Cdk18基因及其表達產物的應用的製作方法

2023-05-30 11:27:06 1

專利名稱：Cdk18基因及其表達產物的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因的應用，特別是涉及一種⑶K18基因及其表達產物的應用。
背景技術：
蛋白激酶是由人類基因組中最大的一類基因所編碼，其作用是通過將磷酸基團轉移至底物蛋白上，來調控各種蛋白的活性、信號轉導通路及細胞生物學過程，人類基因群編碼超過57個激酶家族之中的518種蛋白激酶。大約有55%已知的原癌基因編碼蛋白激酶，其餘多數的原癌基因則編碼可激活蛋白質激酶或被激酶磷酸化的特異蛋白。所有蛋白激酶參與細胞信號通路，參與心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、關節炎和其它免疫紊亂、神經系統如老年性痴呆症，阿默海茨症AD等發病機制，現已發與超過400種人類疾病與蛋白激酶 相關。美國FDA的製藥和生物技術公司中有四分之一的藥物研究開發方案集中在研發新的蛋白激酶抑制劑，這些藥物應用於治療包括腫瘤、炎症、心力衰竭、糖尿病和神經系統疾病， 超過60種的蛋白激酶抑制劑正在臨床試驗之中,其中許多已開發上市,如諾華(Novartis)的 Gleevec ,阿利斯康(AstraZeneca)的 Iressa ,施貴寶的 Tarceva (Genentech andOSI Pharmaceuticals),拜爾的 Nexavar (Bayer),輝瑞的 Sutent (Pfzer), Sprycel (Bristol-Myers Squibb),和葛蘭素史克的 Tykerb (GlaxoSmithKline),製藥公司清楚地認識到蛋白激酶抑制劑的重要性，已成為藥物研發的熱點。肝癌嚴重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和預後的關鍵。肝癌的治療在過去20年來已取得很大的進展，外科手術切除及肝臟移植屬於「根治性」治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物學概念的改變，腫瘤局部非手術治療在肝癌治療中的地位日益提高。經導管動脈內化療栓塞(TACE)已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。該方法可使90%以上的肝癌患者受益，但總體療效有待提高。此外，經皮肝穿刺瘤內無水乙醇治療(PEI)也是較常用的局部化療方法，對癌直徑< 3cm的肝癌及門靜脈癌栓的治療有一定價值。但目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性差，療效不佳，因此，迫切需要尋找新的作用靶點，研究和開發肝癌特異的新藥物，提高化療的特異性和有效性。近幾年來隨著對肝癌基礎研究的深入，生物治療在肝癌的綜合治療中取得了較大進展，成了繼手術、放療、化療後腫瘤治療的第四大療法，如免疫治療、基因治療，包括抗血管生成、自殺基因治療、腫瘤疫苗治療、siRNA技術等。但許多生物治療的臨床療效仍不十分滿意，且絕大多數還處在實驗研究階段，相關的關鍵理論和實驗技術仍需進一步研究和發展。CDK18是細胞周期素依賴性激酶家族成員，細胞周期素依賴性激酶(CDKs)是真核細胞中關鍵的細胞周期調控者，他們的活性被與之結合的細胞周期素控制。因此，有進一步研究的價值。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種⑶K18基因及其表達產物在製備診斷肝癌的產品中的應用。本發明要解決的技術問題之二是提供一種⑶K18基因及其表達產物在製備治療肝癌的藥物中的應用。本發明要解決的技術問題之三是提供一對特異擴增CDK18基因的引物，該引物可用於製備用RT-PCR診斷肝癌的產品。本發明要解決的技術問題之四是提供⑶K18基因的s iRNA，該s iRNA可用於製備治療肝癌的藥物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一方面，提供了一種⑶K18基因及其表達產物在製備診斷肝癌的產品 中的應用。所述診斷肝癌的產品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、激酶活性檢測、原位雜交、或基因晶片診斷肝癌的產品。所述用RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增⑶K18基因的引物。所述用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增⑶K18基因的引物。所述用免疫檢測診斷肝癌的產品包括 與⑶K18蛋白特異性結合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。所述用激酶活性檢測的產品包括特異性檢測CDK18激酶活性的底物及反應體系。所述用原位雜交診斷肝癌的產品包括 與CDK18基因的核酸序列雜交的探針。所述用基因晶片診斷肝癌的產品包括■ 與⑶K18基因的核酸序列雜交的探針。在本發明的一方面，提供了用於製備用RT-PCR診斷肝癌產品的一對特異擴增CDK18基因的引物，所述引物的上遊引物序列具有如SEQ ID NO 1所不的序列或其互補序列，所述引物對的下遊引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補序列。另外，本發明還提供了一種CDK18基因及其表達產物在製備治療肝癌的藥物中的應用。所述治療肝癌的藥物及方式包括通過RNA幹擾抑制⑶K18基因表達的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關病毒載體，或能夠抑制CDK18蛋白激酶活性的化合物、多妝、單克隆抗體。其中，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA幹擾特異性抑制⑶K18基因表達的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態、不同遞送方式。所述治療肝癌的藥物包括攜帶特異性針對⑶K18基因幹擾其表達的DNA載體、病
毒載體。在本發明的另一方面，提供用於製備治療肝癌藥物的⑶K18基因的三對siRNAs，分別為 CDK18-sil、CDK18-si2 和 CDK18-si3。其中，CDK18_sil 的正義鏈具有如 SEQ ID NO:5所示序列，⑶K18-sil的反義鏈具有如SEQ ID NO :6所示序列。⑶K18_si2的正義鏈具有如SEQ IDNO 7所示序列，CDK18-si2的反義鏈具有如SEQ ID NO 8所示序列。CDK18_si3的正義鏈具有如SEQ ID NO :9所示序列，CDK18-si3的反義鏈具有如SEQ ID N0:10所示序列。
本發明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內、靜脈內或皮下)。本發明的藥物也可被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規方法進行製備。針齊U、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。為了實現本發明中CDK18基因作為製備肝癌治療藥物的靶點，本發明通過如下技術方案實現I、化學合成雙鏈核糖核酸分子，其 序列特異性針對CDK18基因序列，利用脂質體包裹遞送至肝癌細胞內，幹擾⑶K18基因的表達，CCK-8法測量肝癌細胞Huh-7，Hep3B,MHCC-97H，MHCC-97L生長活性。本發明中實驗結果證明特異性針對⑶K18基因的小核糖核酸分子能夠抑制肝癌細胞體外的生長，說明CDK18基因可用作製備肝癌治療藥物的靶基因。2、利用各種載體,包括DAN載體、腺病毒、腺相關病毒載體來幹擾CDK18基因的表達，達到體內幹擾CDK18基因的效果，從而實現抑制肝癌細胞體內增殖的目的。3、獲得能夠特異性抑制⑶K18基因激酶活性的多肽、單克隆抗體，達到抑制⑶K18激酶活性的目的，從而實現抑制肝癌細胞體內增殖的目的。4、獲得能夠特異性抑制⑶K18基因激酶活性的化合物，達到抑制⑶K18激酶活性的目的，從而實現抑制肝癌細胞增殖的目的。本發明中用於特異性幹擾CDK18基因的小核糖核酸序列設計原則如下(I)從轉錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找「AA」 二連序列，並記下其3』端的19個鹼基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5』和3』端的非編碼區(untranslatedregions, UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始複合物可能會影響siRNA核酸內切酶複合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應的基因組資料庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如，使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列體外評估幹擾⑶K18基因表達。本發明首次公開了 CDK18激酶基因的應用，用於製備肝癌診斷的產品和肝癌治療的藥物。本發明⑶K18基因序列特異性siRNA幹擾可以顯著抑制肝癌細胞的生長，因此CDK18基因及其表達產物可作為診斷肝癌的標誌物和用於肝癌治療的藥物靶點，使肝癌診斷更加準確、快速，並提供了新的肝癌治療的基因靶點。總之，本發明CDK18基因為防治肝癌提供了新的治療靶點和有效新藥。


下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明圖I是RNAi篩選技術體系示意圖2是激酶siRNAs庫對四株肝癌細胞H印3B、Huh-7、MHCC_97H、MHCC_97L生長活性影響分布圖；圖3是四株肝癌細胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L中5 %可信區間(Confidence interval, Cl)和 10%分析區間(Analysis interval, Al)的確定，分別得到抑制、促進細胞生長的siRNAs及對應的激酶基因圖；圖4是四株肝癌細胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L全激酶組範圍內RNAi對細胞活性影響的統計圖，圖中的1、2、3、4代表相應的細胞株數目；圖5是RNAi篩選體系鑑定幹擾⑶K18基因能夠抑制肝癌細胞H印3B、Huh_7、MHCC-97H的生長的柱狀圖。
具體實施例方式以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例IRT-PCR實驗檢測⑶K18基因在肝癌組織中的表達情況逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)實驗檢查⑶K18基因再肝癌組織中的表達情況。RT-PCR 是指將逆轉錄(Reverse Transcription ；RT)反應和 PCR(Polymerase ChainReaction)反應組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用於對表達信息進行檢測或定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及SI核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易於操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo (dT)或基因特異性的引物起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩衝液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。I.組織分離實驗用組織來源於原發性肝癌的手術病人。手術切除的肝臟一經離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(_80°C )保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據。2.總核糖核酸(RNA)的抽提試劑盒抽提總核糖核酸(RNA)採用TRIZOL(Invitrogen),該試劑是基於酸性酹一步抽提法生產的。TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。用於抽提總核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均進行核糖核酸酶滅活處理，以保證實驗中無核糖核酸酶的環境。3.核糖核酸(RNA)抽提步驟RNA提取的一般步驟是破碎組織一分離RNA —沉澱RNA —洗滌RNA —融解RNA —保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入P-ME可以抑制RNA酶活性。分離RNA —半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA —般分布於上層，與蛋白層分開。沉澱RNA —般用乙醇、3M NaAc (pH-5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA應該儘量低溫。為了防止痕量RNase的汙染，從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於_70°C。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA :加入NaAc 至 0.3M，12，000Xg 離心 5 分鐘。4. cDNA 的合成(I)冰浴離心管裡面加入模板RNA 4iiL(liig/iiL)，隨機引物2iiL(20pmol/U L),去離子水5 ii L,混勻,離心3-5秒；·(2)70°C水浴5分鐘，冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對);(3)加入5 X M-MLV逆轉錄酶第一鏈緩衝液4 ii L (200U/ U I), RNase抑制劑I u L(Ribonuclease Inhibitor, 40U/ u I，TaKaRa)，dNTP 2u L(2. 5mM, TaKaRa)(這些應該先配好，然後分再裝到每一管)，混勻；(4) 37°C水浴5分鐘，加入I U L M-MLV RT反轉錄酶(200U/ U I)，混勻；(5)37°C水浴I小時(此步是反轉錄過程)；(6) 700C，10分鐘結束反應(此處是滅活酶活性，避免對後續實驗產生幹擾)，產物置冰上進行下一步PCR實驗，餘下的_70°C保存。5. RT-PCR的弓I物設計及擴增理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。設計5』端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。避免引物對3』末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。避免3』末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。避免3』末端的錯誤配對。3』端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。因此，本實施例中設計的引物具體如下CDK18-F:5，-GCCGGGTATAAGGAGCAAAG-3』 (SEQ ID NO 1)；CDK18-R:5，-CGTGAATTCAGCCAAGGATT-3』 (SEQ ID NO 2)；^ -actin(F) :5，-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，(SEQ ID NO 3)；^ -actin(R) :5，-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3』 (SEQ ID NO :4)。以P-actin作為內對照，反應混合物中各成分為0-actin(F)、& -actin(R) >CDK18 (F)、CDK18 (R)、10XPCR buffer、MgcI2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq ) cDNA 模板分別為0. 2,0. 2,0. 4,0. 4,1. 0,1. 0,0. 2,0. I和5 y LcDNA模板，最後補充ddH20使反應體系為10 u L0PCR的反應條件如下94 °C，5分鐘預變性；94 °C，30秒變性；55 °C，30秒退火；72 °C，30秒延伸；35個循環，電泳檢測PCR擴增產物。實施例2原位雜交用CDK18基因探針，與腫瘤切片進 行原位雜交，陽性雜交信號越強，患肝癌的可能性越高。實驗步驟為將肝臟腫瘤組織取材後OCT包埋、液氮速凍，恆冷冰凍切片，該冰凍切片進一步用於原位雜交。實施步驟如下(I)冰凍切片與雜交前預處理I).將樣品從_80°C取出，用OCT包埋，在_23°C (切片機腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10 厚的連續組織切片，平鋪於塗有多聚賴氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片預先經180°C幹烤6小時)，保存於-70°C冰櫃備用。2).冰凍切片經室溫乾燥IOmin後，在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin。3).活躍的 DEPC-PBS (未高壓的 0. I % DEPC-I X PBS 溶液)洗 2 次，每次 5min。4).在0.2M的鹽酸作用中作用IOmin後，重複步驟4)。5).在切片上滴加蛋白酶1((0.11^/1111)，371孵育151^11，重複步驟4)。6).經0. IM TEA (三乙醇胺)作用5min後，再在新配製的0. 25% AA/O. IM TEA (乙酸酐/三乙醇胺，pH8. 0)中乙醯化IOmin (在大多數實驗中，步驟4，5，6省略)。7). 5XSSC 中平衡 15min。(2)雜交I).在脫水後的玻片上滴加預雜交液(約100 U L/玻片)，置於放有溼盒液(50%甲醯胺 v/v;0. 3M NaCl ；lmM EDTA ; IOmM Tris_Cl，pH8. 0)的溼盒中，55 58°C下的烘箱中預雜交2h。2).甩掉預雜交液，地高辛標記的反義或正義cRNA探針(濃度l_2ng/ii L)經70°C變性10分鐘，置冰上lmin，玻片上滴加預雜交液(約60 ii L/玻片)，覆蓋parafilm膜，放溼盒中在48 58°C下雜交18-30h。(3)雜交後處理I).取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52°C預熱的5XSSC洗30mino2).在無 DNA 的 RNA 酶 A(20 y g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min。3).分別依次用 52°C^；^iM^2XSSC，lXSS(^P0. I X SSC 洗 2 次，每次 30min。(4)雜交信號檢測I).在緩衝液 A(0. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15M NaCl)中平衡 5min。2).在玻片上滴加鹼性磷酸酶的抗地高辛抗體(I 500 I : 2000稀釋於含0. 5%阻斷液的緩衝液A中)，室溫反應2h。3).用緩衝液A洗2次，每次15min。4).在緩衝液 B (0. IM Tris-HCl ；0. IM NaCl ；0. 05M MgCl2, pH9. 5)中平衡 5min。5).硝基四氮唑藍(NBT)和5-溴_4_氯_3_吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶於緩衝液B中，每ml緩衝液B含有4.5 ii L NBT和3.5 ii L BCIP0在玻片上滴加混合染液在溼盒中顯色過夜。6).充分顯色後，用 EDTA(lmM EDTA, pH8. 0)洗 15min 終止反應。7).在95%乙醇中洗Ih以除去非特異的背景。8).用蒸餾水洗15min除去可能存在的結晶體。9).脫水、透明，用中性樹膠封片。10).充分乾燥後在顯微鏡下觀察、照相。 實施例3全激酶組範圍內RNAi篩選肝癌細胞生長必需激酶基因RNAi作為一種簡單快速、特異、高效、經濟、效果可預測的技術，具有明顯的優點，它比反義核酸技術優越，比基因敲除簡單，具有很好的應用前景。具體可用於以下幾個方面基因功能分析；研究信號傳導通路的新途徑；新藥物的研究和開發；基因治療。RNAi只抑制致病基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能減少非特異作用引起的副作用。腫瘤發生是多基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時沉默的效應，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時沉默。針對人類基因組上所有激酶及激酶相關基因的siRNAs庫通過商業化途徑獲得(Stealth RNAi Human Kinase Collection, Invitrogen,Catalog no.12938-200)。每套 Stealth RNAi Collection 由若干 96 孔板組成,2nmoles 的 Stealth RNAi 溶解在IOOu I 的 IXRNA 退火 / 稀釋溶液中(IOmM Tris-HCl, pH 8. 0 ；20mM NaCl ；lmM EDTA, pH
8.0)，終濃度為20 u M.CCK-8測定細胞活性CCK-8試劑可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為該試劑中含WST-8 [其化學名稱為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H_四唑單鈉鹽]，它在電子載體I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料(Formazan dye)。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對於同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關係。分光光度計讀數，產生原始細胞活性數據，實驗流程如圖I所示。原始數據經過標準化，數據校正、Z值評估等步驟，得到siRNA庫對肝癌細胞生長影響的數據(圖2-4)，用於進一步分析。 實施例4RNAi幹擾效應將構建好的質粒pSUPER質粒轉染肝癌細胞後48小時後抽提細胞株RNA，定量PCR鑑定RNA幹擾的效果，確認質粒能夠發揮RNAi效應後，與pcDNA3. I (質粒質量比5 : I)共轉染，將細胞重新接種於IOcm大盤中培養，同時培養液中加入新黴素G418進行篩選培養4 6周，去除培養液，IXPBS漂洗兩遍後結晶紫染色後拍照計數。實施例5免疫檢測I、抗原蛋白獲得(I)利用基因工程表達可從Genebank資料庫中獲得人⑶K18基因的cDNA序列，通過PCR擴增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達載體中，表達⑶K18蛋白，並按基因工程表達產物的純化體系純化蛋白。2、抗體製備可採用以下幾種方法製備抗體(I)細胞融合法用上述製備的⑶K18蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細胞，再與骨髓瘤細胞融合，並按常規單克隆抗體製備技術製備單克隆抗體。(2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區並表達成基因工程單克隆抗體。 (3)利用純化的蛋白免疫動物，製備多抗血清。3、檢測(I)用製備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學方法進行肝癌的病理檢測，陽性信號為肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應為肝癌可疑病人。(3)將⑶K18抗體作為蛋白質晶片的探針之一，用於多種腫瘤診斷。實施例6⑶K18基因的小幹擾核糖核酸(siRNA)體外化學合成小幹擾核糖核酸(siRNA)具有快速、簡單和特異性強等特點，在抗腫瘤治療等方面有廣泛的應用前景。針對CDK18基因mRNA設計合成三對siRNAs對應靶序列，該3對siRNA序列分別如下CDK18-sil 正義鏈GCAAGAGGCUCUCUCUGCCCAUGGA(SEQ ID NO 5)；CDK18-sil 反義鏈UCCAUGGGCAGAGAGAGCCUCUUGC(SEQ ID NO 6)；CDK18-si2 正義鏈CCCAGGAAUUCCUACAGAAGCUACA(SEQ ID NO 7)；CDK18-si2 反義鏈UGUAGCUUCUGUAGGAAUUCCUGGG(SEQ ID NO 8)；CDK18-si3 正義鏈ACCUGGACAGUGACCUGAAGCAGUA(SEQ ID NO 9)；CDK18-si3 反義鏈UACUGCUUCAGGUCACUGUCCAGGU (SEQ ID NO :10)另外設置無關序列作為陰性對照siRNA，正義鏈，5』-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3』(SEQ ID NO :11)，反義鏈，5』-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3』(SEQ ID NO :12)在96 孔板中每孔接種 3 X IO3 個 Huh-7，Hep3B, MHCC-97H 和 MHCC-97L 細胞(無血清培養液)(均源自中國科學院細胞庫)，待細胞密度達到40 %左右時，利用脂質體(Lipofectamine2000)轉染試劑分別將上述3種siRNA按終濃度50nmol/L轉染進Huh_7，Hep3B, MHCC-97H和MHCC-97L細胞中，4h後換成含10%胎牛血清的DMEM。以24h為I個檢測單位培養7d，每天檢測I次該細胞密度。每孔待測細胞液中加IOii L CCK-8，37°C孵育Ih0利用酶標儀在450nm波長下檢測其吸光度以代表細胞存活能力，繪製生長曲線。實驗結果，如圖5所示，表明特異性幹擾CDK18表達的小幹擾核糖核酸(siRNA)能夠抑制肝癌細胞系MHCC-97H的生長，肝癌細胞的存活率明顯低於對照組的細胞，說明人⑶K18基因的表達下調能在一定程度上抑制肝癌細胞生長。
權利要求
1.ー種⑶K18基因及其表達產物的應用，其特徵在於所述⑶K18基因及其表達產物在製備診斷肝癌的產品中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於所述診斷肝癌的產品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、激酶活性檢測、原位雜交、或基因晶片診斷肝癌的產品。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述用RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增CDK18基因的引物。
4.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括ー對特異擴增⑶K18基因的引物。
5.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述用免疫檢測診斷肝癌的產品包括 與⑶K18蛋白特異性結合的抗體。
6.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述用激酶活性檢測的產品包括特異性檢測CDK18激酶活性的底物及反應體系。
7.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述用原位雜交診斷肝癌的產品包括 與CDK18基因的核酸序列雜交的探針。
8.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述用基因晶片診斷肝癌的產品包括 與⑶K18基因的核酸序列雜交的探針。
9.ー種⑶K18基因及其表達產物的應用，其特徵在於所述⑶K18基因及其表達產物在製備治療肝癌的藥物中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在幹所述治療肝癌的藥物及方式包括通過RNA幹擾抑制CDK18基因表達的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關病毒載體，或能夠抑制CDK18蛋白激酶活性的化合物、多肽、單克隆抗體。
11.如權利要求10所述的應用，其特徵在於所述治療肝癌的藥物包括通過RNA幹擾特異性抑制CDK18基因表達的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態、不同遞送方式。
12.如權利要求10所述的應用，其特徵在於所述治療肝癌的藥物包括攜帶特異性針對⑶K18基因幹擾其表達的DNA載體、病毒載體。
13.用於製備用RT-PCR診斷肝癌產品的一對特異擴增⑶K18基因的引物，其特徵在於所述引物的上遊引物序列具有如SEQ ID NO :1所示的序列或其互補序列，所述引物對的下遊引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補序列。
14.用於製備治療肝癌藥物的ー對⑶K18基因的siRNA，其特徵在於所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 5所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 6所示序列。
15.用於製備治療肝癌藥物的ー對⑶K18基因的siRNA，其特徵在於所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 7所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 8所示序列。
16.用於製備治療肝癌藥物的ー對⑶K18基因的siRNA，其特徵在於所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 9所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 10所示序列。
全文摘要
本發明公開了一種CDK18基因及其表達產物的應用，用於製備肝癌診斷及治療的產品。本發明的CDK18基因及其表達產物，可作為診斷肝癌的特異性標誌基因，使肝癌診斷更加準確、快速；本發明的CDK18基因及其表達產物可作為製備治療肝癌藥物的靶基因，提供新的肝癌治療途徑。
文檔編號A61K39/395GK102690878SQ201110071089
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月23日 優先權日2011年3月23日
發明者王群, 鄧慶, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心