一株細黃鏈黴菌在苜蓿病害防治中的應用的製作方法

2023-05-29 17:39:06

專利名稱：：一株細黃鏈黴菌在苜蓿病害防治中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一株細黃鏈黴菌在苜蓿病害防治中的應用。
背景技術：
：植物病害生物防治強調生態系統的良性循環和環境保護，可以有效地避免化學農藥所帶來的一系列問題，由於其社會效益、生態效益、長遠利益顯著而愈來愈引起人們的重視。隨著人們對生態平衡和綠色健康概念越來越重視，生物防治措施在農業生產中得到了前所未有的關注。進入21世紀以來，各國政府和民眾更加重視生物農藥的開發和應用，生物農藥在整個農藥市場的份額正在逐年上升。放線菌是最早應用到生產中的生防微生物，其重要經濟價值是由於它們所產生的抗生素能有效地防治人類和動物的傳染性病害，特別是細菌性的病害以及農作物的某些病害，其在植物病害生物防治中發揮了巨大的作用。目前從微生物中發現的大約8000種生物活性物質中，有近70%是放線菌產生的。在環境汙染日益嚴重的今天，生物防治是農業發展的必由之路，利用放線菌的次生代謝產物一抗生素製備的新農藥，由於其具有無汙染、無殘留、可再生、易於產業化、成本低等特點已成為無公害農藥的主體和未來農藥的發展方向。苜蓿是最重要的豆科牧草，被譽為「牧草之王」，目前我國的苜蓿種植面積居各種牧草之首。近幾年來，隨著我國草地畜牧業的發展和農業產業結構調整，苜蓿的種植面積進一步擴大，病害問題日益突出。病害使苜蓿產量大輻度減少，牧草營養成分降低，嚴重影響苜蓿的產量和飼用價值。苜蓿霜黴病、白粉病、褐斑病等是當前苜蓿生產上危害較大的幾種病害，導致苜蓿減產嚴重時甚至絕收。當前國內外從抗病育種、化學防治和農業措施等方面做了大量工作，防病效果不甚理想。並且由於苜蓿作為飼草的特殊性及經濟、環境和食品安全等因素，在其生育期使用化學農藥有著嚴格的限制。生物防治在苜蓿病害的可持續發管理中同樣具有非常廣闊的應用前景，因此開發利用拮抗菌是有效控制苜蓿病害最具發展潛力的防治措施之一。
發明內容本發明的一個目的是提供細黃鏈黴菌(Sti^ptomycesmicroflavus)NMG2-4-8的用途。本發明所提供的用途為細黃鏈黴菌(Str印tomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442在生物防治苜蓿病害中的應用。上述應用中，所述苜蓿病害是苜蓿霜黴病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄黴葉斑病或苜蓿根腐病。上述應用中，所述苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis引起的，所述苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani引起的。本發明的另一個目的是提供一種用於生物防治苜蓿病害的菌劑。本發明所提供的用於生物防治苜蓿病害的菌劑，其活性成分為細黃鏈黴菌(Streptomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442或發酵細黃鏈黴菌(Sti^ptomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442得到的發酵液。上述菌劑中，所述苜蓿病害是苜蓿霜黴病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄黴葉斑病或苜蓿根腐病。上述菌劑中，所述苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis引起的，所述苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani引起的。細黃鏈黴菌(Sti^ptomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442在製備用於生物防治苜蓿病害的菌劑中的應用也屬於本發明的保護範圍。上述應用中，所述苜蓿病害是苜蓿霜黴病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄黴葉斑病或苜蓿根腐病。上述應用中，所述苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis引起的，所述苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani引起的。本發明首次從苜蓿健株根際土壤中分離篩選到的一株細黃鏈黴菌Streptomycesmicroflavus,實驗證明，該細黃鏈黴菌Streptomycesmicroflavus有顯著拮抗作用，抗菌譜廣。該細黃鏈黴菌Str印tomycesmicroflavus對苜蓿霜黴病等農作物病原菌有很強的抑制作用，如對苜蓿霜黴病、白粉病、褐斑病、匍柄黴葉斑病、根腐病等顯示出很好的防病效果，說明該菌株在苜蓿病害的生物防治領域將有廣闊的應用前景。圖1為NMG2-4-8氣生菌絲形態(光學顯微鏡下200X)。圖2為菌株NMG2-4-8孢子形態(掃描電鏡下5000X)。圖3為菌株NMG2-4-8孢子絲形態(掃描電鏡下10000X)。圖4為依據16SrDNA基因序列構建的菌株NMG2-4-8的系統發育樹。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、菌株的分離及鑑定一、分離供試土樣採自內蒙古通遼地區2-3年生苜蓿健株根際土壤。供試菌株由中國農業科學院草原研究所牧草病害防治組提供；培養基①種子培養基每升水含5g蛋白腖，3g酵母膏，2g葡萄糖，Ig牛肉膏，PH7.07.2；②基礎發酵培養基每升水含25g大豆粉，40g澱粉，0.8g(NH4)2S04，3gCaCO3,2gNaCl,PH7·07·2。土壤樣品稀釋液製備土壤樣品採自內蒙古通遼地區2-3年生苜蓿健株根際土壤。採樣時，除去地表植物殘體，用自製土壤採樣器採集115cm處的土壤樣品，放入滅菌的特製鋁製皿內。土樣經自然風乾，過篩，稱重，稱取土樣10g，放入IOOmL無菌水中，於120r/min搖床上震蕩30min。靜置取上清液100μL加入900μL無菌水，系列梯度稀釋，製備成不同濃度(10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6)的土壤樣品稀釋液。菌株的分離、純化採用稀釋平板分離法分離得到放線菌菌株。用移液器吸取不同濃度的稀釋液均勻塗布接種於高氏一號培養基(可溶性澱粉20g、瓊脂20g、KN03lg、K2HPO4O.5g、MgSO4·7H200.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H200.Olg、蒸溜水1000mL、pH7.27.4)平板表面，每濃度3次重複，置於28°C的培養箱中培養510d，觀察菌落生長情況。挑取單菌落進行稀釋劃線分離培養、純化。經純化後的放線菌按常規方法在高氏一號培養基上繁殖保存。將分離到的放線菌接種於高氏一號瓊脂平板內，28°C下培養5d後待用。將9種細菌和18種植物病原真菌(見表8)接種於牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基(牛肉膏3g、蛋白腖10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL、pH7.2)、PDA瓊脂培養基(馬鈴薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸餾水1000mL、pH自然)平板表面，真菌25°C培養3_5d，細菌28°C培養2d待用。採用平板對峙法對供試放線菌進行菌體抑菌活性的初篩。將培養好的放線菌用滅菌打孔器取直徑5mm的的菌碟置於PDA平板中間，3d後將同樣大小苜蓿匍柄黴菌Stemphylliumbotryosum菌餅對峙接於放線菌周邊，25°C下培養5d，定期觀察、記錄抑菌結果，並測量抑(溶)菌圈的直徑。根據抑(溶)菌圈直徑的大小從中篩選出具有最大抑菌活性的強拮抗菌株。結果共得到15株對苜蓿匍柄黴菌Stemphylliumbotryosum抑菌作用較強的拮抗放線菌菌株，其中一株名稱為NMG2-4-8的菌株抑菌效果最好，其抑菌圈直徑為35.52mm。二、鑑定(一)菌株培養特徵形態特徵觀察將待鑑定的菌株NMG2-4-8作插片培養，將所觀察到的形態結果顯微照相。培養特徵觀察將待鑑定的菌株，分別接種在高氏一號、察氏、葡萄糖-天冬素、克氏一號、馬鈴薯浸汁、葡萄糖酵母膏瓊脂斜面上及馬鈴薯塊培養基上，置於28°C培養，分別在7、14及28d觀察其培養特徵和顏色變化。取穩定成熟的顏色特徵作為其培養特徵，作為鑑定種的依據。觀察記載氣生菌絲的顏色、基質絲體的顏色和可溶性色素的顏色。結果記入鑑定表。此外，觀察菌株的生長狀況，如生長好壞，氣生菌絲呈現何等外貌_絨狀、粉狀或絮狀等作為參考特徵。(二)菌種生理生化特性明膠液化能力測定將菌株接種於柱形明膠培養基表面，22°C下恆溫培養，分別在5、10、20、及30d，各觀察一次液化程度。觀察前應將菌種管冷凍2030min。如明膠不液化仍是固體狀態，若呈現液體即為液化。牛奶凝固與腖化測定將待測定菌株接種於脫脂牛奶中，28°C恆溫培養，分別在第3、6、10、20、及30d各觀察1次。澱粉水解測定將培養基溶化後，冷卻至50°C倒成平板，凝固後將菌種點種於平板上，適溫培養2-4d，形成菌苔後在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為宜，平板呈藍色，而菌落周圍有無透明圈出現說明澱粉是否被水解，透明圈的大小能夠說明水解澱粉能力的大小。纖維素水解試驗配製適合放線菌生長而不含碳源的合成基礎培養液，分裝試管後，以新華一號濾紙作纖維素(碳源)，把它切成寬1cm、長6cm濾紙條，加入試管中，一半浸在液內，一半露在液外，將鑑定菌株接種在液外一段濾紙條上，置28°C恆溫培養30d後觀察。若該菌能將濾紙條分解成一團鬆散的纖維，或使之折斷，碎裂成質狀者為陽性，說明該菌株產生纖維素酶使之水解。反之，濾紙無變化者為陰性。硫化氫產生試驗將待測菌株接種到含檸檬酸鐵的有機斜面上，置28°C培養IOd左右(視菌苔生長成熟為宜)觀察結果。若培養基中出現黑褐色沉澱，表示實驗為陽性。反之，不變色者為陰性。碳源利用試驗將待鑑定菌株的孢子懸浮液12滴，接種在無碳源培養基上，用無菌塗布棒塗布均勻，然後劃線挖溝，以溝為界，把平板培養基分成若干小區，每小區分別加入一種碳源。常用的碳源有9種阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、果糖、蔗糖、山梨糖、甘露醇和肌醇等。每皿需設無糖對照區。置28°C恆溫培養7、14d後，分別觀察記載生長利用情況。(三)菌種細胞壁化學組分的鑑定紙層層析法細胞壁胺基酸分析根據G+細菌細胞壁肽聚糖分子中第3位胺基酸的種類，將放線菌劃分為九個類群如表1。表1放線菌細胞壁的主要類型~細胞壁類型主要組成代表屬LL-DAP,甘氨酸鏈黴菌屬StreptomycesIImeso-DAP,甘氨酸小單孢菌屬MfcrcwowosporaIIImeso-DAP馬杜拉菌屬Jrtiwowai^raIVmeso-DAP,阿拉伯糖，半乳糖諾卡氏菌屬TVoran^V賴氨酸，鳥氨酸放線菌屬VI賴氨酸，天門冬氨酸厄氏菌屬OerAoWaW1，4-二羥基丁酸，天門冬氨酸壤黴菌屬XgmmycesW賴氨酸兩歧桿菌屬Bifidobacterium_K_meso-DAP,多種胺基酸_枝動菌屬Mycoplana_注LL-DAP外消旋二胺基酸基庚二酸；meso-DAP內消旋二氨基庚二酸；DAB:1，4_二羥基丁酸。主要步驟為(1)菌體製備刮取培養好的菌株放入1.5mL的離心管中；(2)菌體水解在用於全細胞胺基酸分析的菌體中加入6mol/L的HCl100μL，放入滅菌鍋中120°C15min；(3)點樣取4μL用於胺基酸分析的水解液於新華1號濾紙上點樣，再分別取標準胺基酸樣品二氨基庚二酸DAP(含有LL-DAP，Meso-DAP和DD-DAP)、賴氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、穀氨酸、丙氨酸各1μL依次在濾紙上間隔點樣。(4)展層用於全細胞胺基酸水解液分析的展層系統為甲醇水HCl(6Ν)吡啶=165.20.82，展層2次；(5)顯色胺基酸分析用0.4%茚三酮丙酮溶液，100-110°C加熱23min，觀察。紙層層析法全細胞壁糖分分析根據放線菌細胞壁的化學組分和全細胞水解液糖型，將放線菌劃分為4個糖型見表2。表2放線菌全細胞的主要糖型tableseeoriginaldocumentpage7主要步驟為(1)菌體製備刮取培養好的菌株放入1.5mL的離心管中；(2)菌體水解菌體中加入0.25mol/L的HC1100μL，放入滅菌鍋中120°C15min；(3)點樣取4μL用於胺基酸分析的水解液於新華1號濾紙上點樣，再分別取標準糖樣品木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、核糖各IyL依次在濾紙上間隔點樣。(4)展層用於全細胞胺基酸水解液分析的展層系統為正丁醇水吡啶甲醇=10661，展層2次；(5)顯色顯色劑鄰苯二甲酸苯胺水飽和的正丁醇(3.252100)，120°C加熱3min。(四)菌株16SrDNA基因序列及系統發育學分析DNA膜板的製備DNA提取純化後的拮抗放線菌株NMG2-4-8接種於高氏一號培養皿中，28°C培養至生長中期，備用。提取的主要步驟如下(1)皿內刮取少量菌體，加60yL2XCATB緩衝液，冰浴研缽中研磨至漿液，移入1.5mL離心管中(每菌做3管)。(2)加500μL溶菌酶處理液(溶菌酶2mg/mL，RNase溶液50μg/mL,蔗糖0·3M，Tris-HCl1M,pH8.0)置於37°C保溫2h。(3)加入250UL20%SDS溶液，震蕩混合。(4)551保溫60111土11。(5)加等體積的酚氯仿異戊醇(25241)充分搖勻，4°CTris-HClΙΜ,ρΗ8.0下離心(8000r/min,5min)。(6)取上清液移至另一離心管中，加10%NaAC液，2.5倍體積冰凍乙醇沉澱。(7)4°C離心(10，000r/min，5min)，棄上清液。(8)重複步驟(5)(7)1次。(9)用70%乙醇洗23次，晾乾，加TE緩衝液60μL，充分溶解後取3μL檢測並-20°C下保存。PCR擴增16SrDNA(I)PCR儀型號ALD-1244、rev、C.B(2)擴增引物16SrDNA通用引物(50μM)正向Pf為5『-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3『(對應於Ε.coli827位鹼基)，反向Pr為5『-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3『(對應於E.colil4921514位鹼基)，由中國科學院微生物研究所基因工程中心合成。(3)擴增體系表316SrDNAPCR擴增體系tableseeoriginaldocumentpage8注25μL體系PCR擴增參數及程序按擴增體系(表3)依次加入各組分，瞬時離心混勻，加入Taq酶後瞬時離心混勻。95°C預變性5min，進入循環94°C變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸2min。35個循環後，72°C延伸lOmin。擴增產物_20°C儲存。PGR擴增產物的電泳檢查電泳條件為0.8%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/mL),IXTAE電泳緩衝液，80V電壓電泳40min，PCR產物上樣量為4μL，與2μL上樣緩衝液混勻後點樣。在254nm紫外下觀察結果，以TaKaRa公司DNAMarker[DL2000]為核酸標準分子量參照物，確定擴增片段長度。擴增產物帶應在標準物1500bp左右位置上。16SrDNAPCR產物全序列測定PCR產物的純化與序列測定由上海英駿生物技術有限公司進行。測序時以擴增引物作為正反向引物，由上海英駿生物技術有限公司用計算機引物設計軟體，根據所測出的樣品的序列搜索設計出中間弓丨物併合成。系統進化樹的構建將所測的16SrDNA序列與GenBank基因庫中已測定的原核生物的16SrDNA序列進行比較，調出與其序列同源性較高的菌株的16SrDNA序列。採用CLUSTALX1.8軟體對所測定的同源序列進行多匹配排列，通過Treeview軟體進行系統進化樹的構建。結果(一)形態特徵菌株NMG2-4-8菌落呈灰色絨粉狀，乾燥，基絲暗黃，經插片培養在光學顯微鏡下觀察到NMG2-4-8的氣生菌絲較長，多分枝，見圖1；孢子卵圓形至柱形，孢子直或彎曲或呈螺旋形螺旋形，見圖2、圖3，有典型的鏈黴菌屬的特徵。(二)培養特徵NMG2-4-8在各種培養基上的特徵如表4，可見該菌在不同的培養基上的培養性狀明顯不同在高氏一號瓊脂上氣生菌絲為瓜瓢粉，基絲暗黃，無可溶性色素；克氏一號瓊脂上氣生菌絲為落英粉，基絲瓜瓢粉；察氏瓊脂氣生菌絲為灰白，基絲灰白；葡萄糖天門冬素瓊脂上氣生菌絲為豆汁黃，基絲北瓜黃；葡萄糖酵母膏瓊脂上氣生菌絲為蛋殼黃，基絲淺芒果棕；馬鈴薯浸汁瓊脂氣生菌絲為落英粉，基絲鹿角棕；馬鈴薯塊氣生菌絲為落英粉。NMG2-4-8在以上所有供試培養基上均不產生可溶性色素。表4菌株NMG2-4-8的培養特徵tableseeoriginaldocumentpage9(三)生理生化特徵菌株NMG2-4-8液化明膠能力差，IOd能使牛奶凝固，不能使其腖化，能使澱粉水解，纖維素上不生長(不利用纖維素)，不產生H2S,能利用阿拉伯糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、甘露醇和肌醇。(四)菌株細胞壁化學組分分析1、紙層層析法細胞壁胺基酸分析結果對菌株NMG2-4-8進行紙層層析法細胞壁胺基酸分析，結果見下表表5菌株NMG2-4-8全細胞胺基酸分析結果tableseeoriginaldocumentpage92、紙層層析法全細胞壁糖分分析結果對菌株NMG2-4-8進行紙層層析法全細胞壁糖分分析，結果見下表表6菌株NMG2-4-8全細胞壁糖份分析結果tableseeoriginaldocumentpage10綜合表5、表6結果可知菌株NMG2-4-8細胞中含有胺基酸的種類為LL_DAP、甘氨酸和穀氨酸，對照文中表1可知該菌株細胞壁屬於I型，屬於鏈黴菌屬；菌株NMG2-4-8細胞中除含有葡萄糖外不含有表2中其它糖的種類，該菌株糖型為C型。(五)rDNA系統進化分析16SrDNA鹼基序列測定結果如序列表中序列1所示，共測定菌株NMG2-4-8的16SrDNA1422個有效鹼基。系統發育樹構建選取11株模式菌株進行系統發育分析，所用鏈黴菌屬菌株的16SrDNA序列登陸號列於表7，構建的系統發育樹見圖4所示。表7構建系統發育樹所用的Sti^ptomyces16SrDNAGenBank登陸號tableseeoriginaldocumentpage10由表7可以看出與供試菌株同源性較高的菌株均為鏈黴菌屬，並且多數都為細黃鏈黴菌S.microflavus,可得知菌株NMG2-4-8屬於鏈黴菌屬Str印tomyces，另外該菌株在系統發育樹上與細黃鏈黴菌S.microflavusEU570571為獨立一分支，親緣關係最近，相似性達99.9%。由於供試菌株與細黃鏈黴菌的生理生化特徵(在高氏一號瓊脂上孢子絲規則螺旋形，氣生菌絲粉紅微紫，基絲暗黃，無可溶性色素，抑制陽性或陰性細菌以及酵母和絲狀真菌，明膠液化快，澱粉水解，纖維素上生長不穩定)比較相似。因此，結合分子生物學鑑定結果，將菌株NMG2-4-8鑑定為細黃鏈黴菌Sti^ptomycesmicroflavus。該菌株已於2009年11月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.3442。該菌株的分類命名為細黃鏈黴菌(Sti^ptomycesmicroflavus)，菌株名稱為NMG2-4-8。三、培養高氏一號瓊脂培養基瓊脂15g，可溶性澱粉20g，NaCl0.5g，KNO3Ig,K2HPO4·3Η200·5g,MgSO4·7H200.5g,FeSO4·7H200.Olg,蒸餾水IOOOmL,pH7.27.4。種子培養基蛋白腖5g、酵母膏3g、葡萄糖2g、牛肉膏lg、蒸餾水lOOOmL，pH7.O7.2；發酵培養基黃豆粉20g、澱粉5g、葡萄糖20g、蛋白腖2g、酵母膏5g、NaC15g、K2HPO4O.5g、MgSO4·7H200.5g、CaC032g、蒸餾水IOOOmL,pH7.5。蛋白腖購自內蒙古鴻之惠商貿有限公司，產品目錄號為SHOOlO；酵母膏購自內蒙古鴻之惠商貿有限公司，產品目錄號為SH0348；黃豆粉購自超市。將菌株NMG2-4-8接種於高氏一號斜面上，在28°C培養5_6d；從生長好的放線菌斜面用無菌接種環挑取23環接種於IOOmL種子培養基中，28°C、220r/min搖床振蕩培養48h，得到種子培養液；按10%(ν/ν)的接種量將種子培養液接種於發酵培養基中，裝液量為三角瓶容積的l/5，220r/min、28°C振蕩培養120h，得到發酵液，此時菌株已在發酵液中產生高濃度的抑菌活性代謝產物；將得到的發酵液5000r/min離心lOmin，取上清液置於4°C備用，將此上清液記作無菌發酵濾液。實施例2、菌株的抗菌譜測定採用杯碟法對菌株NMG2-4-8進行抗菌譜測定。將滅菌牛津杯放入混好靶標菌的PDA平板中央(平板製備方法將ImL無菌水加入各靶標菌培養試管中，用接種環將菌落、菌絲體或孢子刮下製成菌懸液與PDA培養基IOmL混合後倒入9cm的培養皿中製成平板)，杯中加入200μL無菌發酵濾液，分別置25°C培養4-5d(真菌)、28°C培養2d(細菌)，至靶標菌長滿培養皿為止。採用十字交叉法測量抑菌(溶菌)圈的直徑。每種靶標菌重複3次，結果取平均值。PDA瓊脂培養基馬鈴薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸餾水1000mL、pH自然。結果如表8，菌株NMG2-4-8對馬鈴薯環腐棒桿菌、金黃色葡萄球菌等4種革蘭氏陽性細菌，胡蘿蔔軟腐歐文氏菌、青枯雷爾氏菌等5種革蘭氏陰性細菌及油菜菌核病菌、黃瓜枯萎病菌、苜蓿茄鐮孢菌、苜蓿匍柄黴、禾頂囊殼、稻瘟病菌、番茄灰黴菌、假絲酵母番、擴展青黴等18種真菌具有明顯的抑制作用。證明菌株NMG2-4-8的抑菌譜廣。表8-1菌株NMG2-4-8的抗菌譜測定結果①cdJIcdJHy·Λ&sJJ4W①dEcdoscduoEoll+Jucdxg·ζτ__gsjjg13IJl^n。IJAd麵堪■膨__gc.Qg__麵H-l駕許fe鵝_H.oco__5sdg0^錄傲塵截__8寸__mnJT3sm!13HOSTgJUC^S-PH麵遲長_^#-ΙΟΛΟΡΟ,ΙΟ·Μσ3>,ΙΟΛΟΡΟ,Ιοcd-f"fMfHMLQS__^gj麵痺聯__3__麵遲-KiMg^./-概琨gLO.LOgnmsc^Jpoq曰口二^旨200墀解鵝____T3JJS。13qΘΑΙ:Ρ3ΜΘΙΙΙυο麵親擔醫遲川掩sJUJEcdfHMsQoAEouucdEnQcdc)^;礦Οε·9ζsnQJQosn^mocdg麵H-l^3i揪^塑9CΖ__φφSn二二。__Lo寸.S__S=CqnSsn二P13m麵農痺肽艴踅LOLOoco__Ummsnumln^d0SS__g二Co__SgJmjSn880^ndlns麵散癖解如賦斕sJUJMcdoJPQEcdJJO+Ja①ssnoJUOPQaQsdsqnssJSUQucdMJLPJEJ0:pcdqJA.cdH3S·8Ζ__麵堪題-4-a痺44岷鵝_9LO__^isfffOZ.Sg__JgIOS麵逛劃踅-N___T3JJS。13qaAssodluo麵親擔Β\Ε川掩(i)(i)朗_畫麵恁_ι朗_畫麵恁_tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16害發生現狀及防治對策[J].內蒙古草業，1994，3:4-8.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿殼針孢葉斑病菌S印toriamedicaginis(侯天爵.我國苜蓿病害發生現狀及防治對策[J].內蒙古草業，1994，3:4-8.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum(侯天爵.我國苜蓿病害發生現狀及防治對策[J].內蒙古草業，1994，3:4-8.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿尖鐮孢菌Fusariumoxysporum(曹麗霞，趙存虎，白全江，等.內蒙古中部地區苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].華北農學報，2008，23(6)105-107.)(由中國農業科學院草原研究所提供)。苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani(曹麗霞，趙存虎，白全江，等.內蒙古中部地區苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].華北農學報，2008，23(6):105-107.)(由中國農業科學院草原研究所提供)實施例3、菌株NMG2-4-8的溫室生物防治植物病害實驗(中苜1號)種子購自國家種質牧草中期庫，產品目錄號為00068。苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis(侯天爵.我國北方草地病害調查及主要病害防治[J].中國草地，1993，3:56-60.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni(侯天爵.我國苜蓿病害發生現狀及防治對策[J].內蒙古草業，1994，34-8.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis(侯天爵.我國北方草地病害調查及主要病害防治[J].中國草地，1993，3:56-60.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum(侯天爵.我國苜蓿病害發生現狀及防治對策[J].內蒙古草業，1994，3:4-8.)(由中國農業科學院草原研究所提供)苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani(徐林波，狄彩霞，王蘭英；等.十種藥劑對苜蓿茄鐮孢菌的室內毒力測定[A].成卓敏.糧食安全與植保科技創新.糧食安全與植保科技創新-中國植物保護學會2009年學術年會論文集[C].北京中國農業科學技術出版社，2009,804-807.)(由中國農業科學院草原研究所提供)下述實驗中所用的NMG2-4-8發酵液均是按照實施例1中實驗三中方法製備得到。一、對苜蓿霜黴病的防治效果採用室內苗期噴霧接種法對NMG2-4-8進行霜黴病防治試驗。苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引發的，採自中國農業科學院草原研究所沙爾沁試驗站感病苜蓿植株。(一)保護作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗的4片真葉充分展開時進行噴藥處理，正常管理48h，再接病原菌，接菌後黑暗保溼24h，進入常規管理。常規管理7-10d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和保護效果。(二)治療作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗的4片真葉充分展開時接病原菌，接菌後黑暗保溼24h，以誘導孢子囊產生，然後噴施藥劑處理，再保溼24h後，進入常規管理。常規管理7-10d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和治療效果。(三)具體操作1、盆栽育苗播種基質為土壤(經高溫乾熱滅菌)、草炭和蛭石的混合物(體積比為111)。供試苜蓿種子經0.1%新潔爾滅溶液消毒3min後，用清水衝洗乾淨，放入墊有紗布的培養皿中，然後置於25°C的培養箱中發芽，待胚根長到0.5cm時，將其播於裝有上述基質的育苗盆內(育苗盆事先經0.1%的甲醛溶液密封燻蒸消毒)。18-20°C溫室內育苗，每盆保留4株苜蓿幼苗。2、接種方法取感染蓿霜黴病菌Peronosporaaestivalis的苜蓿植株的枝條，在室內先將病葉背面的黴層用毛筆輕輕刷去後，置於18-20°C、相對溼度彡97%條件下黑暗保溼培養24h，待長出新鮮孢子囊後，將其刷入蒸餾水中，製備成孢子囊懸浮液，濃度以在低倍顯微鏡下檢查平均每視野內有2030個孢子囊為宜。用小型手持噴霧器進行噴霧接種，接種部位為葉片，接種量將菌液均勻噴施於苜蓿葉片正反兩向，以葉面溼潤而不滴為度。3、施藥方法試驗設NMG2-4-8發酵液20、10、5倍稀釋液3個處理，以2%農抗-120水劑200倍稀釋液為農藥對照(均用清水進行稀釋)，以清水為空白對照，每處理重複5次。使用手持型噴霧器將藥液均勻噴施於苜蓿葉片正反兩向，以葉面溼潤而不滴為度。4、黑暗處理用牛皮紙袋罩上盆栽苜蓿苗。5、保溼處理用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。病情分級標準0級無病斑；1級每個葉片中病斑總面積小於葉片總面積的1/3；2級每個葉片中病斑總面積佔葉面積的1/32/3；3級每個葉片中病斑總面積大於葉片總面積的2/3。病情指數=Σ(各級病葉數χ各級代表級值)■(葉片總數X最高代表級值)保護效果⑶=對照病1指數；』理病情指數_%(對照指清水對照)對照病情指數病指增長率(%)=後疲I·射旨數-處■前病t青指數、,100,處理後病情指數治療效果⑷=對照病指二二g指增長率_%(對照指清水對照)病情指數中，各級代表級值指0、1、2、3；最高代表級值指3。實驗結果如表9所示。結果NMG2-4-83個濃度梯度的發酵液對苜蓿霜黴病的保護效果都很明顯。其中5倍稀釋液的保護效果為88.69%，優於農抗120的效果86.97%,10倍、20倍稀釋液的保護效果分別為77.00%,63.06%；治療作用效果亦顯著，但均低於農抗-120的防效。表9NMG2-4-8發酵液對苜蓿霜黴病的防治效果tableseeoriginaldocumentpage19二、對苜蓿白粉病的防治效果採用室內苗期噴霧接種法對NMG2-4-8進行防治苜蓿白粉病試驗。苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的。(一)保護作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培養3-4周時進行噴藥處理，正常管理24h，再接病原菌，接菌後黑暗保溼24h，進入常規管理。常規管理7-10d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和保護效果。(二)治療作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培養3-4周時接種病原菌，接菌後黑暗保溼24h，然後噴施藥劑處理，再保溼24h後，進入常規管理。常規管理7-10d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和治療效果。(三)具體操作1、盆栽育苗方法與實驗一中所述相同。2、接種方法採用傳統的抖粉法接種苜蓿白粉病菌(方中達.植病研究方法[M].北京中國農業出版社，1998366-368.)。將已感染苜蓿白粉病菌Erysiphepolygoni並發病的苜蓿葉片上的白粉菌分生孢子輕輕地抖落在被接種的苜蓿幼苗葉片上。3、施藥方法試驗設NMG2-4-8發酵液20、10、5倍稀釋液、2%農抗-120水劑200倍稀釋液以及清水對照共5個處理，每處理重複5次。使用手持型噴霧器將藥液均勻噴施於苜蓿葉片正反兩向，以葉面溼潤而不滴為度。4、黑暗處理用牛皮紙袋罩上盆栽苜蓿苗。5、保溼處理用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。病情分級標準0級無病症；1級每個葉片中病斑總面積佔葉面積的1/3以下，白粉模糊不清；2級每個葉片中病斑總面積佔葉面積的1/32/3，白粉較為明顯；3級每個葉片中病斑總面積佔葉面積的2/3以上，白粉層較厚、連片。病情指數、病指增長率、防治效果的計算公式如實驗一所述。實驗結果如表10所示。結果不同濃度的NMG2-4-8發酵液對苜蓿白粉病有較好的保護效果，使用5倍稀釋液，保護效果達90.81%，顯著優於2%農抗-120水劑200倍液對苜蓿白粉病的保護效果。使用10倍稀釋液，保護效果達80.44%，與2%農抗-120水劑200倍液的防效相當。NMG2-4-8發酵液對苜蓿白粉病的治療作用較好，使用濃度為5倍時，治療效果為69.69%，優於農抗-120的防效61.36%。表10NMG2-4-8發酵液對苜蓿白粉病的盆栽試驗效果tableseeoriginaldocumentpage20三、對苜蓿褐斑病的防治效果採用室內苗期噴霧接種法對NMG2-4-8進行防治苜蓿褐斑病試驗。苜蓿褐斑病是由苜猜假盤菌Pseudopezizamedicaginis弓|起的。(一)保護作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培養3-4周時進行噴藥處理，正常管理24h，再接病原菌，接菌後黑暗保溼24h，進入常規管理。常規管理10-15d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和保護效果。(二)治療作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培養3-4周時接種病原菌，接菌後黑暗保溼24h，然後噴施藥劑處理，再保溼24h後，進入常規管理。常規管理10-15d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和治療效果。(三)具體操作1、盆栽育苗方法與實驗一中所述相同。2、接種方法用Tween-20洗去苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis子囊孢子，將子囊孢子製成懸浮液，濃度為IO5IO6個子囊孢子/mL。將配製好的孢子懸浮液用喉頭噴霧器均勻地噴灑在苜蓿植株上，以葉面溼潤而不滴為度。接種後用塑料罩將供試材料密封，保持相對溼度100%，溫度20-25°C。保溼48h後撤掉塑料罩，在溫室內進行常規管理。3、施藥方法試驗設NMG2-4-8發酵液20、10、5倍稀釋液3個處理，以2%農抗-120水劑200倍稀釋液為農藥對照(均用清水進行稀釋)，以清水為空白對照，每處理重複5次。使用手持型噴霧器將藥液均勻噴施於苜蓿葉片正反兩向，以葉面溼潤而不滴為度。4、黑暗處理用牛皮紙袋罩上盆栽苜蓿苗。5、保溼處理用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。病情分級標準根據病斑覆蓋葉面積的百分率進行分級0級無症狀表現；1每個葉片中病斑總面積為葉面積的5%或以下；2每個葉片中病斑總面積為葉面積的6%15%，病斑部位褪綠；3每個葉片中病斑總面積為葉面積的16%35%，3/4葉片開始褪綠；4每個葉片中病斑總面積為葉面積的36%50%，葉片幾乎全部變黃；5每個葉片中病斑總面積為葉面積的51%70%，葉片全部褪綠；6每個葉片中病斑總面積為葉面積的70%以上或全部枯死。病情指數、病指增長率、防治效果的計算公式如實驗一所述。實驗結果如表11所示。結果不同濃度的NMG2-4-8發酵液對苜蓿褐斑病有較好的保護效果，使用5倍稀釋液，保護效果達80.22%，與2%農抗-120水劑200倍液對苜蓿褐斑病的保護效果81.99%接近。使用10倍稀釋液，保護效果為66.47%，使用20倍稀釋液，保護效果為43.15%，均低於2%農抗-120水劑200倍液的保護效果。NMG2-4-8發酵液對苜蓿褐斑病的治療作用不明顯，使用濃度為5倍稀釋液時，防效僅為58.88%。表11、NMG2-4-8發酵液對苜蓿褐斑病的盆栽試驗效果tableseeoriginaldocumentpage21注*表示效果很差或無效果。四、對苜蓿匍柄黴葉斑病的防治效果採用室內苗期噴霧接種法對NMG2-4-8進行防治苜蓿匍柄黴葉斑病試驗。苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的。(一)保護作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培養3-4周時進行噴藥處理，24h後再接病原菌，接菌後黑暗保溼24h，進入常規管理。常規管理1012d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和保護效果。(二)治療作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培養3-4周時接種病原菌，接菌後黑暗保溼24h，然後噴施藥劑處理，再保溼24h後，進入常規管理。常規管理1012d後，調查發病情祝、分級記載、計算病情指數和治療效果。(三)具體操作1、盆栽育苗方法與實驗一中所述相同。2、接種方法用Tween-20洗去苜蓿匍柄黴Stemphylliumbotryosum的分生孢子，將分生孢子用於製備懸浮液，濃度為IO5106cfu/mL。採用葉片噴霧的方法通過手持型噴霧器進行接種，以葉面溼潤而不滴為度。接種後用塑料罩將供試材料密封，保持相對溼度100%,溫度20-23°C、保溼48h後撤掉塑料罩，將植株移入背光處，讓葉片自然風乾。在溫室內進行常規管理。3、施藥方法試驗設NMG2-4-8發酵液20、10、5倍稀釋液3個處理，以2%農抗-120水劑200倍稀釋液為農藥對照(均用清水進行稀釋)，以清水為空白對照，每處理重複5次。使用手持型噴霧器將藥液均勻噴施於苜蓿葉片正反兩向，以葉面溼潤而不滴為度。4、黑暗處理用牛皮紙袋罩上盆栽苜蓿苗。5、保溼處理用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。病情分級標準0級植株健康，無病斑出現。1級每個葉片1個病斑、病斑總面積佔葉面積5%以下。2級每個葉片1-3個病斑、病斑總面積佔葉面積6%-20%且葉片開始褪綠。3級每個葉片3-10個病斑、病斑總面積佔葉面積21%-50%、病斑壞死且葉片發黃。4級每個葉片10個以上病斑、病斑總面積佔葉面積50%以上且葉片發黃脫落。病情指數、病指增長率、防治效果的計算公式如實驗一所述。實驗結果如表12所示。結果不同濃度NMG2-4-8發酵液對苜蓿匍柄黴葉斑病兼有良好的保護和治療作用。使用5倍稀釋液，保護效果達80.35%，略低於2%農抗-120水劑200倍液對苜蓿匍柄黴葉斑病的保護效果85.32%。使用10、20倍倍稀釋液，保護效果分別為72.00%,59.96%。且NMG2-4-8發酵液的治療效果較好，明顯優於上述3種病害，使用濃度為5倍稀釋液時，防效達73.02%。表12NMG2-4-8發酵液對苜蓿匍柄黴葉斑病的盆栽試驗效果tableseeoriginaldocumentpage22五、對苜蓿根腐病的防治效果採用室內苗期灌根接種法對NMG2-4-8進行防治苜蓿根腐病試驗。苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani引起的。(一)保護作用培育苜蓿種子得到苜蓿幼苗，取定植後3周的盆栽苜蓿苗，先灌根接種菌株NMG2-4-8不同濃度發酵液和2%農抗-120水劑200倍稀釋液(農藥對照)，以接種清水為空白對照；施藥3d後，再灌根接種苜蓿茄鐮孢根腐病菌。常規管理20d後，調查發病情祝、分級記載，計算病情指數和治療效果。(二)具體操作1、盆栽育苗方法與實驗一中所述相同。2、接種方法採將指示菌株苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani用燕麥片培養基於28°C恆溫培養箱中培養5-6d，菌絲長滿培養基後，光_暗交替培養7d,用無菌水洗下分生孢子，加入0.02%Tween-20，經細菌過濾器無菌過濾除去菌絲，製成濃度為106Cfu/mL的孢子懸浮液。灌根接種，每株苜蓿苗接種IOmL孢子懸浮液。3、施藥方法試驗設NMG2-4-8發酵液20、10、5倍稀釋液3個處理，以2%農抗-120水劑200倍稀釋液為農藥對照(均用清水進行稀釋)，以清水為空白對照，每處理重複5次。將不同濃度菌株NMG2-4-8的發酵濾液灌於苜蓿幼苗根部，每株10mL。3d後將苜蓿茄鐮孢根腐病菌灌根接種，每株苜蓿苗接種IOmL孢子懸浮液。病情分級標準0級-健株，表觀無症狀；1級-根莖或主根局部有病斑，但不連片；2級_主根、側根及根莖部有病斑且連片，但不超過1/3；3級-1/31/2根及根莖部被侵染變色，且側根明顯減少；4級_根及根莖部變色、局部腐爛、維管束明顯變褐、植株生長受抑制且矮小枯黃；5級_根部腐爛、維管束變黑且植株萎蔫死亡。formulaseeoriginaldocumentpage23實驗結果(表13)表明，供試拮抗菌NMG2-4-8的發酵液可以顯著降低苜蓿根腐病的發病，使用5倍稀釋液，相對防效達90.80%,略高於2%農抗-120水劑200倍液的處理防效87.75%。處理後苜蓿植株長勢明顯優於對照，拮抗菌NMG2-4-8表現出的促生作用在一定程度上對病害的危害有補償作用。在盆栽試驗中，拮抗菌能夠有效減輕病情，顯示出較為理想的應用潛力。表13、NMG2-4-8發酵液對苜蓿根腐病的盆栽試驗效果tableseeoriginaldocumentpage23權利要求細黃鏈黴菌(Streptomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442在生物防治苜蓿病害中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述苜蓿病害是苜蓿霜黴病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄黴葉斑病或苜蓿根腐病。3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis引起的，所述苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani弓|起的。4.一種用於生物防治苜蓿病害的菌劑，其活性成分為細黃鏈黴菌(Streptomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442或發酵細黃鏈黴菌(Str印tomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442得到的發酵液。5.根據權利要求4所述的菌劑，其特徵在於所述苜蓿病害是苜蓿霜黴病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄黴葉斑病或苜蓿根腐病。6.根據權利要求4或5所述的菌劑，其特徵在於所述苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis引起的，所述苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani弓|起的。7.細黃鏈黴菌(Str印tomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442在製備用於生物防治苜蓿病害的菌劑中的應用。8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述苜蓿病害是苜蓿霜黴病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄黴葉斑病或苜蓿根腐病。9.根據權利要求7或8所述的應用，其特徵在於所述苜蓿霜黴病是由苜蓿霜黴菌Personsporaaestivalis引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌Erysiphepolygoni引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌Pseudopezizamedicaginis引起的，所述苜蓿匍柄黴葉斑病是由苜蓿匍柄黴Stemphyliumbotryosum引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄鐮孢菌Fusariumsolani弓|起的。全文摘要本發明公開了及一株細黃鏈黴菌在苜蓿病害防治中的應用。該應用具體是細黃鏈黴菌(Streptomycesmicroflavus)NMG2-4-8CGMCCNo.3442在生物防治苜蓿病害中的應用。本發明首次從苜蓿根際土壤中分離篩選到的一株細黃鏈黴菌Streptomycesmicroflavus，實驗證明，該細黃鏈黴菌Streptomycesmicroflavus有顯著拮抗作用，抗菌譜廣。該細黃鏈黴菌Streptomycesmicroflavus對苜蓿霜黴病等農作物病原菌有很強的抑制作用，如對苜蓿霜黴病、白粉病、褐斑病、匍柄黴葉斑病、根腐病等顯示出很好的防病效果，說明該菌株在苜蓿病害的生物防治領域將有廣闊的應用前景。文檔編號A01N63/00GK101822273SQ20101015552公開日2010年9月8日申請日期2010年4月21日優先權日2010年4月21日發明者烏蘭巴特爾,塔娜,孫娟娟,徐林波,戴雅婷,李薇,李鵬,狄彩霞,王蘭英,石雅琴,趙海霞,閆志堅,韓紅巖申請人:中國農業科學院草原研究所