一種芡歐鼠尾草的組織培養方法

2023-05-29 18:33:16 1

專利名稱：一種芡歐鼠尾草的組織培養方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，涉及植物組織培養技術，具體地說是一種芡歐鼠尾草的組織 培養方法。背錄技術芡歐鼠尾草(w/vtoW伊fl"fca丄)屬唇形科鼠尾草屬夏季一年生草本植物，原產墨西哥及 中美地區。商業栽培主要分布於墨西哥、阿根廷、比利時、美國、哥倫比亞、玻利維亞、秘 魯等地區。芡歐鼠尾草在美洲大陸已有漫長的種植歷史，早在哥倫布時代前的中美，人們就 發現並在一定程度上了解了這種植物。營養價值很高的芡歐鼠尾草種子在人類生存和發展過 程中發揮了重要的作用。幾個世紀前在美洲許多地區芡歐鼠尾草種子因具有髙能量、高耐餓 的特點而成為首要的食物來源，使傳統穀物失色不少。種子中提取的油也有很多用處，而且 芡歐鼠尾草的各個部分都是古代阿茲特克人和瑪雅人醫療食譜的成分。西班牙殖民者徵服美 洲後，芡歐鼠尾草被查禁，為外來作物所取代。近代以來，芡歐鼠尾草只被很少一部分人種 植和食用。最近，被忽視的芡歐鼠尾草種子作為一種重新發現的食物，因其具有富含omega-3 脂肪酸和抗氧化劑等優點被廣泛關注。目前，芡歐鼠尾草種子作為一種富含omega-3脂肪酸、改善糖尿病和心血管疾病的功能 性食品，在美洲、歐洲的許多超市和健康食品商店都有售。在加利福尼亞南部，用它做的面 包已經成為一種流行商品。由於芡歐鼠尾草種子具有非常強的吸水性，這使它成為一種非常理想的瘦身食品，避免 了一般減肥時的飢餓感和頭昏、噁心等現象。目前作為減肥食品在日本非常流行，在我國也 有少數人在食用。在飼料中添加芡歐鼠尾草種子，可以提高飼料的營養價值。在加拿大和美國，通過在飼 料中添加芡歐鼠尾草種子，生產出了富含omega-3的雞蛋，現在已經進入市場，並且銷售量逐 年增長。試驗還表明，肉雞食用含芡歐鼠尾草種子的飼料後，雞肉中a-亞麻酸的含量和亞油 酸含量得到提高，油酸含量相應減少，營養比更趨合理。美洲土著人用芡歐鼠尾草種子作成糊狀藥裔，用來消炎、除體臭，具有良好的效果。 近年來，功能性食品和保健食品越來越受到人們的親睞。芡歐鼠尾草種子除提供基本營養外，還能預防和治療疾病、促進健康，是一種理想的功能性食品，具有很大的市場潛力。用其飼 養動物或直接加入食物中使產品富含omega-3脂肪酸，也具有很好的前景。在我國還未發現有 芡歐鼠尾草的商業栽培，尚未得到充分的開發及利用。 組織培養已在科學研究和生產上開闢了令人振奮的多個新領域，成為舉世矚目的生物技 術之一，尤其是在醫藥領域通過誘導愈傷組織分離提取生化物質。從藥物學角度來說芡歐鼠 尾草是很有誘惑力的一個物種，因此筆者對芡歐鼠尾草作為一種藥用植物進行了組織培養的 試驗研究，可為今後的藥物資源的開發和利用提供有用的基礎資料。這種繁殖方式為芡歐鼠 尾草產業化的發展開拓了一條有效途徑，其經濟效益和社會效益是巨大的。此外，組織培養 技術結合轉基因技術，可以提髙芡歐鼠尾草抗旱抗寒能力，改善芡歐鼠尾草油的質量，從而 降低生產成本，提高經濟效益。目前，鼠尾草組織培養己有少量報導，王宗霞等通過頂芽培 養獲得了藍花鼠尾草(Salvia farinaeea. Benth)的再生植株(內蒙古科技與經濟，2003, 9), 沙紅等通過莖培養獲得了藥用鼠尾草(SalaviaofJ icinal'is I .)的再生植株(新疆農業大 學學報2006， 29(4)),但對焚歐鼠尾草的組織培養未曾報導過。發明內容本發明的目的是提供一種高效的芡歐鼠尾草組織培養方法，為芡歐鼠尾草規模化快繁和 遺傳轉化體系的建立奠定基礎。本發明的目的是通下述方式實現的芡歐鼠尾草種子經消毒處理，接種在1/2MS+6-BA5. 0 10. 0mg/L+ NAAO. 5 1. 0 rag/L 愈傷組織誘導培養基上，3天後種子開始發芽，繼續培養14 16天，葉片邊緣開始形成 愈傷組織，同時從兩片子葉中間產生叢生的不定芽；不定芽長大切下再放在 1/2MS+NAA0. 2 0. 5mg/L生根培養基上，長出根系得到再生苗。本發明的發明人經過大量的實驗研究，根據葉片再生原理，以種子為外植體，建立了一 種髙頻穩定再生體系。本發明採用固體培養方法，提供了一種芡歐鼠尾草離體快繁的方法， 是在MS培養基培養芡歐鼠尾草種子，發芽後繼續培養一段時間，直接長出愈傷組織，同時 分化出叢生芽，最後上形成完整植株，得到芡歐鼠尾草無性系。本發明操作簡便，勞動量少 勞動強度小，接種量大的特點，其發展前景十分看好。本發明所述的一種芡歐鼠尾草組織培養方法，其具體操作步驟如下1、 外植體的消毒和廢液處理選用芡歐鼠尾草種子為外植體，用常規方法消毒，在無菌 操作臺上用70。/n酒精處理30秒，再用0.1。/。的升汞消毒1(K12分鐘，最後用無菌水衝洗5~6次， 熒歐鼠尾草種子具有非常強的吸水性，消毒處理後的酒精、升汞水和無菌水用1000ul移液槍 吸出2、 接種方法和愈傷組織、不定芽誘導芡歐鼠尾草種子很小，用鑷子夾取一粒種子很困 難，用1000ul移液槍吸取種子，接種在l/2MS + 6-BA5.(K10.0mg/L + NAA0.5 1.0mg/L愈傷 組織誘導培養基上，接種瓶內每瓶接種10~15粒種子，在培養室弱光培養，保持溫度24土2'C; 3天左右種子開始發芽，繼續培養12天後，開始形成愈傷組織，同時分化出叢生芽，35天左右 形成完整植株，45天後可得到大量分化的組培苗；3、 繼代增殖將誘導出的不定芽切割後再繼續培養在相同培養基(即1/2MS + 6-BA 5.0 10.0mg/L + NAA0.5 1.0mg/L)增殖，28 32天為1個繼代增殖周期，以保持髙速度遞增， 每1個繼代增殖周期由1個芽增殖形成48個芽；4、 生根不定芽長大至2 3釐米髙時，切下接種在1/2MS+NAA0.2 0.5mg/L生根培 養基上，14 16天開始生根，生根率達卯。/。以上，每個分化芽有根數3 5條。本發明提出的芡歐鼠尾草組織培養方法，利用芡歐鼠尾草種子為外植體，使得外植體取 材容易，數量大，本培養方法可同步出愈傷和芽，進而形成完整植株，分化率髙，可批量生 產。本發明所述的組織培養方法，省去了現有方法中用種子作外植體，得到無菌苗再切割重 新轉入愈傷組織誘導培養基上，然後再分化芽兩步，本發明同步誘導出愈傷和芽，分化率高， 進而形成完整植株；不僅簡化了操作過程，而且大大縮短了培養時間，節省了生產成本，可 批量生產，應用價值髙。用本發明方法建立芡歐鼠尾草高效再生系統適用於各種鼠尾草品種 的組織培養，並能快速得到鼠尾草的組培苗，還可在生產中為鼠尾草的大規模種植提供一種 周期短、繁殖率髙、成本低廉的育苗方法。另外，由於芡歐鼠尾草種子具有非常強的吸水性，遇水後，快速形成白色糊狀黏液，處 理後的酒精、升汞水和無菌水很難倒出瓶外，而用1000ul移液槍吸出消毒處理後的廢液，方 法簡便，效率高;芡歐鼠尾草種子小，用鑷子夾取一粒種子接種到培養基中很困難，但用1000ul 移液槍吸取種子，再接種在培養基上，方法簡便，速度快，汙染率低(以上廢液處理和接種 方法未見報導)。
具體實施方式
實施例l取材芡歐鼠尾草(ra/v:'flto/7flw'cflZ:)種子為外植體、1、 外植體的消毒和廢液處理選用芡歐鼠尾草種子為外植體，用常規方法消毒，在無菌 操作臺上用70%酒精處理30秒，再用0.1。/。的升汞消毒1(M2分鐘，最後用無菌水衝洗5-6次， 消毒處理後的酒精、升汞水和無菌水用1000ul移液槍吸出；2. 、接種方法和愈傷組織、不定芽誘導消毒處理後的芡歐鼠尾草種子，用1000ul移液槍 吸取，接種在l/2MS + 6-BA10.0mg/L + NAA1.0mg/L ， PH值5.8的愈傷組織誘導培養基上， 接種瓶內每瓶接種10~15粒種子，在培養室弱光培養，保持溫度24土2"; 3天左右種子開始 發芽，繼續培養12天後，開始形成愈傷組織，同時分化出叢生芽，35天左右形成完整植株，
45天後得到大量分化的組培苗；
3、 繼代增殖將誘導出的不定芽切割後再繼續培養在相同培養基增殖， 一般30天左右 為1個繼代增殖周期，以保持高速度遞增，每1個繼代增殖周期由1個芽增殖形成4 8個芽;
4、 生根叢芽長至2 3釐米高時，切下接種在1/2MS + NAA0.2 0.5mg/L生根培養基 上，15天左右開始生根，生根率達卯％以上，每個分化芽有根數3 5條。
本發明所提供的芡歐鼠尾草組織培養繁殖方法，種子為外植體，相對頂芽、莖取材容易， 數量大，出苗快，分化率髙，穩定性高，生長良好等優勢。
實施例2
夾歐鼠尾草(加/vtoW伊aw'cflZ:)種子為外植體，基本操作方法同實施例l一致，但其愈 傷組織、不定芽誘導和增殖培養基為1/2MS + 6-BA 5.0mg/L + NAA0.5mg/L培養基，3天左右 種子開始發芽，繼續培養15天後，開始形成愈傷組織，同時分化出叢生芽，40天左右形成完 整植株，50天後得到大量分化的組培苗，增殖倍數4 5。
權利要求
1、 一種芡歐鼠尾草組織培養方法，其特徵在於芡歐鼠尾草種子經消毒處理，接種在l/2MS+6-BA5.0 10. 0mg/L+ NAA0.5~1.0 mg/L愈傷組織誘導培養基上，3天後種子開 始發芽，繼續培養14 16天，葉片邊緣開始形成愈傷組織，同時從兩片子葉中間產生叢 生的不定芽；不定芽長大切下再放在1/2MS+NAA0.2 0. 5mg/L生根培養基上，長出根 系得到再生苗。
2、 根據權利要求1所述的這種芡歐鼠尾草組織培養方法，其特徵是，所述的芡歐 鼠尾草種子經消毒處理，是選用芡歐鼠尾草種子為外植體，用常規方法消毒，在無菌操 作臺上用70%酒精處理30秒，再用0.1%的升汞消毒10 12分鐘，最後用無菌水衝洗5 6次,芡歐鼠尾草種子具有非常強的吸水性，消毒處理後的酒精、升汞水和無菌水用1000ul 移液槍吸出。
3、 根據權利要求l所述的這種芡歐鼠尾草組織培養方法，其特徵是，所述接種是用1000ul 移液槍吸取種子，接種在愈傷組織誘導培養基上，接種瓶內每瓶接種10~15粒種子，在培養室 弱光培養，保持溫度24土2iC。
4、 根據權利要求1所述的這種芡歐鼠尾草組織培養方法，其特徵是，將誘導出的不定芽 切割後再繼續培養在l/2MS+6-BA5.0 10. Omg/L+ NAA0.5~1.0 mg/L培養基增殖，28 32天 左右為l個繼代增殖周期，以保持高速度遞增，每l個繼代增殖周期由l個芽增殖形成4 8 個芽。
5、 根據權利要求l-4任一項所述的這種芡歐鼠尾草組織培養方法，其特徵是，不定芽長 大至2 3釐米髙時，切下接種在l/2MS + NAA0,2 0.5mg/L生根培養基上，14 16天開始 生根，每個分化芽有根數3 5條。
全文摘要
一種芡歐鼠尾草愈傷組織和叢生芽組織培養方法。本發明採用芡歐鼠尾草葉片再生原理，芡歐鼠尾草種子經消毒處理，接種在1/2MS+6-BA5.0～10.0mg/L+NAA0.5～1.0mg/L愈傷組織誘導培養基上，3天後種子開始發芽，繼續培養14～16天，葉片邊緣開始形成愈傷組織，同時從兩片子葉中間產生叢生的不定芽；不定芽長大切下再放在1/2MS+NAA0.2～0.5mg/L生根培養基上，長出根系得到再生苗。用本發明方法簡化了操作過程，大大縮短了培養時間，節省了生產成本，可批量生產，應用價值高。適用於各種鼠尾草品種的組織培養，並能快速得到鼠尾草的組培苗，還可在生產中為鼠尾草的大規模種植提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。
文檔編號C12N5/04GK101120654SQ20071003570
公開日2008年2月13日 申請日期2007年9月7日 優先權日2007年9月7日
發明者亮 劉, 易自力, 蔣建雄, 賈曉顏, 陳智勇, 黃麗芳 申請人:湖南農業大學