雙層平板為無菌的平皿中先傾入20ml下層培養基，待下層培養基凝固後，再加入IOml 上層培養基，即以多環芳烴為唯一碳源的固體無機鹽培養基。
7.按照權利要求6或5所述的利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特徵在於液體無機鹽培養基配方為 K2HPO4 2g、KH2PO4 0. 5g、NaCl 0. 5g、NH4Cl 0. 5g、MgSO4 0. 2g、CaCl2 10mg、微量元素溶液 lml，用蒸餾水定容至1000ml ；其中，微量元素溶液配方為FeS& · 7H20 2g,MnSO2 · H2O 2g、 Na2MoSO4 · 2H20 0. 5g、H3BO4 0. 2g、CuSO2 · 5H20 0. 4g、ZnSO2 0. 5g、NH4VO3 0. 2g、CoCl2 · 6H20 0. 5g、NiCl2 ·6Η20 0. 2g，用蒸餾水定容至1000ml ；固體無機鹽培養基配方為液體無機鹽培養基中加入2%重量的瓊脂粉。
全文摘要
本發明涉及生物學技術和汙染土壤生物修復技術交叉領域，具體的說一種利用三親配對接合併以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法。選用不同的Proteobacteria亞綱的染色體帶有選擇標記的受體菌與攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+)並帶選擇標記質粒的供體菌，通過與樣品三親配對接合，供體菌的質粒在樣品中的可自轉(Tra+Mob+)廣宿主質粒的協助下進入受體菌，接合子通過受體菌和供體菌質粒帶有的選擇標記進行篩選。再將篩選的含有可自轉廣宿主質粒的接合子在以石油烴為唯一碳源的培養基中培養，篩選能夠降解石油烴的廣宿主質粒。採用本發明提供的三親配對接合法」能夠從石油汙染土壤中直接分離降解正辛烷、多環芳烴萘、芴和菲的廣宿主代謝質粒，從而為進一步採用該質粒進行汙染土壤生物修復提供了遺傳材料。
文檔編號C12N15/10GK102517279SQ20111043916
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者史榮久, 張穎, 徐慧, 李慧, 楊偉超, 王亞菲, 陳冠雄, 韓斯琴 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所