一種應用幹細胞自身特性製備牙髓幹細胞的方法與流程
2023-05-29 17:34:36
本發明涉及一種牙髓幹細胞的製備方法，具體涉及一種應用幹細胞自身特性製備牙髓幹細胞的方法。
背景技術：
幹細胞是未充分分化的細胞，具有自我更新與分化為特定組織器官的能力。牙髓幹細胞(dentalpulpstemcells，dpscs)又稱牙髓間充質幹細胞，是指牙髓內可以快速增殖並且具有一定克隆形成能力的牙髓細胞，由gronthos等於2000年首次提出，它具有與骨髓間充質幹細胞相似的免疫表型。
牙髓幹細胞具有來源豐富、採集方便、免疫原性低、無倫理爭議等優點。因此，牙髓幹細胞在再生醫學和組織工程修復中有著廣泛的應用前景。牙髓幹細胞在牙周組織缺損、牙周炎、牙髓組織再生中顯示出較強的優勢。大規模培養穩定可靠的dpscs已成為一種趨勢。
以往dpscs增殖能力較一般，nelsonf.lizier等發表的文獻「scaling-upofdentalpulpstemcellsisolatedfrommultipleniches」（文獻來源：plosone.2017;7(6)），其記載了p3代最高培養出1.8*108個。
對幹細胞表面的分子標記進行確認是分離鑑定幹細胞常用的手段，目前發現dpscs表達中胚層標記物stro-1和cd146。stro-1是間充質幹細胞（mesenchymalstemcells,mscs）的早期細胞標誌分子之一，能夠鑑定dpscs的未分化狀態。farzanehaghajani等發表的文獻「comparativeimmunophenotypiccharacteristics,proliferativefeatures,andosteogenicdifferentiationofstemcellsisolatedfromhumanpermanentanddeciduousteethwithbonemarrow」（文獻來源：molbiotechnol(2016)58:415–427），其記載了dpscs的表面標誌stro-1表面標誌一般＜5%。
技術實現要素：
本發明的目的是提供製備牙髓幹細胞的方法，該方法縮短了原代培養的時間，而且增殖能力強，製備的牙髓幹細胞具有很好的幹細胞特徵，分化潛力強。
為了達到上述目的，本發明提供了一種應用幹細胞自身特性製備牙髓幹細胞的方法，該方法包含：
步驟1：選取牙齒樣本，破牙冠，從牙齒樣本的髓腔中抽取牙髓，使用緩衝溶液洗滌牙髓，將牙髓分成若干小塊，放入離心管內；
步驟2：配製消化液，該消化液包含：氯化鈉注射液、膠原酶ⅰ、分散酶ⅱ（dispaseⅱ）、白蛋白、鎂鹽和鈣鹽，將該消化液加入步驟1中的離心管內，將離心管密封，混合均勻後在37℃下消化；
步驟3：待離心管內的小塊鬆散後，對離心管表面滅菌處理，加入消化終止液，終止消化；
步驟4：將步驟3得到的溶液進行離心，去除上清液，在底部的沉澱加入msc原代培養基，使沉澱重懸後轉移至培養瓶中，在5%co2，37℃下，進行原代培養；
步驟5：當細胞融合度達到80%-90%時，收集上清液，並進行超濾，收集上層濾網中的幹細胞提取液，將該幹細胞提取液加入到msc原代培養基中，得到傳代培養基；
步驟6：將步驟5中下層沉澱的細胞接種到培養瓶中，待細胞融合度達到80%-90%時，將培養瓶內的培養基移出備用，用磷酸鹽緩衝液衝洗培養瓶，在培養瓶中加入稀釋的胰酶，將胰酶平鋪於培養瓶底部，進行胰酶消化，消化時間不超過1min，加入上述備用的培養基終止消化；稀釋的胰酶為濃度為0.025%的胰酶；
步驟7：將步驟6消化得到的液體離心，底部沉澱的細胞加入到步驟5得到的傳代培養基中，混合均勻，按1×102/cm2的細胞密度進行種瓶，在5%co2，37℃的條件下進行傳代培養；
步驟8：重複上述步驟6和7，進行若干次傳代培養；
步驟9：將細胞凍存液置於凍存管中，在4℃下進行預冷，凍存管中加入步驟8細胞擴大培養得到的幹細胞傳代培養基，細胞密度為1.5×106~2×106/1.5ml/管，逐漸降溫至-80℃，24h之後將凍存的細胞放入-196℃的液氮罐中保存。
其中，所述的msc原代培養基中包含：生長因子。
優選地，在步驟1中，所述的緩衝溶液包含：0.9%氯化鈉注射液、10,000units/ml青黴素和10,000μg/ml鏈黴素。
其中，所述的氯化鈉注射液：青黴素：鏈黴素的體積比為198:1:1。
優選地，在步驟2中，所述的鎂鹽包含：氯化鎂；所述的鈣鹽包含：氯化鈣。
其中，所述的消化液中各組分的濃度為：0.9%氯化鈉注射液、3%膠原酶ⅰ、4%分散酶ⅱ、1mol/l氯化鎂、200mg/ml氯化鈣和20%白蛋白。
其中，所述的0.9%氯化鈉注射液：1mol/l氯化鎂：200mg/ml氯化鈣：20%白蛋白的體積比為1ml：5μl：5μl：100μl；
其中，所述的3%膠原酶ⅰ的生物活性為270u/mg；
其中，所述的4%分散酶ⅱ的生物活性為0.85u/mg。
優選地，在步驟3中，所述的終止液包含：0.9%氯化鈉注射液和20%白蛋白，所述的0.9%氯化鈉注射液：20%白蛋白的體積比為9：1。
優選地，在步驟4中，所述的msc原代培養基包含：人類間充質幹細胞無血清基礎培養基、基質細胞衍生因子和l-穀氨醯胺。
其中，所述的生長因子包含：成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、表皮生長因子和血管內皮生長因子。
其中，所述的人類間充質幹細胞無血清基礎培養基的體積：肝細胞生長因子的質量：表皮生長因子的質量：血管內皮生長因子的質量：基質細胞衍生因子的質量：l-穀氨醯胺的體積=100ml：1μg：2μg：2μg：2μg：100μl。
其中，所述的成纖維細胞生長因子的含量為100iu/ml。
優選地，在步驟4中，所述的培養瓶為經過處理的培養瓶，處理方法為：將貼壁試劑因子和磷酸鹽緩衝液以體積比10μl：1ml混合重懸後，加入培養瓶中，並搖晃培養瓶使貼壁試劑因子完全覆蓋住培養瓶底部。
優選地，在步驟5中，所述的幹細胞提取液：msc原代培養基的體積比為1：50。
優選地，在步驟6中，所述的0.025%的胰酶為0.25%胰酶和磷酸鹽緩衝液以體積為1：9配製得到。
優選地，在步驟9中，降溫速度為1℃/min；所述的細胞凍存液為無動物源血清的凍存液。
優選地，在步驟1中，在選取牙齒樣本之前，用保存液將牙齒樣本保存，並對牙齒樣本進行篩選。
其中，所述的保存液包含：0.9%氯化鈉注射液、青鏈黴素和白蛋白，所述的0.9%氯化鈉注射液：青鏈黴素：白蛋白的體積比為100ml：1ml：2ml。
其中，所述的青鏈黴素包含：10,000u/ml青黴素，10,000μg/ml鏈黴素。
其中，進行牙齒樣本篩選時，同時具備以下條件：
包含B肝、C肝、梅毒、愛滋、cmv、ebv和htlv病毒中的任意一種或兩種以上檢測為陰性；牙齒未發炎；非自然脫落的牙齒。
本發明的應用幹細胞自身特性製備牙髓幹細胞的方法，具有以下優點：
（1）本發明的方法在原代培養第2-3天即可觀察到有貼壁細胞長出，第一次貼壁細胞出現時間短；
（2）本發明的方法在原代培養第7-10天，細胞融合度能夠達到80%以上，可進行傳代操作，極大的減少原代培養時間；
（3）本發明的方法利用細胞貼壁試劑促進幹細胞貼壁生長，利用幹細胞本身的特性在低密度種瓶下進行篩選具有極強增殖能力的牙髓幹細胞，利用多種細胞因子聯合本身細胞分泌的提取物進行培養，使得細胞數目比其他方法製備的細胞數目擴增了十幾倍，本發明可使細胞數在p3代達到2*109個；
（4）本發明的方法製備的牙髓幹細胞具有很好的幹細胞特性，其間充質幹細胞的陽性指標cd73、cd90、cd105均＞95%，其間充質幹細胞的陰性指標cd34、cd31、cd45、hla-dr均＜2%；
（5）本發明的方法製備的牙髓幹細胞具有很好的分化潛能，其p3代細胞表面標誌stro-1＞20%；
（6）本發明的方法製備的牙髓幹細胞具有很好的免疫抑制活性，具有幹細胞的特性。
附圖說明
圖1為牙髓幹細胞培養第3天的細胞狀態圖。
圖2為牙髓幹細胞培養第9天的細胞狀態圖。
圖3為牙髓幹細胞傳代後的細胞狀態圖（細胞融合度已經達到80%）。
圖4為牙髓幹細胞的細胞生長曲線圖。
圖5為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd31的檢測圖。
圖6為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd34的檢測圖。
圖7為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd45的檢測圖。
圖8為本發明的牙髓幹細胞表面抗原hla-dr的檢測圖。
圖9為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd73的檢測圖。
圖10為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd90的檢測圖。
圖11為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd105的檢測圖。
圖12為本發明的牙髓幹細胞表面抗原stro-1的檢測圖。
圖13為牙髓間充質幹細胞抑制免疫細胞能力的結果圖（a為顯微細胞圖，b為免疫活性細胞統計圖）。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本發明的技術方案做進一步的說明。
實施例1
一、牙齒樣本的保存
配置牙齒樣本保存液，該保存液的組份包含：0.9%（質量分數）氯化鈉注射液100ml、1ml青鏈黴素和2ml白蛋白，1ml青鏈黴素（gibco®，貨號15140-122）中含有10，000單位的青黴素（鹼）（penicillin）和10，000μg的鏈黴素（鹼）（streptomycin），將牙齒樣本保存在上述保存液中，保存溫度為2℃-20℃。上述白蛋白為20%（質量分數）的人血清白蛋白（購自：山西康寶生物製品股份有限公司，10g/50ml/20%/瓶）
二、牙齒樣本的篩選
對牙齒樣本的要求，具體如下：
（1）B肝、C肝、梅毒、愛滋、cmv、ebv、htlv病毒檢測為陰性，其檢測方法為本領域的常規檢測方法，如B肝hbv-dna檢測方法、C型肝炎病毒抗體檢測等；
（2）牙齒未發炎；
（3）排除成人及兒童自然脫落的牙齒，自然脫落的牙齒牙髓組織完全萎縮，不能進行培養；兒童拔除的乳牙、正畸牙，成人拔除的智齒可以採用，還可採用未侵襲牙髓組織的輕度蛀牙。
三、牙齒樣本的運輸
運輸條件為：在2-8℃下，12h內運送至實驗室。
四、牙髓幹細胞的製備方法
1、培養瓶
人類間充質幹細胞促貼壁試劑（bioind公司，產品規格：05-752-1f）50μl+5ml磷酸鹽緩衝液（phosphatebuffersaline，pbs）重懸後，加入到t75培養瓶中，搖晃培養瓶使貼壁試劑完全覆蓋住培養瓶底部，置於37℃培養箱中待用。上述磷酸鹽緩衝液的ph值為7.4。
2、msc原代培養基的配製
人類間充質幹細胞無血清基礎培養基（bioind公司，產品規格：05-200-1a）500ml+bfgf（鹼性成纖維細胞生長因子）50000iu（internationalunit，生物效價的國際單位）+hgf（肝細胞生長因子）5μg+egf（表皮生長因子）10μg+vegf（血管內皮生長因子）10μg+sdf-1（基質細胞衍生因子）10μg+l-穀氨醯胺500μl。
上述各因子的介紹，具體如下：
（1）bfgf（鹼性成纖維細胞生長因子）：bfgf（basicfibroblastgrowthfactor）是成纖維細胞生長因子家族的一個成員。已有證據表明：bfgf可以支持未分化的人類胚胎幹細胞的幹細胞特性，也能夠刺激中胚層來源的細胞，以及神經外胚層、外胚層和內胚層來源細胞的增殖。在體外，bfgf對內皮細胞具有趨化和促進有絲分裂的作用，並且能夠促進神經的分化、存活和再生。它已被證明在調節胚胎發育和分化中至關重要，它可能在血管生成，組織修復，胚胎發育，以及神經元功能的體內的調製中發揮作用。
（2）hgf（肝細胞生長因子）：hgf（hepatocytegrowthfactor）是一種多肽生長因子，具有促進包括肝細胞、上皮細胞、內皮細胞、造血細胞等多種類型細胞的生長、遷移和形態發生的作用。
（3）egf（表皮生長因子）：egf（epidermalgrowthfactor）是一種多功能的生長因子，在體內體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。egf同應答細胞表面的特異受體結合，促進受體二聚化並使細胞質位點磷酸化。被激活的受體至少可與5種具有不同信號序列的蛋白結合，進行信號轉導，在翻譯水平上對蛋白質的合成起調節作用。此外egf可提高細胞內dna拓撲異構酶活性，也可促進一些與增殖有關的基因表達，如myc基因（一組癌基因）、fos基因（原癌基因）等。
（4）vegf（血管內皮生長因子）：vegf（vascularendothelialgrowthfactor）早期亦稱作血管通透因子(vascularpermeabilityfactor,vpf)，是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子(heparin-bindinggrowthfactor,hbgf)，可在體內誘導血管新生。
（5）sdf-1（基質細胞衍生因子）：sdf-1（stromalcell-derivedfactor1）又稱趨化因子cxcl12，對淋巴細胞有強烈的趨化作用並在發育中起重要作用，在胚胎發育中引導造血幹細胞從胎兒肝臟到骨髓的遷徙。
（6）l-穀氨醯胺：l-穀氨醯胺在細胞培養時十分重要。脫掉氨基後，l-穀氨醯胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。l-穀氨醯胺在溶液中經過一段時間後會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定，其降解會導致氨的形成，而氨對於一些細胞具有毒性。
3、應用幹細胞自身特性製備牙髓幹細胞的方法，具體包含：
步驟1：選取牙齒樣本，破牙冠，從牙齒樣本的髓腔中抽取牙髓，使用緩衝溶液洗滌牙髓，將牙髓分成若干小塊，放入15ml離心管內；上述緩衝液的組份包含：0.9%（質量分數）氯化鈉注射液495ml+10,000u/ml（units/ml）青黴素2.5ml+10,000μg/ml鏈黴素2.5ml；
步驟2：配製消化液，該消化液包含：0.9%（質量分數）氯化鈉注射液2ml、3%（質量分數）膠原酶ⅰ270u/mg、4%（質量分數）分散酶ⅱ（dispaseⅱ）0.85u/mg（units/mg）、20%（質量分數）白蛋白200μl、1mol/l氯化鎂10μl、200mg/ml氯化鈣10μl，將2ml消化液加入步驟1中的15ml離心管內，左右搖晃使組織塊分散均勻，擰緊管蓋，用封口膜封嚴，貼好標籤，搖晃混合後放入37℃恆溫水浴槽中，每分鐘取出離心管搖晃一次，使組織與消化液充分混勻，消化15min；上述白蛋白為20%（質量分數）的人血清白蛋白（購自：山西康寶生物製品股份有限公司，10g/50ml/20%/瓶）；
步驟3：待離心管內的小塊被消化鬆散後，對離心管表面滅菌處理，加入消化終止液至14ml終止消化，用槍頭吹打懸浮液，使細胞與組織儘可能脫離；上述消化終止液包含0.9%（質量分數）氯化鈉注射液和20%（質量分數）白蛋白，0.9%氯化鈉注射液：20%白蛋白體積比為9：1；
步驟4：將步驟3得到的溶液在1200rpm轉速下離心10min，去除上清液，在底部的沉澱中加入msc原代培養基10ml中，用槍頭吹打，使沉澱重懸後轉移至75cm2培養瓶中，利用細胞貼壁試劑進行包被促進幹細胞貼壁生長，原代培養條件為5%co2（空氣：co2的體積比為95：5），37℃；在培養的第7天向75cm2培養瓶中補加5mlmsc原代培養基；
步驟5：當細胞融合度達到80%-90%時，收集上清液，使用50ml超濾管進行超濾，在12000rpm轉速下離心10min，收集上層濾網中的幹細胞提取液，將該幹細胞提取液加入到msc原代培養基中，上述幹細胞提取液：msc原代培養基的體積比為1：50，得到傳代培養基，多餘的提取物需放置-20℃冰箱中；
步驟6：將步驟5中下層沉澱的細胞接種到培養瓶中，待細胞融合度達到80%-90%時（細胞鋪滿培養瓶底部80%～90%面積），將培養瓶內的培養基移出備用，移液管吸取pbs衝洗培養瓶底部，衝洗完後將pbs吸出移入廢液缸中，在培養瓶中加入稀釋的胰酶，將胰酶平鋪於培養瓶底部，進行胰酶消化，消化時間不超過1min，加入上述備用的培養基終止消化；稀釋的胰酶為0.25%（質量分數）胰酶：pbs體積比為1:9的胰酶；
步驟7：將步驟6消化得到的液體離心，底部沉澱的細胞加入到步驟5得到的傳代培養基中，混合均勻，利用幹細胞本身的特性在低密度種瓶下進行篩選具有極強增殖能力的牙髓幹細胞，按1×102/cm2的細胞密度進行種瓶，在培養瓶上標明傳代時間、代次、樣本編號，在5%co2，37℃的條件下進行傳代培養；
步驟8：重複上述步驟6和7，進行若干次傳代培養；
步驟9：將細胞凍存液置於凍存管中，在4℃下進行預冷，凍存管中加入步驟8細胞擴大培養得到的幹細胞傳代培養基，細胞密度為1.5×106~2×106/1.5ml/管，細胞存活率＞95%，以1℃/min的速度降溫至-80℃，24h之後將凍存的細胞放入-196℃的液氮罐中保存。上述細胞凍存液為無動物源血清的凍存液（bioind公司，產品規格：05-712-1e）。
在上述步驟9中，採用本領域常規方法，如臺盼藍染色和鏡檢法確定細胞存活率，細胞存活率＞95%為凍存標準。
在上述方法中，在msc原代培養基中加入牙髓幹細胞的提取液作為傳代培養的培養基（步驟5），一般培養細胞都需要添加細胞因子，常規的做法為人為地添加某些已知的人工合成的細胞因子，而本發明的方法則是利用幹細胞自身強大的分泌能力，在培養過程中幹細胞會分泌出各種細胞因子以及某些元素到培養基中，作為細胞傳代時的營養成分。
在上述方法中，在低密度下接種（步驟7），用比現有技術培養密度低100倍的情況下，篩選出增殖能力超強並且具有較強的獨立生存能力的幹細胞。幹細胞相對比其他成體細胞增殖能力旺盛，幹細胞往往在極低的密度下也能生長。牙髓組織通過貼壁消化方法獲得的細胞仍然存在不同細胞亞群，它們的功能和生長特點有些差異，其中有些亞群細胞對培養環境有較大的適應性和具有較強的獨立生存能力，細胞集落率高，因此通過低密度接種篩選出這些增殖和生存能力強的細胞。
五、牙髓幹細胞的檢測
1、牙髓幹細胞的生長狀態的檢測
採用本領域常規方法在顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，觀察到原代培養第2-3天即可觀察到有貼壁細胞長出，第一次貼壁細胞出現時間短。而且，原代培養第7-10天細胞融合度已經達到80%，即可進行傳代操作，第一次傳代時間短，極大的減少原代培養時間。
如圖1所示，為牙髓幹細胞培養第3天的細胞狀態圖，如圖2所示，為牙髓幹細胞培養第9天的細胞狀態圖，如圖3所示，為牙髓幹細胞傳代後的細胞狀態圖（細胞融合度已經達到80%），從圖1、2和3可以看出，第3天時細胞形態大部分呈梭形，密度小，第9天時細胞集落明顯增大，細胞生長密度增加，排列方向不一致，隨著培養時間越長，細胞在培養基上的面積越來越大，達到80%時基本鋪滿了整個培養基，呈旋渦狀排列，細胞均一性好、細胞狀態佳。
採用本領域常規方法測定細胞的生長曲線，如mtt法（檢測細胞存活和生長的方法）。如圖4所示，為牙髓幹細胞的細胞生長曲線圖（p0為原代），在經過第2次傳代（p2）培養後，細胞的數目急劇增加，從第1次傳代（p1）約為8*107的細胞數目在p2後增加到接近8*108的細胞數目，到第3次傳代（p3）時，細胞數目已經接近2*109，擴增倍數接近50倍，而「scaling-upofdentalpulpstemcellsisolatedfrommultipleniches」（plosone.2012;7(6)）中p3代細胞數目為1.8*108個。因此，表明本發明的製備方法能夠使細胞生長狀態好，增殖能力強，能夠大量擴增。
2、牙髓幹細胞的表面抗原檢測
採用本領域常規檢測方法（如流式細胞儀檢測）對p3代牙髓幹細胞的表面抗原cd31、cd34、cd45、hla-dr、cd73、cd90、cd105和stro-1進行檢測。
cd31又稱血小板-內皮細胞粘附分子，屬於免疫球蛋白超家族成員；cd34是i型跨膜糖蛋白，cd34在原始細胞分化為成熟細胞後表達下降；cd45又稱白細胞共同抗原，可表達於成熟紅細胞、血小板表面；hla-dr是人類白細胞抗原dr；cd73又稱為胞外5核苷酸酶，是糖基磷脂醯肌醇(gpi)錨定於細胞膜外表面的一種糖蛋白；cd90（又稱thy-1）與細胞的黏附、分化、細胞間相互作用有關，是人類微血管內皮細胞活化的標記；cd105又稱內皮素，是轉化生長因子β超家族的成員；stro-1是骨髓基質幹細胞和幼紅細胞前體細胞表達的細胞表面蛋白，對於stro-1陽性的細胞，其成纖維細胞克隆形成單位顯著增加，能夠分化形成多向間質細胞系。
在mscs表面不表達cd31、cd34、cd45和hla-dr，表達cd73、cd90、cd105和stro-1。
如圖5所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd31的檢測圖，cd31的表達比例為0.60%；如圖6所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd34的檢測圖，cd34的表達比例為0.94%；如圖7所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd45的檢測圖，cd45的表達比例為0.47%；如圖8所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原hla-dr的檢測圖，hla-dr的表達比例為1.10%；如圖9所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd73的檢測圖，cd73的表達比例為99.2%；如圖10所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd90的檢測圖，cd90的表達比例為97.2%；如圖11所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原cd105的檢測圖，cd105的表達比例為99.6%；如圖12所示，為本發明的牙髓幹細胞表面抗原stro-1的檢測圖，stro-1的表達比例為27.0%。
通過上述檢測結果可以看出，間充質幹細胞的陽性指標cd73、cd90、cd105均＞95%，其間充質幹細胞的陰性指標cd34、cd31、cd45、hla-dr均＜2%。因此，本發明培養的細胞符合人間充質幹細胞的表面分子的特性。
本發明培養的p3代細胞表面標誌stro-1＞20%，「proliferativefeatures,andosteogenicdifferentiationofstemcellsisolatedfromhumanpermanentanddeciduousteethwithbonemarrow」（molbiotechnol,2016,58:415-427）記載了dpsc中p2、p3代細胞表面標誌stro-1＜5%，「人牙周韌帶細胞和牙髓細胞表型特徵的比較」（華西口腔醫學雜質，第27卷第1期2009年2月）記載了dpsc中p3代細胞表面標誌stro-1＜20%。因此，本發明培養的細胞的分化能力高，具有乾性細胞的特性。
3、牙髓幹細胞的免疫抑制活性的檢測
mscs不僅具有多種分化潛能，而且還具有免疫調節能力和低免疫原性，其能夠抑制t細胞的增殖，還對其他免疫細胞具有廣泛的調節作用，如其可以抑制nk介導的殺傷作用。
本發明通過流式細胞儀（flowcytometry）分析沒有被激活的人外周血單個核細胞（notactivated-humanpmbc）、被激活的人外周血單個核細胞（activated-humanpmbc）和激活的人外周血單個核細胞+p3代牙髓間充質幹細胞（activated-humanpmbc+dpsc-p3）的免疫抑制活性（immunesuppressionactivity），如圖13所示，為牙髓間充質幹細胞抑制免疫細胞能力的結果圖，a為顯微細胞圖，b為免疫活性細胞統計圖，發現被激活的人外周血單個核細胞中具有免疫活性的細胞的百分比接近零，被激活的人外周血單個核細胞中幾乎90%的細胞具有免疫活性，但是激活的人外周血單個核細胞+p3代牙髓間充質幹細胞中具有免疫活性的細胞數目急劇下降，僅不到40%的細胞具有免疫活性。因此，表明dpsc具有顯著的抑制免疫活性的作用，證明了本發明製備的dpsc細胞具有很好幹細胞的特性。
4、凍存細胞復甦活率
採用常規檢測方法，凍存後細胞復甦活率根據凍存時間長短略有不同，檢測凍存1年的細胞的復甦活率，其復甦活率大於90%。
本發明的方法能夠用於構建牙髓幹細胞工作庫。使用該方法可生產出大量同批次的細胞樣本，按照1*106/kg的幹細胞用量，僅一顆牙齒就可為50kg的人治療200次以上，為大規模生產可臨床化使用的牙髓幹細胞提供了新方法。
綜上所述，本發明的應用幹細胞自身特性製備牙髓幹細胞的方法，該方法縮短了原代培養的時間，而且增殖能力強，製備的牙髓幹細胞具有很好的幹細胞特徵，分化潛力強。
儘管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細介紹，但應當認識到上述的描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容後，對於本發明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發明的保護範圍應由所附的權利要求來限定。