禽流感血凝素的新型dna序列、載體和蛋白質的製作方法

2023-05-29 20:10:56

專利名稱：：禽流感血凝素的新型dna序列、載體和蛋白質的製作方法禽流感血凝素的新型DNA序列、載體和蛋白質相關申請的交叉引用本發明主張2006年6月16日遞交的美國臨時申請系列號No.60/814，241的權益，其公開內容，包括所有附圖、表格和胺基酸或核酸序列通過整體引用作為參考。
背景技術：
：在亞洲和歐洲部分地區、近東和非洲爆發的禽流感A(H5N1)對於不期望該疾病在短期內明顯減少的普通人群和科學家而言是一個關注。此外，禽類間的H5N1感染在某些區域很可能變成地方病且由直捲接觸感染的家禽而導致的人類感染將繼續發生。人-人間傳播的H5N1病毒很少見且超過一人以上就不會繼續傳播並且沒有發現人與禽流感A病毒基因之間的基因重配的證據。然而，仍舊認為禽流感引起重大的公共健康威脅。研究表明目前的H5N1病毒流行林在動物中比早前的H5N1病毒變得更加致病。已經發現動物(例如鴨子)更長時間地釋放更多的病毒，但不顯示疾病症狀。這一發現暗示鴨子在將疾病傳播至其它禽類以及也可能傳播至人類中的作用。也已記載了在中國地區豬之間的H5N1感染和貓科動物中的H5N1感染，德國已經報導了石貂中的H5N1感染。人類群體對H5N1感染幾乎沒有預先存在的天然免疫。因此，如果H5N1病毒獲得在人類中有效且持續傳播的能力，則可以產生流感流行。該流行可能引起高患病率和死亡率。此外發現流感A(H5N1)病毒可以顯示出對抗病毒藥物(例如金剛胺和甲金胺)的抗性。這兩種藥物通常用於治療流感。因此，需要生產對禽流感A(H5N1)病毒有效的候選疫苗。發明概述本發明提供了禽流感A病毒血凝素(HA)蛋白的新型M酸序列(包括共有序列)。設計這些新構建的基因以提供總血清型家族更廣泛的活性鐠從而為具有廣泛異源性疾病保護的疫苗提供基礎。還通過向其編碼的氨基^列中添加策略性的糖基化位點而改進該新型基因。這些基因也可以任選地針對植物表達而進行密碼子優化，經插入到適合的載體並經克隆到植物而用於表達。通過重組宿主細胞或轉基因植物產生的多肽也可以用作配製用於控制易感個體流感的疫苗的抗原來源。此外，轉基因植物材料也可用作配製用於控制易感個體流感的疫苗的抗原來源。附圖簡述圖1-3提供了預測為與MHCI和CTL(細胞毒性T淋巴細胞)(圖1)、MHCII類(圖2)或抗體分子(圖3)相互作用的SEQIDNO:14的多種肽片段。圖4闡明合成的HA基因在植物中的瞬時表達(使用雙元載體pDAB4492-pDAB4498觀察到)。柱表示從接種2天或3天後取自7個收集的樣品製造的粗提物的兩個重複的平均OD。取平均值後，從轉基因樣品OD中減去野生型植物葉的OD。"92，，表示pDAB4492;"""表示pDAB4493;"94"表示pDAB4494;"95"表示pDAB4405;"96"表示pDAB4496;"97"表示pDAB4497;"98"表示pDAB4498;"d2，，表示第2天和"d3"表示第3天。圖5描述了(在NT1植物細胞培養物中)具有AIVHA穩定表達的細胞系中的HA含量。細胞系號碼的前兩個數字表示質粒構建體(pDAB44xx)。圖6闡明矮牽牛髮根培養物中pDAB4498的表達用ELISA篩選15個由pDAB4498轉化的矮牽牛系，以及矮牽牛陰性對照的HA表達。將50照總可溶蛋白質加入包被了山羊-抗HAv5的ELISA板。通過添加USDA雞-抗AIV，然後加入兔-抗雞，繼而山羊-抗兔IgGHRP檢測HA。圖7示出應答PR-8HA的抗體並且通過用5照的PR-8HA/孔包被微量滴定板由標準ELISA技術檢測。圖8示出來自DNA轉染動物細胞的HAELISA效價。結果表明祖先基因96(pDAB4496)、97(pDAB4497)和98(pDAB4498)表達與天然TurkeyWisconsin68HA基因93(pDAB4493)、94(pDAB4494)和95(pDAB4495)或天然基因衍生物類似或較多的HA。將收集的轉染細胞加入到包^皮有山羊-抗HAv5的ELISA板。通過添加USDA雞-抗AIV，然後加入兔-抗雞，繼而山羊-抗兔IgGHRP檢測HA。圖9-15圖解了多種植物耙向構建體的基因設計。圖9A(HAvl)、9B(pDAB4492)和10(pDAB4493)圖解了涉及SEQIDNo:1(HA5tw68v3)的多種構建體。圖11A(HAv2)和11B(pDAB4494)描述SEQIDNO:3(HA5tw68v4)的構建體。圖12A(HAv3)和12B(pDAB4495)描述SEQIDNO:5(HA5tw68v5)的構建體。圖13A(HAv4)和13B(pDAB4496)描述SEQIDNO:7(HA5AHvl)的構建體。圖14A(HAv5)和14B(pDAB4497)描述SEQIDNO:9(HA5AHv2)的構建體。圖15A(HAv6)和15B(pDAB4498)描述SEQIDNO:11(HA5AHv3)的構建體。序列簡述SEQIDNO:1提供編碼血凝素VI(HA原始turkeyWisconsin68,無切割位點)的多核苷酸序列。SEQIDNO:2對應於SEQIDNO:1編碼的多肽。SEQIDNO:3示出血凝素V2(在M酸239處含有糖基化位點)。SEQIDNO:4是由SEQIDNO:3編碼的^J^酸序列。SEQIDNO:5提供編碼血凝素V3的多核苷酸序列(包括天然turkeyWisconsin68血凝素蛋白的RQKR切割位點)。SEQIDNO:6對應於SEQIDNO:5編碼的多肽。SEQIDNO:7示出血凝素V4(在第99、102和170位置提供胺基酸修飾)。SEQIDNO:8是由SEQIDNO:7編碼的^J^酸序列。SEQIDNO:9提供編碼血凝素V5的多核苷酸序列(在第99、102和239位置提供胺基酸修飾)。SEQIDNO:10對應於由SEQIDNO:9編碼的多肽。SEQIDNO:11示出編碼血凝素V6(在99、102、170和239位置含有胺基酸修飾)的DNA。SEQIDNO:12是由SEQIDNO:11編碼的^J^酸序列。SEQIDNO:13是編碼本發明的"祖先"HA多肽的植物優化核酸序列。術語"祖先HA多肽，，指使用生物信息學推斷的血凝素多肽。SEQIDNO:14是本發明提供的"祖先"序列。術語"祖先HA多肽"指使用生物信息學推斷的血凝素多肽。SEQIDNO:15是擴增HA基因的引物。SEQIDNO:16是擴增HA基因的引物。附表簡述表la-lb詳細說明SEQIDNO:2、4、8、10和14的片段的N端和C端M酸位置。該片段可以是5至563(包括兩者)之間的任何數目(整數)的連續胺基酸，N端氬基酸可以是1至560(包括兩者)之間的任何整數(參見表la)而C端胺基酸可以是選自由表lb鑑定的任何整數的任何位置(即5至564)。表2a-2b詳細說明SEQIDNO:6的片段的N端和C端M酸位置。該片段可以是5至567(包括兩者)之間的任何數目(整數)的連續M酸，N端胺基酸可以是1至564(包括兩者)之間的任何整數(參見表2a)而C端胺基酸可以是選自由表2b鑑定的任何整數的任何位置(即5至568)。表3a-3b詳細說明SEQIDNO:12的片段的N端和C端M酸位置。該片段可以是5至552(包括兩者)之間的任何數目(整數)的連續M10酸，N端胺基酸可以是1至549(包括兩者)之間的任何整數(參見表3a)而C端氛基酸可以是選自由表3b鑑定的任何整數的任何位置(即5至553)。表4、AIVHA在NT1植物細胞培養物中的穩定表達。細胞系號碼的前兩個數字表示質粒構建體(pDAB44xx)。發明詳述本發明提供下述非限制性的物質組合物以及使用該物質組合物生產免疫原性多肽的方法以及誘導個體免疫應答的方法。因此，本發明提供多種物質組合物，包括a)包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的分離的、純化的和/或重組的多肽；b)與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽具有至少約20%-99.99%同一性，優選至少60-99.99%同一性，且具有至少一種與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽相關的生物學活性的變體多肽；c)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽(或變體多肽)的片段，SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的從"從Y到Z，，的片段，其中Y是所述序列的N端胺基酸而Z是所述序列的C端胺基酸，該片段長度為至少5個胺基酸，且Y和Z是對表1-3中特定SEQIDNO:所鑑定的那些整數中任何指定的整數(或選自那些整數)，或是多肽片段或如圖1、2或3所示，其中所述多肽片段或所述變體多肽的片段具有至少一種與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多^bf目應生物學活性基本上相同的生物學活性(本發明上下文中的其它示例性片段包括跨越SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14每個的胺基酸1-16的前導序列，包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14中每個的位置17至342(對應於血凝素多肽的HI區)或由它組成的一段氮基酸，以及包括下述或由下述組成的血凝素多肽的H2區對應於SEQIDNO:2、4、8、10或14的位置343至位置364的一段M酸；對應於SEQIDNO:6的位置343至位置568的一段Mii酸；或對應於SEQIDNO:12的位置343至位置553的一段胺基酸)；d)選自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12和14的多肽(或變體多肽)的表位；e)包括至少一個如本文所列出表位的多表位構建體；或f)根據實施方式a)、b)、c)、d)或e)任一種，還包括異源多肽序列的多肽；g)根據實施方式a)、b)、c)、d)、e)或f)任一種的植物源多肽；h)包括載體和j口a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)4壬一種所列多肽的組合物，其中所述載體是佐劑或可藥用賦形劑；i)編碼包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽的或編碼如(c)列出的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的一或多種多肽片段的多核苷^列；j)編碼具有與包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的一或多種多肽片段20%-99.99%序列同源性或同一性的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽具有至少一種與包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的一或多種多肽片段相關的生物學活性；k)具有與包括SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的多核苷紗列至少約20%至99.99%同一性的多核苷酸序列；1)包括SEQIDNO:l、3、5、7、9、11或13或者SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13至少8個連續核苷酸片段的多核苷酸序列；m)與(i)、(j)、(k)或(1)中列出的多核苷酸互補的多核苷酸；n)在低、中或高嚴謹性下與(i)、(j)、(k)、(O或(m)中列出的多核苷酸序列雜交的多核苷酸；o)包括(O、(j)、(k)、(1)或(m)中列出的多核苷紗列的遺傳構建體；p)包括(i)、(j)、(k)、(1)、(m)或(n)中列出的多核苷酸或遺傳構建體的載體；q)包括如(p)中列出的載體、如(o)中列出的遺傳構建體或如(i)、(j)、(k)、(1)或(m)中任一項列出的多核普酸的宿主細胞；r)包括如(p)中列出的栽體、如(o)中列出的遺傳構建體或如(i)、(j)、(k)、(1)或(m)中任一項列出的多核苷酸的轉基因植物、植物細胞或植物部分；或s)包括根據(i)、(j)、(k)、(1)、(m)或(ii)的多核苷酸及任選地標記或標籤的探針。本發明上下文中，術語"寡肽"、"多肽"、"肽"和"蛋白質"可以互換^f吏用；然而，應理解本發明並不涉及天然形式的多肽，也就是說它們並非處於其天然環境中而是從天然來源通過純化所分離或獲得的或從通過遺傳操作所製備的宿主細胞中獲得的多肽(例如由宿主細胞重組產生的或由化學合成產生的多肽或其片段)。如下面將描述，根據本發明的多肽也可含有非天然胺基酸。本說明書中也使用術語"寡肽，，、"多肽，，、"肽"和"蛋白質"來指通常通i^目鄰胺基酸的a-氨基和羰基之間的肽鍵一個接一個連接的一系列通常是L-胺基酸的殘基。如下所提及，可以通過肽鍵或通過化學鍵(例如異雙功能化學接頭元件)將接頭元件與本發明的多肽接合。此外，術語"胺基酸，，和"殘基，，可以互換使用。根據本發明，"核苷酸序列"、"多核苷酸"或"核酸"可以互換使用並且應理解為指雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNA的轉錄產物(例如RNA分子)。也應理解本發明並不涉及處於其天然環境中或天然狀態的基因組多核香酸序列。本發明的核酸、多核苷酸或核苷酸序列可以通過分離方法(包括但不限於離子交換色譜、分子大小排阻色譜)或通過遺傳工程方法(例如擴增、扣除雜交、克隆、亞克隆或化學合成或這些遺傳工程方法的組合)而分離、純化(或部分純化)。本文中術語"多核苷酸疫苗"和"DNA疫苗"也可以互換使用。是根據其標準含義定義術語"包括"、"由......組成，，和"基本上由組成"。本說明書中術語可相互替代以結合與每個術語相關聯的特定含義。短語"分離的"或"生物學純的"指基本上或實質上不含有一般與所發現天然狀態物質相伴隨的組分的物質。因此，根據本發明，分離的肽優選不含有一般與處於原位環境下的肽相關聯的物質。"連接"或"接合"指任何本領域已知的用於功能性連接肽的方法，包括但不限於重組融合、共價鍵鍵合、二硫鍵鍵合、離子鍵鍵合、氬鍵鍵合和靜電鍵鍵合。因此，本發明提供包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14和/或SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽片段(例如圖1、2或3所示的那些)的血凝素多肽。本發明的一些實施方式中，由抗體或T-細胞受體所結合的本發明多肽片段指定為"表位，，；本發明上下文中，認為"表位"是本發明的子集，指定為"SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的片段，，。根據本發明，多肽片段(和/或表位)包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的至少5個連續胺基酸的連續跨度片段(span)。本發明多肽片段的長度可以是從至少5個連續胺基酸到比SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的全長多肽少1個胺基酸的任何整數。因此，對於SEQIDNO:2、4、8、10或14，多肽片段是從5至563個(包括兩者)連續M酸的任何數目(整數)。對於SEQIDNO:6，多肽片段是從5至567個(包括兩者)連續胺基酸的任何數目(整數)。對於SEQIDNO:12,多肽片段是從5至552個(包括兩者)連續胺基酸的任何數目(整數)。本發明上下文中的其它示例性片段包括跨越SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14每個的胺基酸1-16的前導序列，包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14每個中的位置17至342(對應於血凝素多肽的HI區)或由其組成的一段胺基酸，以及包括下述或由下述組成的血凝素多肽的H2區對應於SEQIDNO:2、4、8、10或14的位置343至位置364的一段胺基酸；對應於SEQIDNO:6的位置343至位置568的一段胺基酸；或對應於SEQIDNO:12的位置343至位置553的一段胺基酸。本發明的每個多肽片段也可以按其N端和C端位置而描述。例如，本發明包括SEQIDNO:2的6個連續胺基酸至比全長多肽少1個胺基酸的N端到C端片段的組合。因此，6個連續胺基酸片段可佔據選自1-6、2-7、3-8、4-9、5-10等的位置。此外，本文所述多肽片段的實施方式可能是"至少，，、"等於"、"等於或小於"、"小於"、"至少......但不大於......，，或"從Y到Z，，，其中Y是所述序列的N端胺基酸而Z是所述序列的C端胺基酸，片段長度至少為5個胺基酸，且Y和Z是表l-3所鑑定的那些整數中給定的任何整數(或選自它們)。正如從表1明顯看出，SEQIDNO:2、4、8、10或14的片段的N端胺基酸(表la所給定)可以是1和560之間的任何整數而C端胺基酸(表lb給指定)是5至564的任何整數(視片段長度將是5和563(包括兩者)之間的連續胺基酸的任何數(整數)而定)。對於SEQIDNO:6的片段，N端胺基酸(如表2a所給定)可以是1和564之間的任何整數而C端胺基酸(如表2b所給定)是5至568的任何整數(視片段長度將是5和567(包括兩者)之間的連續胺基酸的任何數(整數)而定)。對於SEQIDNO:12的片段，N端胺基酸可以是1和549之間的任何整數(如表3a所給定)而C端胺基酸(如表3b所給定)是5至553的任何整數(視片段長度將是5和552(包括兩者)個胺基酸之間的連續胺基酸的任何數(整數)而定)。應注意除非具體提出，否則包括所有用於描述本發明任何實施方式的範圍並且給定多肽的片段長度可以是任何整數，只要多肽片段的長度比SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14所鑑定的多肽至少短1個胺基酸。本發明也提供跨越SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的特定殘基的多種肽片段(包括至少5個連續胺基酸的持續跨度或連續跨度)，對於SEQIDNO:2，優選的片段包括含有或跨越SEQIDNO:2的胺基酸99的至少5個連續氛基酸的那些。對於SEQIDNO:4，優選片段包括含有SEQIDNO:4的M酸239的至少5個連續胺基酸的跨度片段。跨越SEQIDNO:6至少5個連續氬基酸的優選片段包括含有或跨越下述的那些氛基酸326;胺基酸327;胺基酸328;胺基酸329;氛基酸326和327;胺基酸327和328;^J^酸328和329;#^酸326、327和328;^J^酸327、328和329;或^J^酸326、327、328和329。對於SEQIDNO:8，優選的片段(跨越SEQIDNO:8至少5個連續胺基酸)是含有或跨越下述的那些氬基酸99;胺基酸102;胺基酸170;胺基酸99和102;胺基酸102和170;或胺基酸99、102和170。SEQIDNO:10的優選片段是那些包括或含有下述M酸的至少5個連續胺基酸的跨度片段胺基酸99;胺基酸102;胺基酸239;胺基酸99和102;胺基酸102和239;或胺基酸99、102和239。對於SEQIDNO:12，優選片段是那些包括至少5個連續胺基酸的跨度片段，其包括胺基酸99;胺基酸102;胺基酸170;胺基酸239;胺基酸99和102;>^酸102和170;胺基酸170和239;胺基酸99、102和170;^J^酸102、170和239;或^J^酸99、102、170、和239。如本文所述，可以通過用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或膠原酶)或用化學試劑(例如溴化氰(CNBr))切割本發明的多肽獲得片段。或者，可以在強酸環境(例如pH2.5)下產生多肽片段。該多肽片該轉化的宿主細胞含有核酸，其在用於調控和/或表達多肽片段的適合元件的調控下允許這些片開的相同多肽序列("同多聚體")或源自不同序列("異多聚體")。同多聚體可含有具有相同或不同M酸序列的多肽；但是這些序列源自相同來源的多肽(即SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14)。異多聚體指除了本發明多肽以外，還含有一或多個異源多肽(即不同蛋白質的多肽)的多聚體多肽。因此，本發明文中的異多聚體可以指含有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14(或其片段)的任何組合的多聚體多肽。或者，異多聚體多肽可包括與多肽或其它元件融合的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14中任何一種，其形成疏水、親水、離子和/或共價締合。如本文所提出，多聚體多肽可通過疏水、親水、離子和/或共價締合而形成和/或可通過例如脂質體形成而間接連接。因此，一個實施方式中，當本發明的多肽在溶液中相互接觸時形成本發明的多聚體，例如同二聚體或同三聚體。另一個實施方式中，當本發明的多肽與本發明的多肽抗體(包括本發明融合蛋白質中的異源多肽序列的抗體)在溶液中接觸時形成本發明的異多聚體，例如異三聚體或異四聚體。另一個實施方式中，本發明的成^該共價^合的一個非限制性實例^如本發明融合蛋白質所提供的免疫球蛋白重鏈之間二硫鍵的形成，該融合蛋白質包括與Ig重鏈融合的包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或其片段(參見例如，US專利5，478，925，其公開內容於此處通過整體引用作為參考)。能形成共價締合的多聚體的融合蛋白質的另一實例是oseteoprotegerin(參見例如，國際乂>開號WO98/49305，其內^^皮整體引用作為參考)。另一個實施方式中，兩個或多個本發明的多肽通過肽接頭M。實例包括如美國專利No.5,073,627(通過引用作為參考)所述的那些肽接頭。可使用常規重組DNA技術產生包括多個由肽接頭分開的本發明多肽的蛋白質。通過將本發明的多肽與亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列融合可以形成其它多聚體多肽。亮氨酸拉鏈和異亮氨酸拉鏈結構域是這樣的多肽，其促進在其中發現該結構域的蛋白質的多聚。適於產生本發明的可溶多聚體蛋白質的亮氨酸拉鏈結構域的非限制性實例是PCT申請WO94/10308所述的那些，其通過引用作為參考。使用本領域已知技術將包括在溶液中二聚或三聚化，與多肽序列融合的本發明多肽的重組融合蛋白質在適當的宿主細胞中表達，並且從培養物上清中回收生成的可溶多聚體融合蛋白質。也可以使用本領域已知的化學技術產生多聚體多肽。例如，本發明多聚體中期望含有的多肽可以使用接頭分子進行化學交聯，且本領域已知接頭分子長度優化技術(參見，例如美國專利5，478，925，其在此通過整體引用作為參考)。此外，通過在位於用於構建多聚體多肽的多肽序列內的半胱氨酸殘基之間引入二硫鍵可以產生多聚體多肽(參見例如美國專利5，478，925，其在此通過整體引用作為參考)。此外，可通過向多肽的C端或N端加入半胱氨酸或生物素而常規修飾本發明的多肽，以及可應用本領域已知的技術產生含有一或多個這些修飾多肽的多聚體(參見例如美國專利5,478,925，其在此通過整體引用作為參考)。此外，可應用本領域已知的其它技術產生含有期望包括在本發明多聚體中的多肽組分的脂質體(參見，例如美國專利5,478,925，其在此通過整體引用作為參考)。本文提供的多肽，以及其片段可還包括促進該片段與其它分子、M酸或多肽序列相連的接頭元件(L)。也可以使用接頭將多肽或其片段連接到親和純化方法中所使用的固體支持基質上。適於本發明實踐的"接頭"的非限制性實例包括化學接頭(例如由Pierce，Rockford，IL出售的那些)或允許多肽連接組合的肽(參見，例如接頭，例如美國專利6，121，424、5,843,464、5,750,352和5，990，275公開的那些，其通過整體引用作為參考)。18其它實施方式中，接頭元件(L)可以是胺基酸序列(肽接頭)。其它實施方式中，肽接頭具有一或多個下述特徵a)其允許其連接的多肽(相對於彼此)自由轉動；b)其對於蛋白酶的消化(切割)是抗性的或敏感的；和c)其不與和其接合在一起的多AM目互作用。多種實施方式中，根據本發明的多聚體構建體包括肽接頭且該肽接頭長度為5至60個胺基酸。更優選地，肽接頭長度是10至30個胺基酸；甚至更優選地，肽接頭長度是IO至20個M酸。一些實施方式中，肽接頭長度是17個JL&酸。適合用於本發明的肽接頭由選自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala的^J^酸所組成。優選地，肽接頭包括Gly-Ser元件。優選的實施方式中，肽接頭包括(Ser畫Gly-Gly-Gly-Gly)y，其中y是l、2、3、4、5、6、7或8。其它實施方式提供的肽接頭包括((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y-Ser-Pro)。某些優選實施方式中，y的值為3、4或5。其它優選實施方式中，肽接頭包括(Ser國Ser隱Ser-Ser-Gly)y或((Ser-Ser畫Ser-Ser國Gly)y-Ser-Pro)，其中y是l、2、3、4、5、6、7或8。某些優選實施方式中，y的值為3、4或5。需要可切割的接頭元件時，可以單獨使用一或多個可切割的接頭序列(例如因子Xa或腸激酶(Invitrogen，SanDiegoCalif.))或將其與前述接頭組合使用。本發明的多聚構建體也可以包括一系列重複元件，任選地與其它元件M分布。如本領域技術人員所理解，多聚多肽中出現的重複元件的順序並不嚴格且本發明可以提供任何本文提出的重複元件的排列。因此，根據本發明的"多聚構建體，，可以提供多聚多肽，其包括一系列任選地通過接頭元件(化學接頭元件或JL&酸接頭元件)接合的多肽、多肽片段或表位。"變體多肽"(或多肽變體)應理解為指相對於天然多肽，展現出某些修飾的多肽。這些修飾可以包括至少一個胺基酸的缺失、添加或取代、截短、延伸、嵌合融合(融合蛋白質)、突變或展現出翻譯後修飾的多肽。這些同源性變體多肽中，本發明的另一方面是包括與天然或天然發生的多肽全長展現出至少(或至少約)20.00%-99.99%(包括兩者)同一性的胺基酸序列的那些。前述同一性百分數的範圍應認為包括20.00%和99.99%,且提供對20.00%到至多99.99%之間以0.01%為間隔的任何組成的百分數的書面說明和支持。這些百分數是純粹統計學的且兩多肽序列間的差別可以隨機地以及在整個序列長度上分布。因此，變體多肽可以與本發明的多肽序歹'J具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性百分數。優選的實施方式中，變體多肽或修飾多肽展現出與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性百分數。參照所鑑定的特定SEQIDNO:的全長多肽或片段(例如如SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14列出的那些多肽或其片段)長度計算同一性百分數。所有情況下，變體多肽保留與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14所列出的多！^目關的至少一種生物學活性(例如，誘導個體免疫應答的能力或誘導個體保護性免疫應答的能力)。從"變體多肽"和"變體多肽片段"的定義中特別排除那些在公眾可獲得的資料庫中提供的流感血凝素多肽。例如，作為變體多肽，特別排除流感A病毒(A/鴨/香港/698/79(H5N3))，保藏號No.AAD13571(AF082039)。本發明的融合蛋白質包括一或多個異源多肽序列(例如促進本發明多肽純化的標籤(參見例如美國專利No.6，342，362，其通過整體引用作為參考；Altendorf等人，[1999畫WWW,2000]"StructureandFunctionoftheF0ComplexoftheATPSynthasefromJsc/im'由ViCo//,"/f!xpm'附e她/Biology203:19-28，TheCo.ofBiologists,Ltd.,G.B.;Baneyx[1999"RecombinantProteinExpressionin五sc/rm'cA/flo//，"Biotechnology10:411-21，ElsevierScienceLtd.;Eihauer等人，[2001"TheFLAGTMPeptide,aVersatileFusionTagforthePurificationofRecombinantProteins,"/5/oc/^附5/0/;/^sM^A0^fe49:455-65;Jones等人，[1995/C7^o附atogra/7/^707:3-22;Jones等人，[1995]"CurrentTrendsinMolecularRecognitionandBioseparation，"/C/r/Y附fl^0gm/7/ryJ.707:3-22,ElsevierScienceB.V.;Margolin[2000"GreenFluorescentProteinasaReporterforMacromolecularLocalizationinBacterialCells,"M^/^rfs20:62-72，AcademicPress;Puig等人，[2001"TheTandemAffinityPurification(TAP)Method:AGeneralProcedureofProteinComplexPurification,"M""/10ffe24:218-29，AcademicPress;Sassenfdd[1990"EngineeringProteinsforPurification,"TibTech8:88-93;Sheibani[1999"ProkaryoticGeneFusionExpressionSystemsandTheirUseinStructuralandFunctionalStudiesofProteins,"/Ve/;.5/oc/re附.在29(1):77-90，MarcelDekker,Inc.;Skerra等人，〖1999"ApplicationsofaPeptideLigandforStreptavidin:theS^p-tag",必/o附o/ecw/fw￡""g/"e￡77>ig16:79-86，ElsevierScience,B.V.;Smith[1998"CookbookforEukaryoticProteinExpression:Yeast,Insect,andPlantExpressionSystems,"77^Scientist12(22):20;Smyth等人，[2000"EukaryoticExpressionandPurificationofRecombinantExtracellularMatrixProteinsCarryingtheStrepIITag",/wAfo/ecw/ar139:49-57;Unger[1997"ShowMetheMoney:ProkaryoticExpressionVectorsandPurificationSystems,"7T^Sc/ewriW11(17):20，其每個都通過整體引用作為參考)，或者來自廠商的市售可得的標籤，例如STRATAGENE(LaJolla，CA)、NOVAGEN(Madison,WI)、QIAGEN，Inc.,(Valencia,CA)或InVitrogen(SanDiego,CA)。其它實施方式中，本發明的多肽(例如SEQIDNO:2、4、6、8、10、12和/或14或其片段)可以與具有佐劑活性的異源多肽序列(多肽佐劑)融合。該多肽非限制性實例包括熱激蛋白(hsp)(參見例如，美國專利No.6,524,825，其公開內容通過整體引用作為參考)。本發明的範圍內也包括作為"表位"的至少一或多個SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽片段。本發明上下文中，術語"表位"用來指通常通過相鄰胺基酸的a-氨基和羰基之間的肽鍵一個接一個連接的一系列通常是L-胺基酸的殘基。本發明中優選的CTL-(或CD8+T細胞)畫誘導肽長13個殘基或更短且通常由約8至約11個殘基(例如8、9、10或11個殘基)組成，優選9或10個殘基。優選的HTL(或CD4+T細胞)-誘導肽長度少於約50個殘基且通常由約6至約30個殘基，更通常約12至25(例i口12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個殘基)個殘基，和經常約15至20(例如15、16、17、18、19或20)個殘基組成。本發明也提供根據本發明多肽的生物學活性片段(表位)且包括那些能夠引發抗H5血清型流感病毒免疫應答的肽，所述免疫應^R供與所述多肽片M應的成分(B-細胞、抗體和/或細胞免疫應答組分(例如輔助性、細胞毒性和/或抑制性T-細胞))；本文公開的完整的、全長未修飾的多肽；或本文>^開的多肽片段和完整的、全長未修飾多肽兩者。本發明也提供一種組合物，其包括至少一種包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14(或其片段)的分離的、重組的或純化的多肽和至少一種其它組分。本發明的多個方面，其它組分是固體支持物(例如，微量滴定孔、磁珠、非磁性珠、瓊脂糖微珠、玻璃、纖維素、塑料、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、硝酸纖維素、尼龍或聚碸)。其它組分也可以是本領域技術人員已知的可藥用賦形劑或佐劑。本發明的一些方面，固體支持物提供本發明多肽的陣列或包括本發明多種多肽組合的多肽陣列。本發明也提供引發個體中免疫應答的方法，包括向個體給予足以在該個體中誘導免疫應答的量的包括本發明多肽的組合物。一些實施方式中，在個體中i秀導"保護性"或"治療性免疫應答"。"保護性免疫應答"或"治療性免疫應答"指預防、降低或至少部分阻止個體的疾病症狀、副作用或病程的CTL(或CD8+T細胞)和/或HTL(或CD4+T細胞)和/或抗體應答。例如，相比於未免疫對照個體，在誘導了保護性免疫應答的個體中可以展現出降4氐的死亡率和/或展現出降低的病毒^^放。保護性免疫應答也可包括由輔助性T細胞(或CD4+T細胞)激發所促進的抗體應答。美國專利No.6,419,931教導了其它在個體中誘導免疫應答的方法，其通過整體引用作為參考。貫穿本申請，術語CTL可以與CD8+T細胞互換使用而術語HTL可以與CD4+T細胞互換4吏用。本申請上下文中，個體指鳥類和/或哺乳動物，例如但不限於猿、黑猩猩、猩猩、人類、猴子以及家畜(寵物)例如狗、貓、豚鼠、倉鼠、兔子、白鼬、牛、馬、山羊和綿羊。在此定義禽或鳥類為鳥綱中通常前肢特化為翅膀，具有鱗狀下肢、喙，使用卵生方式繁殖後代的溫血脊推動物。為了本說明書的目的，優選的鳥類組是家雞、火雞、鴕鳥、鴨子、鵝、天鵝和康沃爾郡遊樂雞(cornishgamehens)。更優選的組是家雞和火雞。將給予或給藥定義為向個體的身體引入物質並且包括口服、經鼻、經眼、直腸、陰道和非經腸道途徑。組合物可通過任何給藥途徑，包括但不限於皮下(SQ)、肌肉內(IM)、靜脈內(IV)、艦內(IP)、皮內(ID)、經鼻、經眼或口腔黏膜(IN)或口服單獨給予或與其它試劑組合給予。給予個體的組合物可以任選地含有佐劑並且可以本領域已知的向受試者遞送免疫原的任何方式被遞送。組合物也可在任何載體中配製，包括例3口可藥用栽體,督J:i口E.W.Martin's及e附/"g似w's戶/ifirr附acewricfl/5Wewce，MackPublishingCompany,Eastern,PA所述。優選的實施方式中，組合物可在不完全福氏佐劑、完全福氏佐劑或明礬中配製。其它實施方式中，本發明提供診斷檢測法，其基於本領域技術人員已知的Western印跡形式或標準免疫檢測法並且其利用包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14，實質上由其組成或由其《且成的多肽。例如，可偵_用基於抗體的檢測法如酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)、放射免疫檢測法(RIA)、橫流檢測法(lateralflowassays)、逆流層析結合檢領'J法(reversibleflowchromatographicbindingassay)(參見例:i口美國專利No.5,726,010，其通過整體引用作為參考)、免疫層析條檢測法(immunochromatographicstripassays)、自動流量檢測法(automatedflowassays)和利用含多肽生物傳感器的檢測法來檢測與本發明提供的多肽(或其片段)結合的抗體。進行檢測的檢測法和方法是本領域已知的並且該方法可定性(抗體存在與否)或定量(比較樣品與使用本發明的多肽製備的標準曲線)檢驗生物樣品(例如血清、血漿或血液)中結合本發明多肽的抗體的存在。可以認為基於抗體的檢測法有四類直接結合檢測法、夾心檢測法、竟爭檢測法和置換檢測法。直接結合檢測中，標記抗體或抗原，並且存在測量所形成的複合物數量的手段。夾心檢測中，測量至少三種組分(例如抗體-抗原-抗體)的複合物的形成。竟爭檢測中，標記抗原和未標記抗原竟爭結合抗體且測量結合的或游離的組分。置換檢測中，標記抗原預結合抗體，而當未標記抗原置換受體上結合的標記抗原時測量信號的改變。可以才艮據美國專利No.5,712,170和其引述的文獻的教導進行橫流檢測法。美國專利No.5，712，170和其引述的文獻通過整體引用作為參考。用於實現置換檢測的置換檢測法和流量免疫傳感器描述於(1)Kusterbeck等人，"Antibody-BasedBiosensorforContinuousMonitoring",出自BiosensorTechnology,R.P.Buck等人編，MarcelDekker，N.Y.第345-350頁(1990);Kusterbeck等人，"AContinuousFlowImmunoassayforRapidandSensitiveDetectionofSmallMolecules",JournalofImmunologicalMethods,vol.135，第191-197頁(1990);Ligler等人，"DrugDetectionUsingtheFlowImmunosensor",出自BiosensorDesignandApplication,J.Findley等人編，AmericanChemicalSocietyPress,第73-80頁(1992);和Ogert等人，"DetectionofCocaineUsingtheFlowImmunosensor",AnalyticalLetters,vol.25，第1999-2019頁(1992)，它們全部在此通過整體引用作為參考。置換檢測法和流量免疫傳感器也描述於美國專利No.5,183，740,其在此也通過整體引用作為參考。不同於大多數用於檢測小分子的竟爭性免疫檢測法，置換免疫檢測法可以產生抗原濃度增加的正信號。本發明也提供將抗體與本發明多肽(例如SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14，其抗體結合片段)結合的方法，包括將含有抗體的樣品在允許形成抗體-抗原複合物的條件下與多肽接觸。這些方法還可以包括檢測所述抗體-抗原複合物形成的步驟。這一方法的多個方面，進行免疫檢測來檢測H5血清型流感病毒。該免疫檢測方法的非限制性實例包括酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)、放射免疫檢測法(RIA)、橫流檢測法、免疫層析條檢測法、自動流量檢測法、Western印跡、免疫沉澱檢測法、逆流層析結合檢測法、凝集檢測法和生物傳感器法。本發明的其它方面提供多肽陣列在進行前述檢測方法時的用途，該陣列可以含有至少一種SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14(或其片段)列出的多肽且也可以含有其它相同或不同流感血清型的多肽。本發明也涉及與本發明多肽結合的抗體。特別考慮對於本文列出的多肽有免疫特異性的抗體。多種實施方式中，優選不與其它血凝素多肽交叉反應的抗體。尤其優選不與抗源自H5血清型流感病毒的血凝素多肽所產生的抗體交叉反應的抗體。可以使用標準材料和本領域已知的方法製備本發明的抗體(參見例吵口，Afowoc/owfl/iV,Vi"》/es屍m"/ce，1983;Mo/ioc/o冊/外6nV/0111aJwftT^/wT^cte々wes朋rf々/7/Zcflrto叫1982;5^/e"ecfAfC/iotfa/附附"w0/ogy,1980;/附附Mi10/og/c(1/Af"/^ife，Ko/.//，1981;/VaWcflf/Z/fi/MWio/og);,和Kohler等人，[1975A^似"256:495)。這些抗體還可以包括一或多種其它組分，例如固體支持物，載體或可藥用賦形劑，或標記。術語"抗體，，包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現出期望的生物學活性，尤其是中和活性。"抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所4吏用的術語"單克隆抗體"指從基本上同源的抗體群體中獲得的抗體，即包括該群體的單個抗體除了可能以小量存在的天然發生的突變以外是相同的。單克隆抗體針對於單個抗原位點是高度特異性的。此外，相比於通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑，每個單克隆抗體都針對抗原上的單個決定蔟。修飾語"單克隆的，，指由基本上同源的抗體群體獲得的抗體特徵，而不應理解為需要任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明所使用的單克隆抗體可通過Kohler等人，[1975]A^"256:495首先描述的雜交瘤方法而製備，或可通過重組DNA方法(參見例如U.S專利No.4，816，567)而製備。"單克隆抗體"也可使用例如Clackson等人，[1991AW""352:624-628和Marks等人，[1991丄Afo/.J"/.222:581-597描述的4支術從噬菌體抗體文庫分離。本文描述的單克隆抗體特別地包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類或亞類的抗體相應序列以及該抗體的片段相同或同源，而鏈的其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類或亞類的抗體相應序列以及該抗體的片段相同或同源，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No.4，816，567和Morrison等人，[1984]A^汰/4c"rf^/.fAX481:6851-6855)。還包括與如SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14提出的多肽或其片段特異性結合的人源化抗體(參見例如，美國專利No.6,407,213或6,417,337，其教授製作人源化抗體的方法，通過引用整體作為參考)。"單鏈Fv"或"sFv，，抗體片段包括抗體的Vh和Vl結枸域，其中這些結構域存在於單個多肽鏈上。通常，Fv多肽還包括Vh和Vl結枸域之間的多肽接頭，其使sFv形成用於抗原結合的期望結構。對於sFv的綜述參見PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies1994Vol.113:269-315，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork。術語"雙抗體"指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其片段包括與同一多肽鏈(VH-VL)中輕鏈可變區結構域(VL)相連的重鏈可變區結枸域(Vh)。雙抗體更詳細地描述於例如EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等人，[1993/Voc.TV"汰爿cflrf.90:6444-6448。術語"線性抗體，，指Zapata等人，[1995iVote/"8(10):1057-1062描述的抗體。"分離的"抗體是從其天然環境組分中被鑑定和分離和/或回收的抗體。其天然環境的汙染組分是幹擾抗體的診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素、和其它蛋白質的或非蛋白質的溶質。優選的實施方式中，將抗體純化為(1)按重量計大於由Lowry法確定的抗體的95%，和最優選按重量計大於99%，(2)足以獲得至少15個N端或中間胺基酸序列的殘基的禾呈度，這通過4吏用轉杯式序歹'J分才斤儀(spinningcupsequenator),或(3)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或優選^L染通過SDS-PAGE而鑑定為均質。分離的抗體包括重組細胞中的原位抗體，因為抗體天然環境的至少一種組分將不存在。然而通常，將通過至少一種純化步驟製備分離的抗體。如上所述，"核苷酸序列"、"多核苷酸"或"核酸"可以互換使用並且根據本發明應理解為指雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNA的轉錄產物(例如RNA分子)。認為20.00%和99.99%之間的同一性百分數範圍包括20.00%和99.99%,且提供對20.00%到至多99.99%之間以0.01%為間隔的任何組成的百分數的書面說明和支持。這些百分數是純粹統計學的且兩條核酸序列間的差別可以隨才幾地以及在整個序列長度上分布。例如，同源序列可以展示與本發明的序列20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性百分數。通常，參照天然和/或天然發生的多核苷酸的全長計算同一性百分數。兩個或多個核苷酸或多肽序列中使用的術語"相同的"或"同一性"百分數指當使用序列比較算法或通過手工比對和肉目M見察測量時，在比較窗中比較和比對最大一致性時，相同或具有指定百分數的相同核苷酸或胺基酸殘基的兩或多個序列或子序列。可使用本4^域已知的多種序列比較算法和程序中的任何一種來評價蛋白質和核酸序列同源性。該算法和程序包括但不限於TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988，A^/.爿cfld5W.CAS^"J:2444-2448;Altschul等人，1990,丄MoAZ5Gj:403-410;Thompson等人，1994，7Vwc/e/cid22f":4673-4680;Higgins等人，1996，胸A油266:383-402;Altschul等人，19卯，/.Afo/.祝o/.2/5G,:403-410;Altschul等人，1993,A^m"丄266-272)。通常使用廠商提供的預設參數或使用上述參考中提出的那些參數進行序列比較，其通過引用整體作為參考。如本文所使用的"互補"多核苷酸序列通常指起於雙鏈核酸分子(DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA)中特定噤呤和特定嘧咬之間的氫鍵的序列。主要的特異配對是鳥嘌呤和胞嘧啶以及腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶。"互補，，多核苷酸序列也可指"反義，，多核苷酸序列或"反義序列"。也可以通過在高嚴謹性、中度嚴謹性和/或低嚴謹性下的雜交研究確定序列同源性和序列同一性。可以使用多種程度的雜交嚴謹性。M越苛刻，雙鏈體形成所需的互補性越高。條件的苛刻度可以通過溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間等來控制。優選地，在低、中度或高嚴謹性條件下利用本領域7^知的衝支術(例如Keller,G.H"M.M.Manak[1987DiVJiVWes,StocktonPress,NewYork,NY.,第169-170頁所述)來進行雜交。例如，Southern印跡中可以通過標準方法(Maniatis等人，[1982]Mo/ecw/fl/*Cte/rtg:爿JLa6cato/jM""w柳/，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)使用"P-標記的基因特異性探針進行所固定DNA的雜交。通常，可以在允許檢測與示例多核苷酸序列同源的耙序列的中度至高嚴謹性條件下進行雜交和隨後的洗滌。對於雙鏈DNA基因探針，可以在比DNA雜交體解鏈溫度(Tm)低20-25。C，在6XSSPE，5XDenhardt's溶液，0.1%SDS，0.1mg/ml變性DNA中過夜進行雜交。該解鏈溫度由下述等式所述(Beltz等人，[1983Ewgwo/ogy，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave編AcademicPress,NewYork100:266-285)。Tm=81.50C+16.6Log[Na++0.41(%G+C)-0.61(%甲醯胺)隱600/雙28鏈體的^ai^t長度。通常按下述進行洗滌(1)室溫下在1XSSPE，0.1%SDS中洗滌15min，兩次(低嚴謹性洗滌)；(2)Tm-20°C，0.2XSSPE，0.1%SDS中洗滌15min，一次(中度嚴謹性洗滌)。對於寡核苷酸探針，可以在低於雜交體解鏈溫度(Tm)10-20°C,於6XSSPE，5XDenhardt溶液，0.1%SDS，O，lmg/ml變性DNA中過夜進行雜交。可以通過下述等式確定寡核苷酸探針的Tm。Tm(°C)=2(T/A^^JJit數)+4(G/C鹼基對數)(Suggs等人，[1981J/OV-(7CXy45[v考.Dev.t/wVig屍wny^/G^was，D.D.Brown[編，AcademicPress,NewYork,23:683-693)。按下述進行洗滌(1)室溫下在IXSSPE，0.1%SDS中洗滌15min，兩次(低嚴謹性洗滌)2)雜交溫度下，IXSSPE，0.1%SDS中洗滌15min,—次(中度嚴謹性洗滌)。通常，可以改變鹽和/或溫度來改變嚴謹性。對威基長度>70左右的標記DNA片段，可以使用下述條件1或2XSSPE，室溫低度1或2XSSPE，42。C中度0.2X或1XSSPE，65°C高度0.1XSSPE,65°C。作為另一非限制性實例，可以按照下述進行使用高嚴謹性的程序在由6XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA，0,02%PVP，0.02%Ficoll，0.02%BSA和500嗎/ml變性鮭精DNA構成的緩衝液中於65。C進行含DNA的過濾物的預雜交8h至過夜。過濾物在65°C(優選的雜交溫度:在含有100ng/ml變性鮭精DNA和5-20x106cpm34-標記探針的預雜交混合物中雜交48h。或者可以在SSC緩沖液(相當於0.15MNaCl和0.05M檸檬酸鈉的IXSSC)存在下於65。C進行雜交步驟。，在含有2XSSC，0.01%PVP，0.01%Ficoll和0.01。/0BSA的溶液中於37。C進行過濾物洗滌lh，隨後在0.1%SSC中於50。C洗滌45min。或者可以在含有2XSSC和0.1%SDS，或0.5XSSC和0.1%SDS，或0.1XSSC和0.1%SDS的溶液中於68°C進行過濾物洗滌15min的區間。洗滌步驟後，可通itit射自顯影檢測雜交探針。可使用的其它高嚴謹性條件是本領域公知的且如Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版ColdSpringHarborPress,N.Y"第9.47-9.57頁；和A謂bel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience，N，Y.所引述，其通過整體引用作為參考。使用中度嚴謹性條件的程序的另一非限制性實例如下將含有DNA的過濾物在溫度為60。C，在5XSSC緩衝液和標記探針存在下預雜交，然後雜交。隨後，在50。C於含有2XSSC的溶液中進行過濾物洗滌並且可通it^L射自顯影檢測雜交探針。可使用的其它中度嚴謹性條件是本領域公知的並且如Sambrook等人，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress,N.Y"第9.47-9.57頁；和Ausubel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y所引述，其整體引用作為參考。如上所述，雙鏈體形成和穩定性取決於雜交體的兩#^之間的實質互補性以及一定的可以容忍的錯配程度。因此，本發明的探針序列包括所述序列的突變(單個和多個)、缺失、插入及其組合，其中所述突變、插入和缺失允許與目的靶多核苷酸形成穩定雜交體。在給定多核苷酸序列中可以以多種方法產生突變、插入和缺失，並且這些方法是普通4支術人員已知的。其它方法在今後可能成為已知的。本領域也公知可以使用限制性酶獲得本發明DNA序列的功能性片段。例如，必"/31核酸外切酶可以常規用於受時間控制的DNA限制性消化(適常指"刪切威基(erase-a-base)"程序)。參見例如，Maniatis等人，[1982Afo/ec/flrC7o/w'wJ丄aAomto/yMw"/，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork;Wei等人，[1983/祝o/.C7^附.258:13006-13512。本發明還包括本發明多核苷酸序列的片段。應理解，本發明多核苷酸序列的代表性片段指來自其所源自序列中具有至少5個持續核苷酸，優選至少12個持續核苷酸，和更優選至少15、18或至少20個持續核苷酸的任何核苷酸片段。該片段的上限是編碼特定多肽(例如，如SEQIDNO:2的多肽)的全長序列中發現的總核苷酸數。術語"持續"與術語"連續"或短語"連續跨度"可以互換。因此，一些實施方式中，多核苷酸片段可指"至少X個核苷酸的連續跨度片段，其中X是從5開始的任何整數；該片段的上限是比編碼特定多肽(例如，如包括SEQIDNO:2的多肽)的全長序列中發現的總核苷酸數少一個核苷酸的數目。一些實施方式中，本發明包括能夠在多種嚴謹性條件(例如高或中度或低嚴謹性)的條件下與本發明的核苷酸序列雜交的那些片段；任選地，與本發明的核苷酸序列雜交的片段可以按下述進行標記。一個實施方式中，本發明提供用於鑑定在轉化宿主細胞或從懷疑由禽流感感染的個體所分離的細胞中存在本發明核酸的方法。這些變化的實施方式中，本發明提供樣品(獲得自個體或細胞培養物)中核酸的檢測，包括將樣品與本發明的核酸(多核苷酸)(例如RNA、mRNA、DNA、cDNA或其它核酸)接觸。優選的實施方式中，多核苷酸是探針，其任選地被標記且用於檢測系統。許多檢測核酸存在的方法及適宜的檢測方法包含在本發明中。典型的利用核酸雜交的檢測形式包括但不限於l)核連綴分析、2)狹縫印跡檢測法、3)、northern印跡檢測法(Alwine等人，ZVoc.iV"汰^c"t/.74:5350)、4)磁珠分離、5)核酸或DNA晶片、6)反向Northern印跡檢測法、7)斑點印跡檢測法、8)原位雜交、9)RNA酶保護檢測法(Melton等人，iVwc.^"Vfe12:7035JU(口描述於Ambion，Inc.,Austin,Tex.1998年的目錄)、10)連接酶鏈式反應、11)聚合酶鏈式反應(PCR)、12)反轉錄酶(RT)-PCR(Berchtold等人，TV"c.17:453)、13)差示RT-PCR(DDRT-PCR)或其它適合的技術和檢測法的組合。適合用於這些檢測方法的標記包括但不限於l)放射性標記，2)酶標記，3)化學發光標記，4)焚光標記，5)磁性標記或其它適合的標記，包括下述那些。這些方法和標記是本領域公知的且對於熟練技術人員是可廣泛獲得的。類似地，將標記整合入核酸的方法對於熟練技術人員也是公知的。因此，本發明也提供用於與耙序列雜交或用於由乾序列產生的擴增子的檢測探針(例如公開的多核苷^列的片段)。該檢測探針將包括至少8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、卯、95或100個核苷酸的不間斷/連續跨度片段。標記的探針或引物由放射性化合物或由上述提出的另一類型標記(例如l)放射性標記，2)酶標記，3)化學發光標記，4)螢光標記，5)磁性標記)所標記。或者，未標記的核苷酸序列可直接用作探針或引物；然而，該序列通常用放射性元素(32P、35S、3H、1251)或諸如生物素、乙醯氨基芴、地高辛、5-溴脫氧尿苷或螢光素的分子所標記以提供可以用於多種應用的探針。本發明的多核苷酸也可以使用陣列或結合到固體支持物上的多核苷酸用於定性和定量分析基因表達。如本文所使用，術語陣列指全長多核苷酸或允許特異檢測基因表達的足夠長度的多核苷酸的一、二或多維排列。優選地，片段長度至少15個核苷酸。更優選，片段長度至少IOO個核苷酸。更優選，片段長度大於IOO個核苷酸。一些實施方式中，片段長度可大於500個核脊酸。例如，可在如Schena等人(^&"ce270:467-470，1995;/VyciVa汰爿cfl^C/.&A93:10614-10619，1996)所述的互補DNA微陣列中用本發明的全長多核苷酸或其片段進行基因表達的定量分析。由PCR擴增多核苷酸或其片段並且陣列化到矽烷化顯微載片上。在溼度箱中孵育印刷的陣列以允許陣列元素的再水化並在0.2%SDS中漂洗lmin—次，水中漂洗lmin兩次和硼氬化鈉溶液中漂洗5min—次。於95°C將該陣列浸入水中2min，轉移到0.2%SDS中lmin，用水漂洗兩次，空氣乾燥並於25°C暗處儲存。從生物樣品中分離mRNA並通過一輪反轉錄製備探針。在14x14mm玻璃蓋片下探針於60°C雜交至1，2微陣列6-12h。陣列在25°C於低嚴謹性洗塗緩衝液(1xSSC/0.2%SDS)中洗滌5min，然後室溫下於高嚴謹性洗滌緩衝液(0.1xSSC/0.2%SDS)中洗滌10min。使用裝有定製的過濾器裝置的螢光雷射掃描裝置在0.1xSSC中掃描陣列。通過取兩個獨立雜交的平均比率獲得準確的差異表達測量值。也可以在如Pietu等人(GenomeResearch6:492-503，1996)所述的互補性DNA陣列中進行生物樣品中存在的多核苷酸的定量分析。PCR擴增的本發明多核苷酸或其片段並且將其點在膜上。然後，用放射性核香酸標記源自多種組織或細胞的生物樣品中產生的mRNA。在受控條件下雜交並洗滌後，通過磷成像或放射自顯影檢測雜交的mRNA。進行重複實驗且然後進行差異表達的mRNA的定量分析。或者，本發明的多核苷酸序列也可用於分析系統，例如DNA晶片。DNA晶片及其使用是本領域公知的且(參見例如，US專利No.5,561,071;5,753,439;6,214,545;Schena等人，BioEssays，1996，18:427-431;Bianchi等人，Clin.Diagn.Virol"1997，8:199-208;其每個通過整體引用作為參考)和/或由商業廠商提供，例如Affymetrix，Inc.(SantaClara,CA)。此外，本發明的核酸序列可以用於核酸分析程序中的分子量標準。本發明也提供遺傳構建體包括a)編碼包括SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的多肽或其片段的多核苷,列；b)與編碼包括SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14多肽或SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的片段的多核苷酸序列具有至少約20%-99.99%同一性的多核苷酸序列，其中所述多肽具有包括SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14多肽或其片段的至少一種生物學活性；c)編碼與包括SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的多肽或SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的片段具有至少約20%-99.99%同一性的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽具有包括SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的多肽或其片段的至少一種生物學活性；d)編碼包括SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的多肽的片段的多核普斷列，其中所述片段具有SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14多肽的至少一種活性；e)包括SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的多核苦酸序列；f)與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的多核苷酸序列具有約20%-99.99°/。同一性的多核普酸序列；g)編碼SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14的多肽變體(例如變體多肽)的多核苷*列，其中所述變體具有至少一種與SEQIDNo:2、4、6、8、10、12或14多^M目關的生物學活性；h)編碼如(g)所列出變體多肽的片段的多核苷^列，其中所述變體多肽的片段具有至少一種與該多^M目關的生物學活性；i)編碼多聚構建體的多核苷,列；或j)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)列出的多核苷酸互補的多核苷酸。本發明的遺傳構建體也可以含有其它調控元件例如啟動子和增強子和任選地，選擇標籤。含有如本文所提出的遺傳構建體或上文提出的編碼多肽的多核苷酸(有效連接至調控元件)的載體和表達盒也包括在本發明的範圍內。該載體和表達盒也可含有其它轉錄調控序列。該載體和表達盒還可包括選擇標籤。表達盒可^^有至少一種待共轉化至生物的有效連接至調控元件的其它基因。或者，可以在多表達盒中提供其它基因和調控元件。提供的表達盒具有多個限制性位點用於插入本發明序列，以使其受調控區域的轉錄調控。該表達盒可另外含有有效連接至調控元件的選擇標籤基因。表達盒在轉錄的5'-3'方向上將包括轉錄和翻譯起始區，本發明的DNA序列以及轉錄和翻譯終止區。轉錄起始區、啟動子可能是宿主細胞天然的或類似的或者是其外源的或異源的。此外，啟動子可能是天然序列或者是合成序列。"外源"意指轉錄起始區所導入的天然植物中未發現該轉錄起始區。如本文所使用，嵌合基因包括與編碼序列異源的轉錄起始區有效連接的編碼序列。本發明的另一方面提供用於克隆和/或表達本文教導的多核苷酸序列的載體。本發明的載體，包括疫苗載體，也可以包括允許所述核苷酸序列在特定宿主細胞中表達和/或分泌所需的元件。該載體可以含有啟動子、用34於起始和終止翻譯的信號、以及用於調控轉錄的適宜區域。某些實施方式中，載體可以穩定保持在宿主中並且任選地，可以含有引導翻譯的蛋白質分泌的信號序列。4艮據所用的宿主細胞選擇這些不同的元件。載體可以整合到宿主基因組中或者任選地是自主複製載體。本發明也提供由本文公開的多核普^列所編碼的多肽、肽、片段或變體的表達，包括在允許多肽表達的條件下培養由本發明多核苷酸轉化的宿主細胞，和任選地回收該表達的多肽。公開的多核苷酸序列也可以由第二核酸序列調控以便在轉化有重組DNA分子的宿主中表達蛋白質或肽。例如，蛋白質或肽的表達可由任何本領域已知的啟動子/增強子元件調控。可用於調控表達的啟動子包括但不限於CMV-IE啟動子、SV40早期啟動子區(Bernoist和Chambon，1981，Nature2卯:304-310)、勞斯肉瘤病毒的3，長末端重複中含有的啟動子(Yamamoto等人，1980，Cell22:787-797)、單純皰滲病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、金屬硫蛋白基因調控序列(Brinster等人，1982，Nature296:39-42);含有諸如(3-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)或似c啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)的啟動子的原核生物栽體；也參見"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"出自ScientificAmerican,1980，242:74-94;植物表達載體，其包括胭脂鹼合成酶啟動子區(Herrera-Estrella等人，1983，Nature303:209-213)或花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子(Gardner等人，1981，Nucl.AcidsRes.9:2871)和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(Herrera-Estrella等人,1984，Nature310:115-120);來自酵母或真菌的啟動子元件例如Gal4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子和/或鹼性磷酸酶啟動子。根據本發明的載體例如是質粒或病毒源的載體。特定實施方式中，使啟動子、一或多個複製原點和任選地，一或多個選擇標記(例如抗生素抗性基因)。表達載體包括調控基因表達(包括在期望宿主細胞中的基因表達)的調控序列。用於本發明多^達的示例性載體包括pET型質粒載體(Promega)或pBAD質粒載體(Invitrogen)或下述實施例中提供的那些。另外，本發明的載體用於轉化宿主細胞從而克隆或表達本發明的多核苷酸序列。本發明也包括由本發明載體所轉化的宿主細胞。這些細胞可通過將插入到上面限定的栽體中的核苷酸序列導入宿主細胞，然後在允許本發明的多核苦酸序列複製和/或表達的條件下培養所述細胞而獲得。宿主細胞可選自原核或真核生物系統，例如細菌細胞(革蘭氏陰性或革蘭氏陽小生)、酵母細胞(例3口酉良酒酵母(S"cc/rwwwycesce/^Wseae)或畢赤巴斯德酵母(屍ZW/"/mstor&))、動物細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)、植物細胞和/或使用杆狀病毒載體的昆蟲細胞。一些實施方式中，用於表達多肽的宿主細胞包括但不限於美國專利No.6,319,691、6,277,375、5，643，570或5,565,335中教導的那些，其每個通過整體引用作為參考，包括各自每個專利中引述的所有參考文獻。此外，可選擇調節插入序列表達或以所需特定形式修飾及加工基因產物的宿主細胞林。從某些啟動子的表達可以在某些誘導物存在下被升高；因此，可調控遺傳改造的多肽的表達。此外，不同宿主細胞具有用於蛋白質翻譯和翻譯後加工及修飾(例如糖基化、磷酸化)的特性及特異機制。可以選擇適宜的細胞系或宿主系統來保證表達了的外源蛋白質的期望的修飾和加工。例如，可以使用在細菌系統中表達來產生未糖基化的核心蛋白質產物。酵母中的表達將產生糖基化的產物。可以使用在哺乳動物細胞中表達以保證異源蛋白質的"天然"糖基化。此外，不同載體/宿主表達系統可不同程度地影響加工反應。也提供轉化的植物細胞、轉基因種子、轉基因植物部分和轉基因植物，其含有與調控元件有效連接的一或多個核苷酸序列、遺傳構建體、栽體，或包括本文公開的多核苷酸中一或多種的表達盒，或其生物學活性片段。如本文所4吏用，術語"植物"包括藻類和高等植物(包括但不限於樹)。因此，可用本發明的遺傳構建體、表達盒或本發明的載體轉化藻類、單子葉和雙子葉植物。某些優選實施方式中，用本發明的遺傳構建體轉化菸草植物或菸草細胞系。因此，本申請中討論的用於生產組合物的多肽或免疫方法可以源自或獲得自轉基因植物細胞，其已被遺傳改造來表達包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14(實質上由其組成或由其組成)的多肽、其片段、其變體多肽、或前述多肽的片段。參見，例如，美國專利公開號2004/0268442Al，其公開內容通過整體引用作為參考。本文將轉基因植物限定為植物細胞培養物、植物細胞系、植物組織培養物、低等植物、單子葉植物、雙子葉植物或源自轉化的植物細胞或原生質體的後代或其部分，其中轉化的植物基因組含有通過實驗室技術導入、並未原始存在於相同物種的天然，非轉基因植物細胞中的外源DNA。術語"轉基因植物"和"轉化的植物"有時在本領域用作同義術語來定義其DNA含有外源DNA分子的植物。適宜的時候，編碼如本文提出的多肽的多核苷酸可以^皮優化以在轉化的植物、植物細胞或植物部分中表達。也就是說，可以使用對應於目的物種的物種偏好密碼子來合成基因。本領域可獲得用於合成諸如植物偏好基因的方法。參見例如，美國專利No.5,380,831和5,436,391和Murray等人，(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498，此處通過引用作為參考。易於利用^^p的方法來實現用於在植物中表達多肽的基因盒的構建，例如Sambrook等人，(1989);和Ausubel等人，(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,NewYork,NY^i^開的那些。製備本發明的構建體時，可操作多種DNA片段以便提供以適合的方向和需要時在適合的讀碼框中的DNA序列。可使用連接頭或接頭來接合DNA片段或者可包括其它操作以提供方便的限制性酶剪切位點，除去多餘DNA,除去限制性酶剪切位點等。使用克隆進行多個步驟，以便擴增含有用於隨後導入期望宿主細胞的目的啟動子/基因的載體。可獲得多種克隆栽體，其克隆載體包括在大腸杆37菌中起作用的複製系統和允許選擇已轉化細胞的標籤。說明性的載體包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。因此，該序列可在適合的限制性酶剪切位點插入載體，生成的質粒用於轉化大腸桿菌宿主(例如大腸桿菌林系HBIOI、JM101和DH5a)，大腸桿菌在適合的營養培養基中生長且收穫細胞並裂解及回收質粒。分析可包括序列分析、限制性酶剪切分析、電泳等。每個操作後，用於最終構建體的DNA序列可被限制性酶剪切並接合下一序列，每個部分構建體可克隆入相同或不同的質粒中。可獲得栽體或可以容易地製備栽體用於轉化植物細胞。通常，質粒或病毒載體應含有所有在給定宿主中維持和表達異源DNA序列所需的DNA調控序列。該調控序列通常包括前導序列和編碼翻譯起始信號密碼子、翻譯終止密碼子的DNA序列，以及編碼調控信使RNA加工的3，UTR信號的DNA序列。在任何特定物種中選擇適合的元件以優化表達是本領域普通技術人員利用本文公開的教導的任務。最終，期望載體應具有能夠提供允許鑑定含有該栽體的宿主細胞的表型特性的標記基因。性植物DNA的影響。通常，使用任何轉化技術的異源基因的插入似乎是隨機的；然而，存在產生具有在植物細胞中位點特異性重組DNA的植物的技術(參見WO91/09957)。產生所期望序列或者在啟動子調控下的序列的表達的任何方法或方法的組合是可接受的。本發明不限於任何轉化植物細胞的特定方法。將DNA導入植物細胞的技術是本領域技術人員公知的。已經描述了四種將外源DNA遞送到植物細胞的基本方法。化學方法(Graham和vanderEb，K/n7/ow，54(02):536-539，1973;Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips,Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，iV.K5W:，660:136-153，1992);包括微注射的物理方法(Capecchi，CW/，1980,22(2):479-488)、電傳孔(Wong和Neumann，1982,祝—".to.O附麵w.，107(2):584畫587;Fromm,Taylor,Walbot，1985，7Vfl汰^cadSd.C7&4，82(17):5824-5828;美國專利No.5,384,253)和基因槍(Johnston和Tang，1994，M^幼^fcCW/.5/</.，43(A):353-365;Fynan，Webster,Fuller,Haynes，Santoro，Robinson,1993，TV""爿ow/.C/5^，90(24):11478-11482);病毒方法(Clapp,1993，C7/"./VnViato/"20(1):155-168;Lu，Xiao,Clapp,Li，Broxmeyer，1993，/.五jc屍.Afeflf"178(6):2089畫2096;Eglitis和Anderson,1988，必/ofec/m,々wes，6(7):608-614;Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson,1988，^w/.醜/</.，241:19-27);和受體介導方法(Curiel,Agarwal,Wagner,Cotten，1991，/W.胸/.爿crw/.編，88(19):8850-8854;Curiel，Wagner,Cotten，Birnstid，Agarwal，Li，Loechel，Hu，1992，/T"肌77^/*.，3(2):147-154;Wagner等人，1992，/VocTVfltf.t/5^，89(13):6099-6103)。利用電穿孔向植物細胞中導入DNA是本領域技術人員公知的。使用植物細胞壁降解酶(例如果膠降解酶)來提供比未處理的細胞更易於用電穿孔轉化的受體細胞。為了使通過電穿孔的轉化有效，可直接使用脆弱的組織，例如細胞懸浮培養物或胚發生愈傷組織、或幼胚或其它器官化組織。通常需要用果膠降解酶或以受控方式機械損傷對M物材料的細胞壁進行部分降解。該處理後的植物材料易於通過電穿孔接受外源DNA。向植物細胞中遞送外源轉化DNA的另一方法是通過孩史粒轟擊。這一方法中，微粒包被外源DNA並通過推動力遞送到細胞。該微粒通常由鴒、金、鉑和類似金屬製成。孩t粒轟擊的優點是不需要分離原生質體(Cristoii等人，1988，/VflW/^"/o/.，87:671-674)，也不需要對農桿菌感染的易感性。通過加速向玉米細胞中遞送DNA的方法的說明性實例是生物射彈粒子遞送系統(BiolisticsParticleDeliverySystem)，其可以用於推動包被J)NA的顆粒或細胞穿過屏到覆蓋有懸浮培養的玉米細胞的過濾膜表面。該屏M顆粒以便使顆粒不以大的聚集體形式遞送至受體細胞。對於轟擊，優選懸浮細胞濃縮到過濾膜或固體培養基上。或者幼胚或其它靶細胞可排列在固體培養基上。待轟擊的細胞定位在低於微彈停止板的適當距離上。轟擊轉化中，可優化預轟擊培養條件和轟擊參數來產生最大數目的穩定轉化體。用於轟擊的物理和生物參數在這一方法中都是重要的。物理因素是涉及^^tDNA/微彈沉澱的那些或影響任一微彈飛行和速度的那些。生物因素包括在轟擊前和轟擊後立即操作細胞的所有步驟，以幫助減輕與轟擊相關的創傷的靼細胞的滲透調整，以及轉化DNA的性質，例如線性DNA或完整超螺旋質粒。農桿菌介導的轉移是向植物細胞中導入外源DNA的廣泛應用的系統，因為可以將DNA導入整個植物組織，消除從原生質體再生完整植物的需要。用於向植物細胞中導入DNA的農桿菌介導的植物整合載體是本領域公知的。參見例如，Fraley等人，1985，5/W"/^o/ogy，3:629;Rogers等人，1987，Me仇/"E"w柳o/.，153:253-277所述的方法。此外，Ti-DNA的整合是產生很少重排的相對精確的方法。待轉移的DNA區由邊界序列所限定，且幹涉DNA通常插入植物基因組，如Spielmann等人，1986，Afo/.Gew"，205:34;Jorgensen等人，1987，Afo/.207:471所述。當今農桿菌轉化載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌中複製，以允許方便的操作。而且，近來在用於農桿菌介導的基因轉移的載體方面的技術*改進了載體中基因的排列和限制性位點以促進能夠表達多種蛋白質或多肽的載體的構建。以用於直接表達插入的多肽編碼基因，以啟動子和多聚腺苷酸化位點為側翼的方便的多接頭區適於本發明的目的。另外，含有臂和去臂的Ti基因的農桿菌可以用於轉化。可以使用基於磷酸鉤沉澱、聚乙二醇處理、電穿孔及這些處理的組合的方法實現植物原生質體的轉化(參見例如Potrykus等人，1985，Afo/.G^w"，199:183;Marcotte等人，1988，A^"屍e，335:454)。這些系統在不同植物物種中的應用取決於從原生質體再生特定物種的能力。一旦轉化了植物細胞、選擇並檢查了抗原表達，一些情況下能夠再生整個可育植物。這將極大取決於所選植物物種。用於再生多種植物物種的方法已經在文獻中報導且是熟練技術人員公知的。為了實踐本發明，優選轉化植物細胞系，其通過避免通常的冗長的再生步驟可以快速培養並擴大化。另外，植物細胞培養物的使用避免露天生產並極大降低基因逃逸和食品汙染的機會。優選諸如NT-l和BY-2(An，G.，1985，/^",'o/.,79:568-570)的菸草懸浮細胞培養物，因為這些系尤其易於在培養中處理、易於轉化、產生穩定的整合事件和適於冷藏。菸草懸浮細胞系NT-1適於實踐本發明。NT-1細胞原始產生自菸草(A7cC/fl"fl似^cm挑L.cv.)黃化葉片2。NT-1細胞系#皮廣泛使用且易於獲得；當然任何菸草懸浮細胞系都符合於本發明的實踐。適合用於下面實施例的NT-1細胞獲得自美國典型培養物保藏中心，保藏號ATCCNo,74840。也參見U.S.專利No6,140,075，其通過整體引用作為參考。已經描述了從實驗室規模搖瓶到幾千升生物反應器容器範圍內的許多植物細胞培養技術和系統且這是植物細胞培養領域公知的。參見例如Fischer,R.等人，1999，J/7//.醜/oc^附"30，109-112和Doran，P.，2000，C"frew,C)^/"/o朋/"祝o,"/^otog);，11:199-204。在將轉化的植物細胞培養至所需量後，收集它們，溫和地洗滌並放於適合的緩沖液中破碎。許多不同的緩沖液適合本發明。通常，緩衝液是中性pH值或該值附近的水性等滲緩衝鹽溶液，其不含有可以用於溶解膜的強去汙劑。優選的緩沖液包括Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水和含有lmMEDTA的PBS。一個實施方式中，可以通過超聲波破壞細胞。將洗滌過的細胞以約0.01gm/ml至約5.0gm/ml，優選約O.lgm/ml至約0.5gm/ml(每體積緩衝液中洗後溼重細胞)》文於緩沖液中。許多市售可得的超聲儀器適合本發明且超聲時間為約5至約20秒，優選約15至約20秒。生成物的大小可在幾孩t米至幾百微米的範圍內且暴露HA1多肽或其免疫原性片段。本發明也涉及DNA疫苗組合物，其可以用於引發免疫應答或保護性免疫應答。本發明的這一方面，包括編碼本文提供多肽(或其片段)的重組DNA或mRNA的組合物的量以足以引發所述個體中免疫應答或保護性免疫應答的量給予個體。可從編碼目的抗原的核酸中刪除信號序列且可根據本領域已知的方法監控個體免疫應答的誘導。"保護性免疫應答"或"治療性免疫應答"指CTL(或CD8+T細胞)、HTL(或CD4+T細胞)，和/或對抗原的保護性體液免疫應答，其以某種方式預防或至少部分抑制疾41病症狀、副作用或病程。這一發明的上下文中，該保護性或治療性應^供經免疫個體相比於未免疫個體增加的存活率(降低的死亡率)或受到禽流感病毒攻擊的經免疫個體中降低的病毒釋放。另一個實施方式中，本發明還包括結合多肽抗原給予本發明的多核苷酸(DNA)疫苗或其組合物。優選的實施方式中，抗原是由作為多核苷酸疫苗給予的多核苷酸所編碼的多肽。具體的優選實施方式中，多肽抗原作為加強劑在最初給予多核苷酸疫苗後給予。本發明的再一實施方式提供使用本領域技術人員已知的"引發-加強"(prime-boost)接種疫苗方案對本文公開的新型血凝素抗原(參見例如，所附序列表中列出的多肽和肽片段)免疫應答的誘導。本發明的這一方面，本發明的DNA疫苗或多肽抗原以足以"引發，，個體免疫應答的量給予個體。然後個體的免疫應答通過給予下述而"加強"l)本發明的肽、多肽和/或全長多肽抗原(任選地結合免疫刺激性分子和/或佐劑)之一或組合；或2)含有編碼一或多個相同或任選地不同的本文所列抗原、多表位構建體和/或肽抗原的核酸的病毒栽體。本發明的一些替換的實施方式中，編碼免疫刺激性分子的基因可整合到用於"加強"個體免疫應答的病毒載體中。示例性免疫刺激性分子包括但不限於IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL畫7、IL-8、IL-9、IL畫IO、IL畫ll、IL-15、11-16、11-18、IL畫23、IL畫24、促紅細胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板源性生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細胞生長因子(FGF;例如aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如，IGF-1、IGF-2);血管內皮生長因子(VEGF)、幹擾素(例如，IFN-y、IFN-a、IFN-P);白血病抑制因子(LIF);睫狀神經營養因子(CNTF);抑瘤素M;千細胞因子(SCF);轉化生長因子(例如TGF-a、TGF-卩1、TGF-卩1、TGF-卩1)或趨化因子(例如但不限於，BCA-1/BLC畫1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、嗜酸粒細胞趨化蛋白1(Eotaxin-l)、Eotaxin陽2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、CXXXC趨化因子/神經趨化因子、GROa/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-謹CAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP曙1、ABCD-1、MIP國la、MIP-ip、MIP畫2a/GROp、MIP-3a/Exodus/LARC、MIP-3(3/Exodus隱3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDFla、TARC或TECK)。編碼這些免疫刺激性分子的基因是本領域技術人員已知且編碼序列可獲自多種來源，包括多種專利資料庫、公共可獲得的資料庫(例如美國國立醫學圖書館或歐洲分子生物實驗室建立的核酸和蛋白質資料庫)、科學文獻或諸如Genzyme，Inc.,R&DSystems,Inc或InvivoGen，Inc公司生產的目錄中引用的科學文獻。(參見例如，1995CytokineResearchProductscatalog,GenzymeDiagnostics,GenzymeCorporation,CambridgeMA;2002或1995CatalogofR&DSystems,Inc(Minneapolis,MN);或2002CatalogofInvivoGen,Inc(SanDiego，CA)，其每個通過整體引用作為參考，包括此中引述的所有參考)。向個體中導入DNA疫苗的方法是熟練技術人員公知的。例如，可以將DNA注入骨骼肌或其它體細胞組織(例如肌內入射)。陽離子脂質體或生物射彈裝置，例如基因槍可以用於遞送DNA疫苗。或者可以使用離子電滲療法和其它經皮傳遞方法來向個體中導入DNA疫苗。用於本發明的病毒載體可以缺失病毒基因組的一部分以導入新基因而不破壞病毒的感染性。本發明的病毒載體通常是非病原性病毒。在醫師的選擇中，可以選擇病毒載體以便感染特定的細胞類型，例如專門的抗原呈遞細胞(例如巨噬細胞或樹突狀細胞)。或者，可以選擇能夠感染個體的任何細胞的病毒載體。適合用於本發明的示例性病毒載體包括但不限於痘病毒，例如痘苗病毒、禽痘病毒、雞痘病毒(fowlpoxvirus)、高度減毒痘苗病毒(例長口Ankara或MVA[ModifiedVacciniaAnkara])、逆轉錄病毒、腺病毒、杆狀病毒等。優選的實施方式中，病毒載體是Ankara或MVA。用於構建痘苗病毒表達載體的一般策略是本領域已知的(參見例如Smith和MossBioTechniquesNov/Dec，306-312，1984;U.S.專利No.4,738，846(通過整體引用作為參考)。Sutter和Moss(Proc.Nat'l.Acad.SciU.S.A.89:10847-10851，1992)和Sutter等人，(Vaccine,12(11):1032-40，1994)〃>開了非複製重組Ankara病毒(MVA)的構建和作為載體的應用，其可用作本發明的病毒載體。包括本發明多核苷酸的組合物可以包括市售可得的適合的核酸疫苗栽體(質粒)(例如Vical，SanDiego，CA)或也是市售可得的其它核酸載體(質粒)(例如，Valenti，Burlingame，CA)。或者本發明提供包括病毒載體和本發明多核苷酸的組合物。另外，該組合物可以包括可藥用載體，例如生理鹽水。該可藥用載體是本領域公知的且也是市售可得的。例如，i亥可藥用載體4笛述於E.W.Martin's及e/M/"gtow's戶/rflr附flcew,/cfl/5"c/ewce，MackPublishingCompany,Easton，PA。實施例1-載體構建貫穿這些實施例，可使用下面的標識指如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13所鑑定的序列SEQUENCEIDNO:1:HA5TW68v3:禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)H5Turkey/Wisconsin/68;無切割位點；按植物密碼子進4亍了優4匕；SEQUENCEIDNO:3:HA5TW68v4:禽流感病毒(AIV)HAH5Turkey/Wisconsin/68;無切割位點且絲氨酸239改變為天冬醯胺；按植物密碼子進4亍了優化；SEQUENCEIDNO:5:HA5TW68v5:禽流感病毒(AIV)HAH5Turkey/Wisconsin/68天然序列；植物密碼子優化的包括蛋白酶切割位點；SEQUENCEIDNO:7:HA5AHvl:禽流感病毒(AIV)HAH5902755祖先共有雜交體，其M酸在位置99、102和170有修飾；無切割位點；植物密碼子優化的；SEQUENCEIDNO:9:HA5AHv2:禽流感病毒(AIV)HAH5902755祖先共有雜交體，其M酸在位置99、102和239有修飾；無切割位點；按植物密碼子進行了優化；和SEQUENCEIDNO:11:HA5AHv3:禽流感病毒(AIV)HAH5卯2755祖先共有雜交體，其M酸在位置99、102、170和239進行修飾；無切割位點；按植物密碼子進行了優化。44這些實施例中也討論下述包括SEQIDNO:1、3、5、7、9和11的HA基因/載體構建體pDAB4492vlUbilO-PAT:CSVMV隱HA5tw68v3(栽體含有SEQIDNO:1);pDAB4493vlUbilO-PAT:dMas-HA5tw68v3(栽體含有SEQIDNO:i);pDAB4494v2UbilO-PAT:dMas-HA5tw68v4(載體含有SEQIDNO:3);pDAB4495v3UbilO國PAT:dMas-HA5tw68v5(載體含有SEQIDNO:5);pDAB4496v4UbilO-PAT:dMas畫HA5AHvl(載體含有SEQIDNO:7);pDAB4497v5UbilO-PAT:dMas-HA5AHv2(載體含有SEQIDNO:9);和pDAB4498v6UbilO-PAT:謹as畫HA5AHv3(載體含有SEQIDNO:11)。出於這些實施例的目的，使用CSVMV指美國專利No.7,053,205(其通過整體引用作為參考)中公開的木薯葉脈花葉病毒啟動子；使用PAT指美國專利No.5,633,434;5，879，卯3;5,637,489;5,276,268;5,273,894(其各自通過整體引用作為參考)公開的膦絲菌素乙醯轉移酶選擇標記，dMas指美國專利No.5,001,060;5，573,932和5，290，924(其各自通過整體引用作為參考)中公開的嵌合組成型啟動子40CSAMAS。下面也提供在每個構建體中各自進行基因/M酸修飾的總結構建體和基因99102170239343pDAB4492vlHA5tw68v3DTSNAS—pDAB4493vlHA5tw68v3DTSNAs—pDAB4494v2HA5tw68v4DTSNAN—pDAB4495v3HA5tw68v5DTSNASRQKRtableseeoriginaldocumentpage46pDAB4492的構建含有HA5tw68v3的植物密碼子優化的序列(SEQIDNO:1;血凝素H5TurkeyWisconsin68#3型)的質粒DASPIC069獲自PicoScript,8080NorthStadium,Suite2100,Houston,TX77054。HA5tw68v3DNA編碼序列通過Bbsl和Sacl限制性酶酶切分離自DASPIC069,並克隆到pDAB3912的相應Ncol和Sacl限制位點。生成的構建體pDAB4485含有CsVMV啟動子v2(木薯葉脈花葉病毒啟動子#2型)—HA5tw68v3編碼序列-AtuORF233'UTRvl(農桿菌開放讀碼框233，未翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL限制位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切確i人pDAB4485。CsVMV啟動子v2-HA5tw68v3—AtuORF233，UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元栽體pDAB3736的attRGateway重組位點(Cat#11791-019，InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切鑑定陽性克隆並通過測序反應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B-RB7MARv3(擬南芥(爿m6,Vfo/^s^fl//"Mfl)基質結合區#3型)—CsVMV啟動子v2-HA5tw68v3—AtuORF233，UTRvl-AtUbilO啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型)-PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶弁3型)-AtuORF13'UTRv3(根瘤農桿菌開放讀碼框l3，非翻譯區#3型)"T-DNA邊界A。獲得的載體被標記為pDAB4492。pDAB4493的構建含有HA5tw68v3的植物密碼子優化的序列(血凝素H5TurkeyWisconsin68#3型)的質粒DASPIC069獲自PicoScript,8080NorthStadium,Suite2100，Houston,TX77054。HA5tw68v3DNA編碼序列通過Bbsl和Sacl限制性酶酶切分離自DASPIC069，並克隆到pDAB3914的相應的Ncol和Sacl限制位點。生成的構建體pDAB4486含有AMAS啟動子vl(AMAS4OCS啟動子#1型)—HA5tw68v3編碼序列-AtuORF233，UTRvl(根瘤農桿菌開放讀碼框233，非翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL重組位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切確認pDAB4486。△Mas啟動子vl-HA5tw68v3—AtuORF233，UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元栽體pDAB3736的attRGateway重組位點(Cat#11791-019，InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切鑑定陽性克隆並通過測序反應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B-RB7MARv3(擬南芥基質結合區#3型)-AMas啟動子vl—HA5tw68v3—AtuORF233'UTRvl-AtUbil0啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型)~PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶#3型)—AtuORF13，UTRv3(才艮瘤農桿菌開放讀碼才匡13，非翻譯區#3型)-T-DNA邊界A。獲得的載體標記為pDAB4493。pDAB4494的構建含有HA5tw68v4的植物密碼子優化的序列(SEQIDNO:3;血凝素H5TurkeyWisconsin68#4型)的質粒DASPICO70獲自PicoScript,8080NorthStadium,Suite2100，Houston,TX77054。HA5tw68v4DNA編碼序列通過Bbsl和Sacl限制性酶酶切分離自DASPICO70,並克隆到pDAB3914的相應Ncol和Sacl限制位點。生成的構建體pDAB4487含有△MAS啟動子vl(AMAS4OCS啟動子#1型)—HA5tw68v4編碼序列一AtuORF233'UTRvl(根瘤農桿菌開放讀碼框233，非翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL重組位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過卩艮制'l"生酶酶切確i人pDAB4487。△Mas啟動子vl-HA5tw68v4—AtuORF233，UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元載體pDAB3736的attRGateway重組位點(Cat#11791-019,InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶切鑑定陽性克隆並通過測序^^應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B—RB7MARv3(擬南芥基質結合區#3型)-AMas啟動子vl-HA5tw68v4AtuORF233，UTRvl-AtUbil0啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型)-PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶弁3型)AtuORFl3'UTRv3(根瘤農桿菌開放讀碼框13，非翻譯區#3型)-T-DNA邊界A。獲得的載體標記為pDAB4494。pDAB4495的構建含有HA5tw68v5的植物密碼子優化的序列(SEQIDNO:5;血凝素H5TurkeyWisconsin68#5型)的質粒DASPIC071獲自PicoScript，8080NorthStadium,Suite2100，Houston,TX77054。HA5tw68v5DNA編碼序列通過Bbsl和Sacl限制性酶酶切分離自DASPIC071，並克隆到pDAB3914的相應Ncol和Sacl限制位點。生成的構建體pDAB4488含有AMAS啟動子vl(AMAS4OCS啟動子#1型)—HA5tw68v5編碼序列一AtuORF233'UTRvl(根瘤農桿菌開放讀碼框233，非翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL重組位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過卩艮制4生酶酶+刀確^人pDAB4488。△Mas啟動子vl-HA5tw68v5—AtuORF233，UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元載體pDAB3736的attRGateway重糹且位點(Cat#11791-019)，InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶切鑑定陽性克隆並通過測序反應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B—RB7MARv3(擬南芥基質結合區#3型)-AMas啟動子vl—HA5tw68v5—AtuORF233，UTRvl-AtUbil0啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型)-PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶#348型)-AtuORF13，UTRv3(根瘤農桿菌開放讀碼框13，非翻譯區#3型)國T-DNA邊界A。獲得的載體標記為pDAB4495。pDAB4496的構建含有HA5AHvl的植物密碼子優化的序列(SEQIDNO:7;血凝素H5AnimalHealth#1型)的質粒DASDNA1獲自DNA2.0，1430O'BrienDrive,SuiteE，MenloPark,CA，94025。HA5AHvlDNA編碼序列通過Bbsl和Sacl限制性酶酶切分離自DASDNA1，並克隆到pDAB3914的相應Ncol和Sacl限制位點。生成的構建體pDAB4489含有AMAS啟動子vl(△MAS4OCS啟動子#1型)—HA5AHvl編碼序列—AtuORF233'UTRvl(根瘤農桿菌開放讀碼框233，非翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL重組位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切確認pDAB4489。△Mas啟動子vl-HA5AHvl—AtuORF233，UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元載體pDAB3736的attRGateway重糹且位,S、(Cat#11791-019，InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切鑑定陽性克隆並通過測序反應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B-RB7MARv3(擬南芥核基質結合區#3型)-厶Mas啟動子vl-HA5AHvl—AtuORF233，UTRvl—AtUbil0啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型)~PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶#3型)-AtuORF13'UTRv3(根瘤農桿菌開放讀碼框13，非翻譯區#3型)-T-DNA邊界A。獲得的載體標記為pDAB4496。pDAB4497的構建含有HA5AHv2的植物密碼子優化的序列(SEQIDNO:9;血凝素H5AnimalHealth#2型)的質粒DASDNA2獲自DNA2.0,1430O'BrienDrive,SuiteE，MenloPark,CA,94025。HA5AHv2DNA編碼序列通過BbsI和Sacl限制性酶酶切分離自DASDNA2,並克隆到pDAB3914的相應Ncol和Sacl限制位點。生成的構建體pDAB44卯含有AMAS啟動子vl(△MAS4OCS啟動子#1型)—HA5AHv2編碼序列-AtuORF233，UTRvl(根瘤農桿菌開放讀碼框233，非翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL重組位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切確i人pDAB4490。△Mas啟動子vl-HA5AHv2—AtuORF233'UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元載體pDAB3736的attRGateway重組位點(Cat#11791-019，InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶切鑑定陽性克隆並通過測序反應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B-RB7MARv3(擬南芥基質結合區#3型)-AMas啟動子vl—HA5AHv2AtuORF233，UTRvl—AtUbil0啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型)-PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶#3型)-AtuORFl3，UTRv3(根瘤農桿菌開放讀碼框13，非翻譯區#3型)-T-DNA邊界A。獲得的載體標記為pDAB4497。pDAB4498的構建含有HA5AHv3的植物密碼子優化的序列(SEQIDNO:11;血凝素H5AnimalHealth#3型)的質粒DASDNA3獲自DNA2.0,1430O，BrienDrive,SuiteE，MenloPark,CA，94025。HA5AHv3DNA編碼序列通過Bbsl和Sacl限制性酶酶切分離自DASDNA3，並克隆到pDAB3914的相應NcoI和SacI限制位點。生成的構建體pDAB4491含有AMAS啟動子vl(AMAS4OCS啟動子#1型)~HA5AHv3編碼序列-AtuORF233'UTRvl(根瘤農桿菌開放讀碼框233，非翻譯區#1型)，其側翼加有GatewayattL重組位點(Gateway克隆系統和att位點來自InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶酶切確認pDAB4491。△Mas啟動子vl—HA5AHv3—AtuORF233，UTRvl表達盒通過GatewayClonase的酶反應固定到目的雙元載體pDAB3736的attBGateway重組位點(Cat#11791-019，InvitrogenCorporation,CarlsbadCA)。通過限制性酶切鑑定陽性克隆並通過測序反應確認。完整的雙元載體含有T-DNA邊界B-RB7MARv3(擬南芥核基質結合區#3型)-△Mas啟動子vl—HA5AHv3—AtuORF233'UTRvl-AtUbilO啟動子v2(擬南芥多聚遍在蛋白10啟動子#2型PATv3(膦絲菌素乙醯轉移酶#3型)-AtuORF13，UTRv3(根瘤農桿菌開放讀碼框13，非翻譯區#3型)誦T-DNA邊界A。獲得的栽體標記為pDAB4498。農桿菌轉化將每個雙元構建體電穿孔到根瘤農桿菌林系LBA4404(1.8V，25pF，100Q)。菸草植物瞬時表達為了觀察植物是否正確表達合成基因，將雙元構建體按照Frederick等人(Frederick,R.D.，Thilmony,R丄.，Sessa，G.&Martin,G,B.RecognitionspecificityforthebacterialavirulenceproteinAvrPtoisdeterminedbyThr-204intheactivationloopofthetomatoPtokinase.Mo/O//1998，2(2)，241-245)瞬時轉化本生菸草(7V/coftVm"6e"^"附/"w")。接種2和3天後取葉樣品。然後通過HA-特異ELISA分析檢測表達。用在0.01M硼酸鹽緩沖液(3.8g.l"硼酸鈉，pH9,過濾滅菌)中稀釋的山羊抗國HA包被96孔ELISA板。將該板在室溫過夜賻育。在Bio101Fastprep儀中，通過在lml.g—1PBS中使新鮮植物材料均勻化而製備粗蛋白質提取物。通過在4°C於Eppendorf5415C微離心機中在14000轉/分鐘離心5min而除去不溶材料。分析期間將獲得的樣品上清保持在冰上且隨後儲存在-80。C。用每孔300^11的PBST(PBS原液+0.05%Tween-20)使用'3fe^l機洗板3次。然後用含5%脫脂牛奶的PBST(每孔200^1)於37°C封閉板2h並用每孔300^il的PBST洗滌3次。然後向孔中加入標準和樣品(每孔200jli1)並在37°C孵育1小時。用每孔300W的PBST洗板3次，每孔加入lOO^il的雞抗-AIV37。C孵育1h。然後在以每孔lOOjLil加入稀釋二抗(山羊抗雞IgG或兔抗山羊辣根過氧化酶綴合物(Sigma)之前，用PBST洗板3次。將板在37°C賻育lh，用PBST洗滌3次然後與TMB底物(BioRad，每孔lOOpl)反應。在450nm讀取OD值之前允許顯色20-25min。如圖4所示，觀察到合成的HA基因的瞬時表達(使用雙元載體pDAB4492-pDAB4498)。柱表示在接種2或3天後取自7個收集樣品的粗提物的兩個重複的平均OD。取平均值後，從轉基因樣品OD中減去野生型植物葉的OD。"92"表示pDAB4492;"93"表示pDAB4493;"94"表示pDAB4494;"95"表示pDAB4405;"96"表示pDAB4496;"97"表示pDAB4497;"98，，表示pDAB4498;"d2，，表示第2天和"d3，，表示第3天。因此，通過產生的抗禽流感抗體檢測合成的HA基因並且該合成的HA基因也在植物(本生菸草)中瞬時表達。實施例2-NT1細胞系中的表達由於已證明可由植物表達合成基因，構建體用於穩定轉化NT1細胞系。植物細胞系NT1源自降低了生物鹼含量且不具備再生為植物的能力的菸草細胞。植物細胞培養物按Cardineau，GuyA.;Mason,HughStanley;VanEck，JoyceM.;Kirk,DwayneD.;Walmsley，AmandaMaree所述進行轉化。用於製備免疫保護性組合物(例如新城疫病毒HN抗原)的載體和細胞來自轉基因植物。WO2004098533(其通過整體引用作為參考)和HA表達通過之前描述的HA-特異性ELISA確定。表4和圖5說明多種細胞系中表達的HA的量。52表4、AIVHA在NT1植物細胞培養物中的穩定表達。細胞系號碼的前兩個數字表示質粒構建體(pDAB44xx)植物細胞培養系號碼HA濃度(mg/L)CHA(3)75.43CHA3.(1)92.57CHA3.(2)156.8695.3.1948.0095.3.(1)546.8695.3.(2)546.8697.2097.9500.7797.12097.13759.2397.15210.0097.17131.5497.18210.0097.19362.3198.2098.3098.9098.34098.35300.7598.36563.2598.37098.39098.48.2598.410實施例3-矮牽牛植物轉化和HA表達使用下述方法轉化矮牽牛。在具有維生素的1/2YMB和V4Murashige和Skoog氏基礎培養基(MS培養基)中以1:5稀釋制M有構建體的髮根農桿菌(AW^ogwieW的48h培養物。在25。C再孵育經稀釋的培養物2h。在浸入髮根農桿菌培養物之前用0.4%次氯酸鈉表面滅菌矮牽牛葉盤。將感染的葉盤在轉移至選擇板之前置於MS瓊脂板48h。MS瓊脂板含有MS培養基、3%(w/v)蔗糖、1mgl/16-苄絲嘌呤(BAP)，1mgL"吲咮-3-乙酸(IAA)和0.8%(w/v)瓊脂。選擇板含有MS培養基、3%(w/v)蔗糖、0.8%(w/v)瓊脂和5mg/L草銨磷(glufosinate)。新形成的發才艮以及小部分親本組織轉移到含有500照mr1頭孢噢肝和5mg/L草銨磷的液體選擇MS培養基中。生長10-14天後，從每個健康生長的培養物中取單個根尖並方iL^新鮮液體選擇MS培養基中。按照這一單個才艮尖亞培養物將根培養物分類為獨立系。每2-3周將獨立系轉移到含有降低的抗生素濃度(250照ml-i頭孢瘞將)和5mg/L草銨磷的新鮮培養基。如圖6所示，被特異抗體識別的HA可在矮牽牛中表達。實施例4-基因PDAB4493-98的DNA疫苗構建體和小鼠疫苗接種將包括修飾的TurkeyWisconsin68林系的HA基因以及具有修飾的共有序列祖先基因克隆到載體用於DNA疫苗。使用含有H/"dIII位點的引物AI11(5'-GCTAGCGGCCGCAATGCAGATTCTGCATTGAA畫3，)(SEQIDNO:15)和含有iVWI位點的引物AI12(5，-GCATAAGCTTCCATGGAGAGGATTGTGAT-3，)(SEQIDNO:16)PCR擴增來自pDAB4493-4498的HA基因。將PCR產物凝膠純化(Qiagen試劑盒)、歷wdIII和7VWI消化並連接到由III和iVWI消化的pcDNA3(Invitrogen)的多克隆位點。生成的構建體通過限制性酶酶切、PCR和測序確i人。陽性對照pCI-PR8由LorenaBrownUniversityofMelbourne,MelbourneAustralia提供。pCI-PR8含有來自A/PR/8/34(PR8)(保藏號AF389118)的HA基因。對十隻BALBc小鼠/組(2個重複，每個重複五隻)，在第0和10天用100pgDNA疫苗肌肉免疫，並在第14、28、56和84天抽血。通過標準ELISA技術檢測用5叫PR-8HA/孔包被的微滴定板對PR-8HA的抗體應答並如圖7所示。實施例5—動物細胞的DNA轉染使用聚乙烯亞胺(PEI)方法對人293T細胞進行轉染。簡言之，將細胞加種到含有包括10%胎牛血清(TC培養基)的DMEM的6-孔板中並於37。C，5。/oC02^中過夜生長。第二天，當細胞融合70-別％時，除去培養基並加入lml新的TC培養基在37°C，5%C02孵育lh。這一孵育期間，制^^個孔的反應混合物如下總體積200^1的普通DMEM中2照DNA,9ulPEI。將反應混合物混和並在室溫孵育10-20min。向每孔加入200pl並將板在37°C，5%C02中孵育48h。孵育24h後用PBS洗滌孔並加入2ml新的TC培養基。通過除去培養基、用PBS洗滌並在含有5mMEDTA的500|alPBS(PBSE)中重懸浮細胞而收集轉染。然後將細胞轉移到1.5ml管中，離心沉澱並在200|lU的PBSE中重懸浮。將細胞進行3次凍融循環並加入NonidetP40(NP-40，非離子表面活性劑)至終濃度1%,為了確定表達的蛋白質吸附雞紅細胞的能力，轉染哺乳動物細胞(293T和Vero)，隨後在無血清培養基中孵育l-4h。除去培養基隨後加入500jul0.5-1%雞紅細胞。室溫孵育45min，充分洗滌細胞並顯微鏡檢查。轉基因HA蛋白質與紅細胞交聯的能力表明轉基因蛋白質保留了其構象以及結合在紅細胞表面的糖基團的能力。構建體pCI-PR8對照構建體單獨pcDNA構建體模擬(mock)pcDNA-4493tw68植物密碼子pcDNA-4494tw68239S為NpcDNA-4495tw68+切割pcDNA-4496祖先170NSTpcDNA-4497S且先239S為NpcDNA-4498祖先170NST239N+分數(293T)-48hr分數(Vero)—24hr++++++++++++注釋++++，有許多紅細胞附著的血細胞吸附(hemabsorbing)細胞的高發生+++，有大於5個紅細胞附著的血細胞吸附細胞的中度高發生率++,有大於5個紅細胞附著的血細胞吸附細胞的中;OC生率+，有大於5個紅細胞附著的血細胞吸附細胞的一定的發生率-，未檢測到血細胞吸附細胞的發生表la:SEQIDNO:2、4、8、10或14的N端^tj^酸位置("Y")50991481972462953443934424915402511001491982472963453944434925413521011501992482973463954444935424531021512002492983473964454945435541031522012502993483974464955446551041532022513003493984474965457561051542032523013503994484975468571061552042533023514004494985479581071562052543033524014504995481059108157206255304353402451500549116010915820725630535440345250155012611101592082573063554044535025511362111160209258307356405454503552146311216121025930835740645550455315641131622112603093584074565055541665114163212261310359408457506555176611516421326231136040945850755618671161652142633123614104595085571968117166215264313362411460509558206911816721626531436341246151055921701191682172663153644134625115602271120169218267316365414463512237212117021926831736641546451324731221712202693183674164655142574123172221270319368417466515267512417322227132036941846751627761251742232723213704194685172877126175224273322371420469518297812717622527432337242147051957tableseeoriginaldocumentpage58tableseeoriginaldocumentpage59tableseeoriginaldocumentpage60tableseeoriginaldocumentpage60tableseeoriginaldocumentpage61表2b:SEQIDNO:6的C端絲酸位置("Z")554103152201250299348397446495544655104153202251300349398447496545756105154203252301350399448497546857106155204253302351楊449498547958107156205254303352401450499548105910815720625530435340245150054911601091582072563053544034525015501261110159208257306355404453502551136211116020925830735640545450355214631121612102593083574064555045531564113162211260309358407456505554166511416321226131035940845750655517661151642132623113604094585075561867116165214263312361410459508557196811716621526431336241146050955820691181672162653143634124615105592170119168217266315364413462511560227112016921826731636541446351256123721211702192683173664154645135622473122171220269318367416465514563257412317222127031936841746651556426751241732222713203694184675165652776125174223272321370419468517566287712617522427332237142046951856729781271762252743233724214705195683079128177226275324373422471520318012917822727632537442347252132811301792282773263754244735223382131180229278327376425474523348313218123027932837742647552462tableseeoriginaldocumentpage63tableseeoriginaldocumentpage64419013918823728633538443348253142911401892382873363854344835324392141l卯239288337386435484533449314219124028933838743648553445941431922412卯33938843748653546951441932422913403894384875364796145194243292341390439488537489714619524429334239144048953849981471962452943433924414卯539表3b:SEQIDNOs:12的C端^&酸位置("Z")5541031522012502993483974464955446551041532022513003493984474965457561051542032523013503994484975468571061552042533023514004494985479581071562052543033524014504995481059108157206255304353402451500549116010915820725630535440345250155012611101592082573063554044535025511362111160209258307356405454503552146311216121025930835740645550455315641131622112603093584074565051665114163212261310359408457506176611516421326231136040945850718671161652142633123614104595081968117166215264313362411460509206911816721626531436341246151021701191682172663153644134625112271120169218267316365414463512237212117021926831736641546451365tableseeoriginaldocumentpage66權利要求1、包括SEQIDNO2、4、6、8、10、12或14的分離的、純化的和/或重組的多肽。2、包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的片段的分離的、純化的和/或重組的多肽，所述片段包括a)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽的片段；b)"從Y到Z"的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的片段，其中Y是所述序列的N端胺基酸而Z是所述序列的C端胺基酸，該片段長度為至少5個胺基酸，且Y和Z是表1-4中針對特定SEQIDNO:給出的任何整數；或c)多肽片段或如圖1、2或3所示多肽片段，其中所述多肽片段或所述變體多肽的片段具有至少一種與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽的相應生物學活性基本上相同的生物學活性。3、分離的或純化的變體多肽，其與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽具有至少60%-99.99%的同一性,且其具有至少一種與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多^M目關的生物學活性。4、分離的、純化的和/或重組的多肽，包括a)選自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12和14的多肽的表位；或；b)多表位構建體，其包括選自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12和14的多肽的至少一個表位。5、分離的或純化的多肽，其包括異源多肽序列和根據權利要求1、2或3中任一項的多肽。6、包括載體和權利要求l、2、3或4中任一項的多肽的組合物。7、分離的多肽，包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14;或SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的至少五個連續胺基酸的片段；或包含如圖1、2或3所示的一段M酸的片段，其中所述多肽或片段誘導對感染性禽流感病毒的免疫保護性應答，並且其中所述至少5個胺基酸的片段跨越SEQIDNO:2的^J^酸99;跨越SEQIDNO:4的^J^酸239;跨越SEQIDNO:6的胺基酸326;胺基酸327;胺基酸328;胺基酸329;胺基酸326和327;胺基酸327和328;胺基酸328和329;胺基酸326、327和328;Jl&酸327、328和329;或^J^酸326、327、328和329;跨越SEQIDNO:8的胺基酸99;胺基酸102;胺基酸170;胺基酸99和102;胺基酸102和170;或胺基酸99、102和170;跨越SEQIDNO:10的胺基酸99;胺基酸102;胺基酸239;胺基酸99和102;胺基酸102和239;或氛基酸99、102和239;或跨越SEQIDNO:12的胺基酸99;胺基酸102;胺基酸170;胺基酸239;胺基酸99和102;胺基酸102和170;胺基酸170和239;胺基酸99、102和170;胺基酸102、170和239;或氛基酸99、102、170和239。8、根據權利要求7的分離的多肽，其中所述多肽在植物細胞中產生，包括a)用包括編碼所述多肽或其片段的多核苷酸的重組載體轉化植物細胞以形成轉化的植物細胞；b)在適於表達所述多肽的條件下培養所述轉化的植物細胞；和c)從所述轉化的植物細胞中回收所述多肽。9、根據權利要求7或8的分離的多肽，其中所述多肽或多肽片段與異源多肽序列融合。10、免疫個體抗禽流感病毒的方法，包括給予足以在所述個體中誘導免疫應答的量的組合物，所述組合物包括載體和多肽，該多肽包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14;或SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的至少5個連續胺基酸的片段；或包含如圖1、2或3所示的一段M酸的片段，其中所述多肽或片段誘導對感染性禽流感病毒的免疫保護性應答且其中所述至少5個連續胺基酸的片段跨越SEQIDNO:2的胺基酸99;跨越SEQIDNO:4的^J^酸239;跨越SEQIDNO:6的^J^酸326;胺基酸327;胺基酸328;胺基酸329;胺基酸326和327;胺基酸327和328;^J^酸328和329;^J^酸326、327和328;^&酸327、328和329;或^J^酸326、327、328和329;跨越SEQIDNO:8的^J^酸99;酸102;胺基酸170;胺基酸99和102;胺基酸102和170;或胺基酸99、102和170;跨越SEQIDNO:10的胺基酸99;氣基酸102;胺基酸239;氮基酸99和102;胺基酸102和239;或胺基酸99、102和239;或跨越SEQIDNO:12的胺基酸99;氛基酸102;氬基酸170;胺基酸239;酸99和102;胺基酸102和170;胺基酸170和239;胺基酸99、102和170;#^酸102、170和239;或胺基酸99、102、170和239。11、根據權利要求10的方法，其中所述多肽或所述多肽片段與異源多肽序列融合。12、根據權利要求ll的方法，其中所述多肽或其片段是植物產生的多肽或植物產生的片段。13、誘導對禽流感(AI)病毒林系的免疫應答的方法，包括向個體給予足以在所述動物中誘導免疫應答的量的核酸序列或2)病毒栽體，其中所述核酸序列編碼包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14，或所述多肽的免疫原性片段；或包括如圖1、2或3所示的M^列的肽片段的多肽；或其中所述病毒載體包括編碼包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或所述多肽的免疫原性片段；或包括如圖l、2或3所示的M紗列的肽片段的核絲列。14、根據權利要求13的方法，其中所述方法還包括通過給予組合物而加強所述動物的免疫應答，該組合物包括包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽，或所述多肽的免疫原性片段或包含如圖l、2或3所示的M餅列的肽片段。15、根據權利要求13或14的方法，其中所述多肽或所述多肽的免疫原性片段與異源多肽序列融合。16、根據權利要求13、14或15的方法，其中所述多肽或所述多肽的免疫原性片段源自植物。17、才艮據權利要求7、10、11、13、14或15的方法，其中所述多肽在原核生物或真核生物細胞中製備。18、分離的多核苷酸序列或與其互補的多核苷酸，所述多核苷酸序列編碼包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者圖1、2或3的一或多個多肽片段或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的片段。19、分離的多核苷酸序列或與其互補的多核苷酸，所述多核苷酸序列包括編碼與包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的或者圖1、2或3的一或多個多肽片段具有20%-99.99%序列同源性或同一性的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽具有與包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的或者圖1、2或3的一或多個多肽片段相關的至少一種生物學活性。20、與包括SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的多核苷紗列具有至少約20%-99.99%同一性的分離的或純化的多核苷酸序列，或與其互補的多核苷酸。21、分離的或純化的包括SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13或SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的至少連續8個核苷酸的片段的多核苦酸序列或與其互補的多核苷酸，任選地所述片段是標記的。22、包括多核苷^列的遺傳構建體，包括a)編碼包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者圖的一或多個多肽片段或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的片段的多核苷酸或者與其互補的多核苷酸；b)多核苷酸序列，或者與其互補的多核苷酸，所述多核苷酸序列編碼與包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQIDNO:或14的或者圖1、2或3的一或多個多肽片段具有20%-99.99%序列同源性或同一性的多肽，其中所述多肽具有與包括SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的或者圖1、2或3的一或多個多肽片段相關的至少一種生物學活性；c)與包括SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的多核苷,列具有至少約20%-99.99%同一性的多核苷酸序列，或與其互補的多核苷酸；或d)包括SEQIDNO:l、3、5、7、9、11或13或SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13的至少連續8個核苷酸的片段的多核苷酸序列，或與其互補的多核苷酸。23、根據權利要求22的遺傳構建體，其中所述構建體是載體。24、包括根據權利要求22的遺傳構建體或根據權利要求18、19、20或21中任一項的多核苷酸的宿主細胞。25、包括根據權利要求22的遺傳構建體或根據權利要求18、19、20或21中任一項的多核苷酸的轉基因植物。全文摘要本發明提供了禽流感A病毒血凝素蛋白質的新型胺基酸序列(包括共有序列)。設計這些新構建的基因以提供跨血清型家族更廣譜的活性譜從而為具有廣泛異源性疾病的疫苗保護基礎。還通過向其編碼的胺基酸序列添加策略性的糖基化位點而改進該新型基因。這些基因也可以任選地針對植物表達而進行密碼子優化，經插入到適合的載體和經克隆到植物而用於表達。通過重組宿主細胞或轉基因植物產生的多肽也可以用作配製用於控制易感個體流感的疫苗的抗原來源。另外，轉基因植物材料也可用作配製用於控制易感個體流感的疫苗的抗原來源。文檔編號A61K39/12GK101472607SQ200780022380公開日2009年7月1日申請日期2007年6月8日優先權日2006年6月16日發明者I·M·拉裡努亞,M·亨利,S·M·拉塞爾申請人:美國陶氏益農公司