分枝桿菌烯醯輔酶a水合酶基因及其用途的製作方法

2023-05-30 07:47:31 1

專利名稱：分枝桿菌烯醯輔酶a水合酶基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥和工業生物技術領域，涉及一種基於分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的重組酶、工程菌及其用途。
背景技術：
烯醯輔酶A水合酶不但參與脂肪酸代謝途徑，還參與很多胺基酸代謝途徑，如賴氨酸降解、異亮氨酸降解，色氨酸、β-丙氨酸代謝等，同時它還是細菌受到脅迫時的能源，在生物塑料降解中作用也很大。很多國家都在研究烯醯輔酶A水合酶在生物塑料降解中的作用，從而開發環境能源。
脂肪酸代謝酶也是醫藥界的研究熱點。美國Merck公司打破傳統的抗生素設計模式，以靶向細菌脂肪酸合成過程中起關鍵作用的酶進去篩選抗生素，進而遏制細菌的抗藥性，而且還可有效地殺死革蘭氏陽性細菌中葡萄球菌和腸球菌等具有廣泛抗藥性的致病菌。利用這種阻斷「桌球」反應的模式發現了一種致病菌將不會產生耐藥型的抗生素-平板黴素。
烯醯輔酶A水合酶(enoyl-coA hydratase，EchA)也是枝菌酸代謝的一個酶。目前該酶的序列已經測定，共含有213個胺基酸殘基。使用NCBI BLAST程序分析顯示在HRv37的全基因組中，烯醯輔酶A水合酶/異構酶超家族有21個同源分子，經預測分析這些酶在細胞質中合成(Pfam000378；http://Pfam.wustl.edu/)。目前，對分枝桿菌，尤其是結核菌烯醯輔酶A水合酶的研究甚少。
固定化細胞技術是比較成熟的一種生物技術。其應用已涉及到食品、化學、醫藥、化學分析、環境保護和能源開發等領域，顯示出廣闊的發展前景用於生產各種胞外產物，包括酒精酒類、胺基酸、有機酸、酶和輔酶，抗生素，還可以用於甾體轉化、廢水處理，以及用於製造微生物傳感器。該技術將用物理或化學的手段將游離細胞定位於限定的空間區域，並使其保持催化活性、反覆使用。該技術不需要把酶從細胞中提取出來，酶活力損失少，酶活回收率較高，因此該技術的應用已經超過固定化酶的應用。細胞被固定化後細胞密度高、反應速度快、耐毒害能力強、產物分離容易、能實現連續操作，可以大大提高生產能力等優勢，因此在近幾十年來固定化細胞技術得到了迅速的發展和廣泛的應用。固定化細胞方法按照固定化載體與作用方式的不同，可分為吸附法、包埋法、共價結合法、交聯法。吸附法吸附法又叫載體結合法，是依據帶電的微生物細胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力的作用，而使微生物細胞固定在載體表面和內部形成生物膜的方法，可分為物理吸附法和離子吸附法兩種。此法交為簡便，活力損失較小，但細胞與載體作用力小，易脫落。包埋法是將微生物細胞包埋在凝膠的微小空格內或埋於半透膜聚合物的超濾膜內。根據載體材料和方法的不同，包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。凝膠包埋法是將細胞包埋在各種凝膠內部的微孔中而使細胞固定的方法；半透膜包埋法是將細胞包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內而使細胞固定的方法。此法簡單，條件溫和，穩定性好，包埋細胞容量高。共價結合法是細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，從而成為固定化細胞。此法的優點是細胞與載體結合緊密，不易脫落，但製備較難，且活力損失較大。交聯法是利用雙功能或多功能試劑，直接與細胞表面的反應基團如胺基酸、羥基、硫基、咪唑基發生反應，使其彼此交聯形成網狀結構的固定化細胞，其結合力是共價鍵。此法製備麻煩，活力損失較大，但細胞與載體結合較緊。天然高分子載體包括海藻酸鹽、明膠、卡拉膠、海綿等。海藻酸鹽載體海藻酸鹽如海藻酸鈉、海藻酸鈣、海藻酸錳是一種廣泛應用的固定化介質，具有化學穩定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等優點。天然高分子載體，雖然無毒性，傳質性能好，但機械強度低，在厭氧條件下易被微生物分解，壽命短。因此可以利用合成高分子載體，常見的載體有聚乙烯醇、聚丙烯醯胺等。聚乙烯醇凝膠是目前國內外研究最為廣泛的一種包埋固定化載體，它具有強度高、化學穩定性好、抗微生物分解性強、對細胞無毒且價格低廉等一系列優點，因而具有很大的利用價值。以聚乙烯醇為載體主要成分，適量添加少量海藻酸鈉和活性炭等物質。其優點是可克服兩顆粒之間的粘連現象，有助於顆粒成型，改善通透性、增加固定化顆粒的孔隙，達到吸附和包埋的雙重效果。無機載體如多孔陶珠、氧化鋁、活性炭等，具有機械強度大、對微生物無毒性、不易被微生物分解、耐酸鹼、成本低、壽命長等特性，因而也是一類重要的載體材料。
固定化細胞用於手性分子的致病。對映體在合成手性藥物中非常重要，其方法包括了化學不對稱合成、外消旋體的生物拆分和生物催化不對稱還原。化學不對稱合成所需的化學催化劑價格昂貴，設備要求苛刻；生物拆分的缺點是對映體選擇性不夠理想，理論收率不高於50％。而生物催化不對稱還原具有高效率、高立體選擇性、反應條件溫和以及經濟和社會效益好等優點，因此，利用微生物細胞或酶作為催化劑來催化不對稱還原製備具有光學活性的對映體的方法最具吸引力。

發明內容
本發明的目的在於提供，1.一種基於分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的藥物篩選細胞模型；2.一種利用分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的藥物篩選細胞模型進行藥物篩選的方法；3.利用分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶或者含有該酶的工程菌的固定化產物進行生物轉化。
本發明的技術方案如下
實現上述目的的基本技術路線為總體技術方案是克隆包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的編碼基因，利用合適的載體和限制性內切酶片段，構建轉化載體，將烯醯輔酶A水合酶基因克隆到合適的宿主細胞，包括但不限於大腸桿菌、酵母、CHO細胞、昆蟲細胞等。
1.基因模板提取將待克隆烯醯輔酶A水合酶基因的菌株在LB培養基或YE培養基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養基中，培養到合適的菌體濃度，按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA，作為基因擴增的模板。
2.烯醯輔酶A水合酶基因的克隆根據出發菌株的鹼基特徵和烯醯輔酶A水合酶基因的保守序列，設計引物，按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法，通過PCR擴增烯醯輔酶A水合酶基因。
3.轉化載體的構建、轉化和轉化子篩選按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業途徑獲得的載體、限制性內切酶和方法，將目標基因克隆到載體，轉化宿主細胞，篩選轉化子。
4.固定化細胞的製備包埋法固定化細胞卡拉膠包埋、海藻酸鈣(CA)包埋、聚乙烯醇(PVA)-海藻酸鈉(CA)包埋、聚乙烯醇(PVA)凍結包埋。
吸附法固定化細胞將陶粒、磁粒、活性氧化鋁、矽膠、甲殼素、多孔玻璃、大孔吸附樹脂、大孔陰離子交換樹脂等吸附載體加入培養基中，接種後搖瓶培養適當時間，過濾出固定化細胞，用無菌水衝洗數次。
固定化條件的選擇在製備固定化細胞的過程中，包埋菌體量、海藻酸鹽的濃度、CaCl2的濃度以及鈣化時間是製備固定化細胞的主要影響因素。為了確定上述4種因素對固定化過程所產生的綜合影響，確定重組菌固定化的條件，採用正交實驗法，以長鏈枝菌酸合成為指標進行實驗。
發明效果利用本技術方案涉及的方法，構建了基於烯醯輔酶A水合酶的藥物篩選細胞模型並篩選到了陽性分子，純化了重組酶，固定化了重組酶和工程菌，進行了生物轉化。


圖1.PCR產物的1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。1，2EchA18 PCR產物，3對照4DNA分子量標記(DL2000)圖2.SDS-PAGE分析。1，2純化的重組EchA18，3pET32a(+)，4分子量標記圖3.烯醯輔酶A水合酶的系統進化。利用已有的烯醯輔酶A水合酶序列和軟體clustalx1.83的TreeTop程序(www.genebee.msu.su/genebee.html)進行比對。分支距離(X軸)代表利用BLOSUM62取代矩陣獲得的親緣關係。
具體實施例方式
1.1試劑和材料試驗菌株和載體結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv(重慶市肺科醫院提供)、或者牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌；大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH-5α、BL21，pET32a(+)載體由本實驗室保存(均可以通過商業途徑購得)。
試驗試劑Taq DNAPolymerase，DNA marker IV和marker DL2000購自北京天為時代科技有限公司；DNA純化試劑盒購自北京賽百勝基因技術有限公司；限制性內切酶(EcoRI和HindIII)，T4DNA連接酶和dNTP購自TaKaRa公司；IPTG購自北京鼎國生物技術有限公司；氨苄西林購自BBI公司；其餘化學試劑均為分析純。Buffer A50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM mmol/l imidazole PH7.4.
1.2方法質粒提取，感受態細胞的製備，質粒轉化，酶切反應，連接反應，瓊脂糖凝膠電泳SDS-PAGE等常規分子生物學操作參考《分子克隆實驗指南》第三版(科學出版社，2002)1.2.1 MTB H37Rv或者其他分枝桿菌基因組抽提通過鹼法或者酶法裂解細菌之後，可以將胞內的核酸和蛋白質全釋放出來。DNA溶於1mol/L的NaCl中，不溶於0.14mol/L的NaCl，而RNA溶於0.14mol/L的NaCl不溶於1mol/L的NaCl中，通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開。氯仿-異戊醇法除去蛋白，2倍體積乙醇將DNA沉澱出來。
1.2.2目的基因ECH編碼序列的擴增根據GenBank登錄的MTB H37RvECH18編碼序列(GeneID888123)設計一對引物(上海英駿生物技術有限公司合成)-----P1、P2，序列以及酶切位點如下P15』-ATAGAATTCATGAGGCGGCGTGCA-3』(下劃線為EcoRI酶切位點)P25』-CCCAAGCTTTGCACCAATCACCAG-3』(下劃線為HindIII酶切位點)PCR反應體系及條件PCR反應體系(25μl)10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 2μl，引物P1(10μM)、P2各2μl，模板2μl，Taq 0.5μl。
PCR反應條件95℃ 5min；95℃ 1min，57.5℃ 45s，72℃ 2min，35個循環；72℃ 10min。1.5％瓊脂糖電泳檢測及純化PCR產物。
1.2.3目的基因的克隆與鑑定用EcoI和HindIII雙酶切PCR產物和pET32a(+)載體，瓊脂糖電泳純化，回收酶切的基因片段和載體，然後用T4DNA連接酶16℃連接過夜，產物轉化E.coli BL21(CaCl2法)，塗布於LB平板(含100μg/ml氨苄青黴素)上，37℃培養。挑取陽性克隆培養並抽提質粒，PCR和酶切鑑定重組質粒。將獲得的重組質粒pECH-pET32a(+)送上海英駿生物技術有限公司測序。
1.2.4重組ECH的表達挑取重組菌BL21(pECH-pET32a(+))接種於含有氨苄西林的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜。將過夜培養物接種於新鮮的含有氨苄西林的LB中，接種量4％，振蕩培養OD600＝0.6。30℃下IPTG誘導(終濃度為0.4mM)，2h後離心收集細胞；Buffer A重懸細胞，超聲破菌，離心分別收集上清和沉澱。SDS-PAGE分析菌體，上清和沉澱。帶有pET32a(+)空載體的BL21作為陰性對照。
1.2.5重組蛋白的純化按照優化的表達條件，培養600ml的ECH表達菌液；離心(10000rpm，5分鐘)收集菌體；Buffer A重懸細胞沉澱，冰浴中超聲波破碎菌體，4℃離心(10000rpm，10min)，收集上清。上清液上樣於預先Buffer A平用衡的Ni sepherose上，流速0.5ml/min；BufferA衝洗柱子，收集雜蛋白；Buffer B和Buffer C梯度洗脫並收集目的蛋白，4℃保存；取經SDS-PAGE分離得到的重組ECH條帶，-20℃保存。
2.結果2.1用熱啟動PCR方法獲得ECH編碼序列根據結核分枝桿菌ECH的編碼序列設計一對PCR引物，以MTB的基因組為模板，PCR擴增得到約650bp大小的DNA片段(Fig.1)，結果與理論(642bp)相符。
2.2重組質粒的構建及鑑定pET32a(+)是一個T7表達載體，大小為5.9kb，含有抗氨苄基因Ampr。pET32a(+)經EcoRI/HindIII雙酶切後，取大片段與EcoRI/HindIII雙酶切的PCR產物連接後轉化大腸桿菌BL21，37℃培養過夜。挑選能在含有氨苄青黴素的LB平板上生長的菌株，抽提質粒進行雙酶切和PCR檢測，均得到一個650bp左右的片段。由於構建重組質粒採用的是兩個不同的酶切位點，所以不需要進行克隆插入方向的驗證。由此得到了插入片段大小和方向均正確的重組克隆。以pET32a(+)載體的測序通用引物對pECH-pET32a(+)的插入片段進行測序(由上海英駿生物技術有限公司完成)。經分析軟體Vector NTI 9.0比較，重組質粒pECH-pET32a(+)的測序結果與GenBank中的結核分枝桿菌ECH編碼序列完全一致，未發生鹼基突變，說明重組質粒pECH-pET32a(+)構建成功。
2.3重組蛋白的表達及其純化重組質粒pECH-pET32a(+)在大腸桿菌BL21中的誘導表達產物經SDS-PAGE電泳，在大約43kDa處出現清晰的蛋白條帶(Fig.2)，即為重組ECH；誘導後的菌體經超聲波破碎後取上清進行SDS-PAGE電泳，可見該重組蛋白在上清存在。用Buffer A重懸收集的適當培養的重組菌，經超聲波破碎後，離心收集上清液，用Ni sepharose對上清中的重組蛋白進行純化，收集到與Ni sepharose特異結合的蛋白。對純化蛋白進行SDS-PAGE分析，單一的43kDa重組蛋白條帶(Fig.2)。
細胞固定化將重組菌接入液體培養基，在30℃或者37℃和適當的轉速條件下培養到適當的菌濃度，離心，取一定量的溼菌體，無菌水洗滌後，與20ml一定濃度的海藻酸鹽溶液於常溫下混合，充分攪拌成均勻菌懸液後，用滴管或者注射器滴入100ml一定濃度的CaCl2水溶液中，於4℃硬化交聯，得到直徑3～4mm的海藻酸鈣凝膠小球，用無菌水充分洗滌後，用定性濾紙吸乾表面水分，4℃保存備用。
權利要求
1.基於分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的工程菌及其用途，其特徵是將分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶基因的克隆到合適的宿主細胞，構建含有分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的基因工程細胞模型或純化的重組分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶篩選烯醯輔酶A水合酶的抑制劑或者激活劑，或者用固定化的重組酶或工程菌進行生物轉化。
2.權利要求1所述的烯醯輔酶A水合酶，其特徵是包括來自分枝桿菌屬的菌烯醯輔酶A水合酶，尤其是來自結核分枝桿菌的菌烯醯輔酶A水合酶。
3.權利要求1所述的宿主細胞包括但不限於細菌、真菌、哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
4.權利要求3所述的細菌包括大腸桿菌。
5.固定化分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的工程菌及其用途，其特徵是用可以固定化的介質包埋分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的工程菌。
6.權利要求1所述的生物轉化，其特徵是利用重組的分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶及含有分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的工程菌轉化相關物質。
7.權利要求6所述的生物轉化，其特徵是將短鏈脂肪酸轉化為長鏈脂肪酸。
全文摘要
本發明屬於醫藥和工業生物技術領域，涉及一種基於分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的重組酶、工程菌及其用途，特別是分枝桿菌烯醯輔酶A水合酶的重組酶、工程菌在酶抑制劑、激活劑和生物轉化長鏈脂肪酸，獲得特定生物活性的對映體。
文檔編號C12N9/00GK1995341SQ200610095338
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優先權日2006年12月25日
發明者謝建平, 王翠平, 陳宏玲, 王洪海 申請人:西南大學