人血清cxcl16酶聯免疫檢測試劑盒及其製備和使用方法

2023-05-30 06:53:26

人血清cxcl16酶聯免疫檢測試劑盒及其製備和使用方法
【專利摘要】本發明提供了一種人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒及其製備和使用方法。根據本發明一方面提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，包括包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板，CXCL16標準品，生物素標記抗人CXCL16抗體以及鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶。根據本發明另一方面提供的上述試劑盒的製備方法，包括製備：包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板、CXCL16標準品、生物素標記抗人CXCL16抗體以及鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶。根據本發明又一方面提供的上述試劑盒的使用方法，包括加樣、加生物素化抗體、加辣根過氧化物酶、顯色以及終止步驟。
【專利說明】人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒及其製備和使用方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫學檢測領域，具體而言,涉及一種人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒及其製備和使用方法。

【背景技術】
[0002]趨化因子(chemokines，CK)是具有多種生物學功能的小分子蛋白質，是細胞因子家族中非常重要的成員。CK分子中均有4個保守的半胱氨酸(C)，根據其氨基端(N端)前兩個半胱胺基酸位置將趨化因子分為4類:C類、CC類、CXC類和CX3C類，相應受體分別稱為CR、CCR、CXCR與CX3CR。目前，所發現的趨化因子主要屬於CXC類和CC類。趨化因子及其受體分子作為控制靶點，可用於相關疾病的控制和治療。
[0003]CXCL16是一種獨特的CXC趨化因子，以跨模型和可溶性兩種形式存在。全長的CXCL16是I個跨膜型趨化因子，由4個結構域組成，即:趨化結構域、糖基化黏蛋白樣柄、單螺旋的跨膜結構域及胞漿結構域，前兩者相連接形成胞外區域。CXCR6是CXCL16的唯一受體，主要在記憶性τ細胞、B細胞、樹突狀細胞和激活的ra8+T淋巴細胞中表達。
[0004]趨化因子與靶細胞表面七次跨膜的G蛋白偶聯受體相結合，通過信號轉導途徑介導細胞遷移。腫瘤組織中趨化因子及受體為腫瘤細胞生長、黏附及定向遷移提供條件，與腫瘤轉移密切相關。CXCL16在細胞外液形成一定濃度梯度引導CXCR6(+)靶細胞定向遊走，快速募集靶細胞進行應答，穩定CXCR6(+)細胞遷移和組織歸巢。在肉瘤、膠質瘤、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、宮頸癌等癌細胞中均存在CXCR6的過度表達。CXCL16在細胞外液形成一定濃度梯度引導CXCR6(+)靶細胞定向遊走，快速募集靶細胞進行應答，穩定CXCR6(+)細胞遷移和組織歸巢。此外研究表明，CXCL16在動脈粥樣硬化、風溼免疫疾病及其他炎症性疾病中起重要作用。
[0005]可見CXCL16無論是對炎症的評估還是對腫瘤的監測都有很高的價值，將其作為疾病的指標的研究也越來越受到重視。目前國外已有測定CXCL16的ELISA試劑盒面試，但多為僅供科研應用，因操作耗時等因素還不適合用於臨床，如R&D Systems的ImmunoassayDCX160系列。而國內測定CXCL16的ELISA試劑盒，雖然價格適中，但試劑盒質量不穩定，靈敏度和準確度都達不到臨床應用的要求。
[0006]因此，為了解決現有技術中的上述不足，本發明提出了一種新的解決方案。


【發明內容】

[0007]為了解決現有技術中的上述問題，本發明一方面提供了一種人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，另一方面提供了上述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備和使用方法。根據本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，成本低,穩定性好,具有較高的靈敏度和準確度；根據本發明另一方面提供的上述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備和使用方法，操作簡單，步驟簡化，用時較短。
[0008]本發明一方面提供了一種人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，包括:包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板，CXCL16標準品，生物素標記抗人CXCL16抗體，鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶。
[0009]優選地，所述CXCL16標準品由重組人CXCL16製備，共6瓶，其含CXCL16的濃度範圍為0-10ng/ml ;所述生物素標記抗人CXCL16抗體的濃度125_250ng/ml。
[0010]進一步地，所述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒還包括洗滌液，稀釋液，顯色液A、顯色液B和終止液。
[0011]進一步地，所述洗滌液為含吐溫的磷酸鹽緩衝液，所述稀釋液為含BSA的磷酸鹽緩衝液，所述顯色液A為含H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩衝液，所述顯色液B為含TMB的檸檬酸緩衝液，所述終止液為1-2M的H2SO4溶液。
[0012]本發明另一方面提供了所述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，包括包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板的製備，CXCL16標準品的製備，生物素標記抗人CXCL16抗體的製備，鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶的製備。
[0013]進一步地，包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板的製備過程為:取空白酶標反應板，每孔加入100-200 μ I的羊抗人CXCL16單克隆抗體，室溫過夜孵育，棄去孔內液體，拍幹後進行封閉。
[0014]進一步地，所述封閉過程為:每孔加入250_350μ I封閉液，孵育後棄去孔內液體，
拍幹後風乾。
[0015]可選地，所述封閉過程中的孵育條件為37°C孵育2個小時或者4°C過夜孵育。
[0016]優選地，包被的所述羊抗人CXCL16單克隆抗體的濃度為667-1000ng/ml，所述封閉液為含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸鹽緩衝液。
[0017]本發明又一方面提供了一種檢測人血清中CXCL16含量的方法，使用所述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，包括以下步驟:
[0018](I)加樣:取所述CXCL16標準品分別加入所述酶標反應板，作為標準孔；所述酶標反應板上除所述標準孔外為樣品孔，所述樣品孔內依次加入所述稀釋液和檢測樣品，所述稀釋液和檢測樣品的加入量相等，且所述稀釋液和檢測樣品的加入量之和與所述CXCL16標準品的加入量相等；所述酶標反應板的加樣順序為先於所述樣品孔內加入所述稀釋液，然後於所述標準孔內加入所述標準品，最後於所述樣品孔內加入所述檢測樣品；
[0019](2)加生物素化抗體:取所述生物素標記抗人CXCL16抗體加入所述酶標反應板的標準孔和樣品孔，室溫孵育I個小時，洗板；
[0020](3)加辣根過氧化物酶:取所述鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶加入所述酶標反應板的標準孔和樣品孔，室溫孵育I個小時，洗板；
[0021](4)顯色:向所述標準孔和樣品孔中分別依次加入所述顯色液A和所述顯色液B，避光反應15-20分鐘；
[0022](5)終止:用所述終止液終止反應。
[0023]根據本申請提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒及其製備和使用方法，能夠帶來以下有益效果:本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，成本低，穩定性好，具有較高的靈敏度(靈敏度可高達0.009ng/ml)和準確度，彌補了我國國內自主研發人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的空缺，為人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的臨床應用奠定了基礎；本發明另一方面提供的上述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備和使用方法，優化了試驗條件，操作簡單，步驟簡化，用時較短，且能夠取得較好的結果，為基礎研究和臨床提供服務，有助於提聞臨床診治水平。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1示出了本發明實施例提供的使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒檢測人血清中CXCL16含量的方法的流程示意圖；
[0025]圖2示出了本發明實施例提供的使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒檢測人血清中CXCL16含量的檢測的標準曲線。

【具體實施方式】
[0026]下面參照附圖詳細介紹本發明的示例性實施例。提供這些示例性實施例的目的是為了使得本領域普通技術人員能夠清楚地理解本發明，並且根據這裡的描述能夠實現本發明。附圖和具體實施例不旨在對本發明進行限定，本發明的範圍由所附權利要求限定。
[0027]根據本發明一方面提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，包括:包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板，CXCL16標準品，生物素標記抗人CXCL16抗體，鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶。
[0028]上述酶標反應板為96孔或48孔或其他規格的酶標反應板，且優選為可靈活拆卸的酶標反應板。需要注意的是，本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒中的包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板，優選地，被裝入抽真空的不透光的錫箔紙袋子內，以延長羊抗人CXCL16單克隆抗體的活性，進而延長本試劑盒的使用壽命。
[0029]上述CXCL16標準品由重組人CXCL16製備，共6瓶，其含CXCL16的濃度範圍為
O-lOng/ml,分別為 10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml 以及 Opg/ml ;所述生物素標記抗人CXCL16抗體的濃度為125-250ng/ml，優選地，該生物素標記抗人CXCL16抗體的濃度為250ng/ml。
[0030]本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，還包括洗滌液，稀釋液，顯色液A、顯色液B和終止液。其中，上述洗滌液為ρΗ7.2-7.4的含0.05%吐溫-20 (Tween-20)的磷酸鹽緩衝液(PBS)，上述稀釋液為pH7.2-7.4的含0.1 %牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液(PBS)，顯色液A為含體積比為0.054%的H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩衝液，顯色液B為含濃度為0.48g/l的TMB的檸檬酸緩衝液，終止液為1-2M的H2SO4溶液，優選地，終止液為IM的H2SO4溶液。
[0031]需要注意的是，上述洗滌液為濃縮的洗滌液，此濃縮倍數並不局限於某一個數，可以根據試劑盒生產的需要而確定，比如可以是20倍或40倍，使用本試劑盒進行檢測時要進行相應倍數的稀釋方可使用，且稀釋前應將裝有該洗滌液的試劑瓶上下顛倒反覆混勻；上述顯色液A和顯色液B，優選地，裝入棕色試劑瓶內，且該棕色試劑瓶的瓶口處設有滴頭，通過該滴頭滴出的一滴液體的容積為50μ 1，以方便使用本試劑盒進行檢測。
[0032]根據本發明的另一方面提供了上述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，包括包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板的製備，CXCL16標準品的製備，生物素標記抗人CXCL16抗體的製備，鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶的製備。
[0033]上述包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板的製備過程為:取空白酶標反應板，每孔加入100-200 μ I的濃度為667-1000ng/ml的羊抗人CXCL16單克隆抗體，室溫過夜孵育，棄去孔內液體，拍幹後進行封閉。優選地，每孔加入150μ I的濃度為667ng/ml的羊抗人CXCL16單克隆抗體，室溫過夜孵育，棄去孔內液體，拍幹後進行封閉。
[0034]需要說明的是，此處孵育和以下所有孵育，不管孵育條件和時間是怎樣的，孵育時酶標反應板都應該蓋上蓋子或貼上封板膜，上述蓋子和封板膜的罩住酶標反應板的所有孔，以防止酶標反應板內的液體揮發或濺出；此處拍幹和以下所有拍幹，最好讓酶標反應板在不掉屑的吸水紙或棉毛巾上進行拍幹，且每次拍幹應更換乾淨的吸水紙或棉毛巾，對可拆卸的酶標反應板拍幹時注意不要使板條掉離板框，以保證使用本試劑盒檢測的準確性。
[0035]上述羊抗人CXCL16單克隆抗體也需要製備，其原濃度為100 μ g/ml，用PH7.4的
0.1M的磷酸緩衝液(PB)稀釋1:150-1:100,即稀釋到濃度為667-1000ng/ml。
[0036]上述封閉過程為:每孔加入250-350 μ I的封閉液37°C孵育2個小時或者4°C過夜孵育，優選地，每孔加入300μ I的封閉液，孵育後棄去孔內液體，拍幹後風乾備用。上述封閉液為含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸鹽緩衝液(PBS)，優選地，封閉液為含有I % BSA和5%蔗糖的0.0lM的磷酸鹽緩衝液。
[0037]需要注意的是，上述封閉液並不局限於含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸鹽緩衝液，可以是現有技術中已有的含其他成分的封閉液，比如含酪蛋白，只要是能夠對已包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板能夠起到封閉作用的溶液即可，以減少非特異性結合背景的影響。
[0038]上述CXCL16標準品的製備:以重組人CXCL16 (976-MC-025)作為標準品，原液濃度為25μ g/ml，稀釋2500倍至10ng/ml，以10ng/ml作為最高點濃度，再做2倍倍比稀釋，共稀釋4個梯度,得5ng/ml、2.5ng/ml、l.25ng/ml以及0.625ng/ml,另外取標準品稀釋液作為最低點濃度，即Ong/ml。此處標準品的稀釋液為pH7.2-7.4的含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液(PBS)。
[0039]上述生物素標記抗人CXCL16抗體的製備:以生物素化人CXCL16抗體(BAF976)作為第二抗體，將購買的CXCL16抗體濃度調製為約5mg/ml，用pH9.5的0.1M的碳酸氫鈉緩衝液透析，過夜，並於280nm處測吸光度值，計算抗體總量，將活化的生物素溶於二甲基甲醯胺(DMF)中，按照生物素與抗體的摩爾比為20:1的比例，將生物素緩慢、逐滴加入抗體溶液中，邊滴加邊攪拌，全部加入後室溫攪拌I小時，然後將反應後的液體用0.1M的磷酸鹽緩衝液於4°C透析24小時，其中換液數次，充分除去未結合的生物素，即得濃度為50 μ g/ml的生物素化的人CXCL16抗體，用pH7.2-7.4的含0.1 %牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液(PBS)稀釋 1:400-1:200，即稀釋到濃度為 125_250ng/ml。
[0040]上述鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶的製備:用含5-10% BSA的0.0lM的PBS作為稀釋液稀釋到其工作濃度，即做I: 200稀釋。該鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶購自R&D公司，貨號為DY998。
[0041]其他相關溶液的製備或配製實施例如下:
[0042](I)磷酸緩衝液(0.1M，ρΗ7.4):取500ml的ddH20(雙蒸水)加入2.96g的NaH2PO4.2H20 (磷酸二氫鈉)和29g的Na2HPO4.12H20 (磷酸氫二鈉)，充分溶解後，調pH至7.4，加ddH20定容至1L。
[0043](2)磷酸鹽緩衝液(0.1M，ρΗ7.4):取800ml的ddH20 (雙蒸水)加入2.96g的NaH2PO4.2H20(磷酸二氫鈉)、29g 的 Na2HPO4.12H20(磷酸氫二鈉)和 8.5g 的 NaCl (氯化鈉)，充分溶解後，調PH至7.4，加ddH20定容至1L。
[0044](3)封閉液:取0.1g的BSA(牛血清白蛋白)和0.5g的蔗糖溶於1ml的PBS溶液(0.1M, ρΗ7.4)。
[0045](4)顯色液A:取450ml的ddH20(雙蒸水)加入8.2g的醋酸鈉、1.58g的檸檬酸和
0.27ml的30%的H2O2，調節pH至5.3，用ddH20定容至500ml，分裝，4°C儲存。
[0046](5)顯色液B:取400ml的ddH20(雙蒸水)加入0.186g的EDTA (乙二胺四乙酸)、
0.96g的檸檬酸、0.54ml的1M的Na0H、50ml的丙三醇和0.24g的TMB-HCl (四甲基聯苯胺二鹽酸鹽)調節pH值3.0，用ddH20定容至500ml，分裝，4°C儲存，整個配製過程應注意避光。
[0047](6)終止液-M 400ml的ddH20(雙蒸水)加入13.9ml的12M的濃H2SO4,混勻，用去離子水定容至500ml，分裝4°C儲存。
[0048](7)碳酸氫鈉緩衝液(0.1M, ρΗ9.5):取8.4g的NaHCO3 (碳酸氫鈉)溶於8000ml的ddH20 (雙蒸水)，調節pH至9.5，用去離子水定容至1L。
[0049]圖1示出了本發明實施例提供的使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒檢測人血清中CXCL16含量的方法的流程示意圖。參照圖1，本發明又一方面提供了一種檢測人血清中CXCL16含量的方法，使用權利要求1至5中任一項所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，即本發明又一方面提供了一種上述人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0050](I)加樣:取上述CXCL16標準品分別加入上述酶標反應板，作為標準孔；上述酶標反應板上除上述標準孔外為樣品孔，該樣品孔內依次加入上述稀釋液和檢測樣品，該稀釋液和檢測樣品的加入量相等，且上述稀釋液和檢測樣品的加入量之和與上述CXCL16標準品的加入量相等；所述酶標反應板的加樣順序為先於所述樣品孔內加入所述稀釋液，然後於所述標準孔內加入所述標準品，最後於所述樣品孔內加入所述檢測樣品；
[0051](2)加生物素化抗體:取所述生物素標記抗人CXCL16抗體加入上述酶標反應板的標準孔和樣品孔，室溫孵育I個小時，洗板；
[0052](3)加辣根過氧化物酶:取上述鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶加入上述酶標反應板的標準孔和樣品孔，室溫孵育I個小時，洗板；
[0053](4)顯色:向上述標準孔和樣品孔中分別依次加入上述顯色液A和顯色液B，避光反應15-20分鐘；
[0054](5)終止:用上述終止液終止反應。
[0055]需要說明的是，使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒進行檢測前，應將本試劑盒的整體(包括酶標反應板和其包含的各種試劑)靜置於室溫平衡30分鐘左右，因本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的保存的優選條件為4°C，若不平衡至室溫因檢測過程中孵育條件不足對檢測結果有一定影響；上述洗板均為洗板3-5次，每次洗板將上述酶標反應板的所有孔內均加入300-350 μ I的配製好的上述洗滌液，混勻後靜置3-5分鐘，拍幹(前文已介紹)，然後進行下一次洗板。
[0056]需要注意的是，使用本試劑盒時的孵育條件並不局限於上述室溫孵育I個小時，可以是室溫孵育1-2個小時，也可以是37°C孵育0.5-1個小時，只不過室溫孵育I個小時為上述步驟(2)與步驟(3)中最優選地孵育條件，且上述步驟(2)與步驟(3)中的孵育條件也可以不一致。另外，此處的室溫和其他的室溫一般都是指25°C。
[0057]上述步驟(I)中，加入上述CXCL16標準品的量為50-200 μ 1，優選地，加入上述CXCL16標準品的量為100 μ 1，則加入上述稀釋液和檢測樣品的量均為25-ΙΟΟμ 1，優選地，加入上述稀釋液和檢測樣品的量均為50 μ I。
[0058]需要注意的是，上述步驟(I)中，樣品孔內也可以不加入上述稀釋液，即不對檢測樣品做2倍稀釋，但是這樣本底會偏高，且稀釋法比未稀釋法相比穩定性要高。另外，如果要採用未稀釋法進行使用本試劑盒，則加入上述CXCL16標準品的量與加入上述檢測樣品的量應相等。由此可知，無論是否採用稀釋法進行使用本試劑盒，原則上上述標準孔與樣品孔內的液體的量是一致的。
[0059]還需要注意的是，上述步驟⑴中的加樣順序，若採用稀釋法，則上述酶標反應板的加樣順序為先於上述樣品孔內加入上述稀釋液，然後於上述標準孔內加入上述標準品，最後於上述樣品孔內加入上述檢測樣品；若不採用稀釋法，則上述酶標反應板的加樣順序為先於上述標準孔內加入上述標準品，然後於上述樣品孔內加入上述檢測樣品。此加樣順序並不局限於此，但若採用稀釋法則必須先加入稀釋液，標準品和檢測樣品先加哪個都是可以，只不過後續的步驟要與該次序一致，這樣可以保證每個孔的反應時間是一直的，先加樣的孔也是先終止的孔，因稀釋液不與包被抗體反應所以應最先加入酶標反應板。
[0060]上述步驟(I)結束後直接進行步驟(2)，其間並不需要孵育、洗板，則為一步法，但使用本試劑盒並不局限於一步法，也可以採用傳統的兩步法，即上述步驟(I)結束後進行室溫孵育1-2個小時，洗板，拍幹，然後進行上述步驟(2)。
[0061]使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒若採用兩步法，則最長耗時為5個多小時，但5個小時的反應時間無論對於臨床推廣還是對於酶聯免疫檢測(ELISA)本身來說都顯得過長。本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒中所應用的包被抗體為單克隆抗體，生物素化抗體為多克隆抗體，只要二者識別的抗原表位不是一個，理論上就可將二抗與標本同時加入微孔，讓兩種抗體同時與標本中各自的抗原表位結合而不會產生競爭並相互影響，這樣不僅可以將反應時間縮短，也有助於降低本底、提高試劑盒檢測結果的穩定性。
[0062]綜上所述,把反應時間從「加抗原反應2小時、加抗體反應2小時、加酶反應I小時」縮短到「同時加抗原和抗體反應I小時、加酶反應I小時」的模式，經實驗發現順利顯色，且梯度與濃度變化一致，說明一步法可行，不存在抗原表位的競爭。因此決定將一步法作為使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的最為優選的使用方法，有利於將人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒推廣普及於臨床。
[0063]需要說明的是，上述步驟(4)中加入上述顯色液A和顯色液B後應混勻，再避光反應15-20分鐘；上述步驟(5)除了用上述終止液終止反應，還包括獲得檢測結果。
[0064]上述獲得檢測結果包括定性結果和定量結果，定性結果採用目測方法，分別對比樣品孔與標準孔的顏色，即可得出檢測結果，顏色越深表示含CXCL16的濃度越高；定量結果採用酶標儀測定波長450nm的吸光度，通過標準孔的吸光度的OD值和濃度繪製標準曲線，再通過樣品孔的吸光度的OD值和標準曲線得出每個樣品孔中含CXCL16的濃度值。
[0065](I)人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的部分重要條件為:用濃度為1000ng/ml的羊抗人CXCL16單克隆抗體包被，生物素標記抗人CXCL16抗體的濃度為250ng/ml ；
[0066](2)檢測樣本介紹:第I組為用於對比的乳腺癌標本8份，第2組為腫瘤轉移陽性標本16份，第3組為腫瘤轉移陰性標本8份，第4組為黃河醫院體檢對照8份；
[0067](3)加樣:取CXCL16標準品分別加入酶標反應板，每孔加入100 μ 1，作為標準孔；酶標反應板上除上述標準孔外為樣品孔，樣品孔內依次加入50 μ I的稀釋液和50 μ I的檢測樣品；
[0068](4)加生物素化抗體:取生物素標記抗人CXCL16抗體加入酶標反應板的標準孔和樣品孔，每孔加入50 μ I,封板,室溫孵育I個小時,用洗滌液洗板5次，拍幹；
[0069](5)加辣根過氧化物酶:取鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶加入酶標反應板的標準孔和樣品孔，每孔加入100μ 1，封板，室溫孵育I個小時，用洗滌液洗板5次，拍幹；
[0070](6)顯色:向標準孔和樣品孔中分別依次加入一滴顯色液A和顯色液B，避光反應15-20分鐘；
[0071](7)終止:向標準孔和樣品孔中分別加入100μ I的終止液，混勻後，用酶標儀測定波長450nm的吸光度，獲得OD值，繪製標準曲線(見圖2，X軸為標準品濃度值，Y軸為OD值)，計算並獲得檢測結果(見表1和表2)。
[0072]表1本發明實施例提供的使用本發明提供的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒檢測樣品的OD值
[0073]

【權利要求】
1.一種人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，包括:包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板，CXCL16標準品，生物素標記抗人CXCL16抗體，鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶。
2.根據權利要求1所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，其中，所述CXCL16標準品由重組人CXCL16製備，共6瓶，其含CXCL16的濃度範圍為0-10ng/ml ;所述生物素標記抗人CXCL16抗體的濃度為125-250ng/ml。
3.根據權利要求2所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，還包括洗滌液，稀釋液，顯色液A、顯色液B和終止液。
4.根據權利要求3所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，其中，所述洗滌液為含吐溫的磷酸鹽緩衝液，所述稀釋液為含BSA的磷酸鹽緩衝液，所述顯色液A為含H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩衝液，所述顯色液B為含TMB的檸檬酸緩衝液，所述終止液為1-2M的H2SO4溶液。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，包括包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板的製備，CXCL16標準品的製備，生物素標記抗人CXCL16抗體的製備，鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶的製備。
6.根據權利要求5所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，其中，包被有羊抗人CXCL16單克隆抗體的酶標反應板的製備過程為:取空白酶標反應板，每孔加入100-200 μ I的羊抗人CXCL16單克隆抗體，室溫過夜孵育，棄去孔內液體，拍幹後進行封閉。
7.根據權利要求6所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，其中，所述封閉過程為:每孔加入250-350 μ I封閉液，孵育後棄去孔內液體，拍幹後風乾。
8.根據權利要求7所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，其中，所述封閉過程中的孵育條件為37°C孵育2個小時或者4°C過夜孵育。
9.根據權利要求7或8所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒的製備方法，其中，包被的所述羊抗人CXCL16單克隆抗體的濃度為667-1000ng/ml，所述封閉液為含有BSA和蔗糖的0.0lM的磷酸鹽緩衝液。
10.一種檢測人血清中CXCL16含量的方法，使用權利要求1至5中任一項所述的人血清CXCL16酶聯免疫檢測試劑盒，包括以下步驟: (1)加樣:取所述CXCL16標準品分別加入所述酶標反應板，作為標準孔；所述酶標反應板上除所述標準孔外為樣品孔，所述樣品孔內依次加入所述稀釋液和檢測樣品，所述稀釋液和檢測樣品的加入量相等，且所述稀釋液和檢測樣品的加入量之和與所述CXCL16標準品的加入量相等；所述酶標反應板的加樣順序為先於所述樣品孔內加入所述稀釋液，然後於所述標準孔內加入所述標準品，最後於所述樣品孔內加入所述檢測樣品； (2)加生物素化抗體:取所述生物素標記抗人CXCL16抗體加入所述酶標反應板的標準孔和樣品孔，室溫孵育I個小時，洗板； (3)加辣根過氧化物酶:取所述鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶加入所述酶標反應板的標準孔和樣品孔，室溫孵育I個小時，洗板； (4)顯色:向所述標準孔和樣品孔中分別依次加入所述顯色液A和所述顯色液B，避光反應15-20分鐘； (5)終止:用所述終止液終止反應。
【文檔編號】G01N33/531GK104198728SQ201410417807
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年8月22日
【發明者】張健, 盧奕, 李會強, 黃昕, 郭宏偉, 鄒春林 申請人:廣西南寧隆吉維特生物科技有限公司