人乳頭瘤病毒e6/e7融合基因及其高效表達載體和融合蛋白疫苗的製作方法
2023-05-30 10:25:16
專利名稱：人乳頭瘤病毒e6/e7融合基因及其高效表達載體和融合蛋白疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人乳頭瘤病毒E6/E7融合基因，該基因的製備方法，含有該基因的高效表達載體的構建和表達載體，利用該基因所獲得的融合蛋白，以及所述融合基因和表達蛋白在醫學中及在製備治療宮頸癌等腫瘤的藥物中的應用。
國內外大量流行病學及臨床研究已經證明，HPV16是引起婦女宮頸癌的主要病毒病因，在我國約有66％的宮頸癌患者由HPV16感染所致，其餘為HPV18，33和58型所致。感染途徑主要為橫向水平傳播(即多個性夥伴互相傳播)和母嬰垂直傳播兩種途徑(中華腫瘤雜誌，142932-296，1992)，與俄羅斯及日本等國報告的60％-78％基本一致(Int.J.Cancer，85313-318，2000；JPN，J，Cancer Res，8628-34，1995)。
隨著分子生物學研究的迅速發展和深入。對HPV病毒的致癌機理有了更確切的了解。通常HPV病毒感染宿主細胞後，其DNA整合到細胞的基因組中，但以後多數基因如殼蛋白L1和L2及早期蛋白E1、E2、E4、E5被刪除而從宿主DNA中丟失。E6和E7兩個癌基因仍然整合在基因組中。研究工作已經證明，這兩個基因的持續表達對於癌變及維持腫瘤的惡性表型是必需的(HPV and Cervical Cancer.Oxford UniversityPress，1994，London；Intl.J.Gynecol.Pathol.1916-28，2000；EMBO J，8513-519，1989)。因此，這兩個基因已逐漸成為人們研究癌變機理及防治用新生物製品的熱點。
研究者曾對殼蛋白L1進行了較多的研究觀察。這種蛋白疫苗雖對HPV病毒的感染具有一定的預防作用，但對已感染者則無預防和治療作用(Int.J.Cancer 81881-888.1999；J Natl Cancer Inst 93284-292，2001)。製備過程中存在最關鍵的技術難題是必須使用VLP(病毒樣顆粒)。即產物必須經二次至三次超離心獲得構型合適的VLP(J.Natl.Cancer Inst.93284-292，2001)。而超離心的儀器設備昂貴，且能處理的樣品量少；用昆蟲表達系統需要細胞培養，用滾動式培養瓶需一個個接種，耗時、耗材料，操作繁雜，易汙染且表達量較低。用原核細胞表達的L1蛋白，雖然表達水平較高，經柱層析後，再經過超離心方法獲得的構型合適的VLP收率太低，僅為上超離心時蛋白總量的萬分之二至萬分之五(Virology，243423-431.1998)。由於上述原因，給規模化批量生產帶來了很多困難。
近年來，國外開始把E6和E7基因作為主攻方向。動物實驗表明，單獨使用以原核系統表達的E7蛋白有防治效果，單獨使用E6蛋白也有55％左右的效果(Cancer Res，58724.1998)。已有研究證明，同時用E6和E7兩種蛋白的效果明顯優於單獨使用其中一種(CancerRes.591184-1187，1999)。因此，研究者曾設想使用E6/E7的融合蛋白作為疫苗以期進一步提高防治效果。但由於E6基因本身或E6/E7的融合蛋白表達水平太低而無應用價值。國外報導用原核表達野生型E6/E7的融合蛋白，經IPTG誘導後，表達水平僅為菌體總蛋白的2.5％(CancerRes.591184-1187.1999)，且由於是未經改造的野生型癌基因產物，其安全性受到人們的質疑。含有E6和E7基因的病毒疫苗，或以質粒為載體的DNA疫苗，由於可能整合到細胞基因組中，也存在安全性問題。用合成多肽疫苗，成本高且還需先作HLA鑑定，使用範圍受限制。
因此，本發明的一個目的是提供人乳頭瘤病毒E6/E7融合基因，該融合基因至少包括HPV的E6基因的編碼其1-120位的胺基酸的核苷酸序列(包括E6中完整的B-表位(1-23aa)和CTL-表位(29-38aa))，以及E7中完整的最關鍵的且已被證明確有抑癌活性的2個CTL-表位(11-20aa；49-57aa)及Th-表位(48-54aa)和3個B-表位(1-18aa；25-37aa；43-60aa)，即E7中的至少編碼前1-60位胺基酸的核苷酸序列(也可以包括編碼前60位以上的胺基酸的核苷酸序列，例如編碼前70個胺基酸的核苷酸序列，直至編碼總共98個胺基酸的核苷酸序列)。
其中E6基因的編碼第50位的賴氨酸的密碼子，E7基因編碼第24位的半胱氨酸和第26位的穀氨酸的密碼子可採用定點突變方法進行基因突變，使其喪失導致抑癌基因失活的能力。
該基因的特點是能夠在宿主中高效表達E6/E7融合蛋白。
該融合基因通過以下步驟來製備(A)獲取E6、E7基因；(B)將E6基因的編碼第50位的賴氨酸的密碼子，E7基因編碼第24位的半胱氨酸和第26位的穀氨酸的密碼子進行定點突變；(C)將以上定點突變後的E6基因的編碼1-120位胺基酸的核苷酸序列與定點突變後的E7基因的核苷酸序列融合。
本發明的另一個目的是提供上述融合基因的高效表達載體的構建及所述高效表達載體，包括用所述融合基因製成重組質粒，再將重組質粒轉化至宿主中。
本發明的又一個目的是提供利用上述融合基因獲得的蛋白疫苗。
本發明還有一個目的是提供上述融合基因和融合蛋白在醫學中的應用。
本發明更進一步的目的是提供上述融合蛋白在製備治療和/或預防宮頸癌等癌症的藥物中的應用。
本發明的人乳頭瘤病毒E6/E7融合基因可用於製備安全、有效、且高效表達的用於防治宮頸癌的蛋白疫苗。為宮頸癌的防治提供新的生物工程製劑。基因經突變及其它改造後其表達水平佔細菌總蛋白的40％左右，比國外已報導的2.5％高15倍左右，且安全，有效，易大批量生產。經檢索國內外尚未見到類似的報導。
圖2蛋白疫苗對實驗動物的防癌作用(詳細實驗方法見正文)1，蛋白疫苗+IFA佐劑組；2，IFA佐劑組；3，生理鹽水組圖3蛋白疫苗對腫瘤生長的抑制作用(詳細實驗方法見正文)1，蛋白疫苗+IFA佐劑組；2，IFA佐劑組；3，生理鹽水組
2、E6和E7基因的定點突變由於E6基因所編碼的蛋白中第50位的亮氨酸(Leu)是導致抑癌基因P53失活的關鍵位點，通過定點突變將其改變為甘氨酸(Gly)。又由於E7蛋白中第24位的半胱氨酸(Cys)和第26位的穀氨酸(Glu)是導致抑癌基因Rb失活的關鍵位點。將這兩個胺基酸均採用定點突變的方法將其改變為甘氨酸(Gly)。突變後的E6和E7基因分別命名為mE6和mE7。
3、mE6ΔcmE7Δ融合基因的合成首先以上述mE6為模板用PCR方法擴增其1-120位的胺基酸的編碼序列共360個鹼基對，並在其5′端加上EcoR1位點。然後用PCR分段延長法在mE6Δ的3′端逐步加上mE7的前60個胺基酸(1-60位胺基酸)。並在3′端加上Notl位點。經序列分析證明所獲得的融合基因序列正確無誤，保留了突變的位點。命名為HPV16-mE6Δ/mE7Δ(見SEQ ID No.1)。由此構建的融合基因保留了E6中完整的B-表位(1-23aa)和CTL-表位(29-38aa)(Clin，Exp.Immunol，115397-403，1999；J.Immunol.1545934-5939.1995)和E7中完整的最關鍵的且已被證明確有抑癌活性的2個CTL-表位(11-20aa；49-57aa)及Th-表位(48-54aa)和3個B-表位(1-18aa；25-37aa；43-60aa)(J，Immunol，1545934-5943，1995；Eur.J.Cancer，35946，1999；J.Immunother，21399.1998；Virology，231155-166，1997)。二、高效表達工程菌的構建及產物的鑑定將上述獲得的HPV16-mE6Δ/mE7Δ融合基因片段用EcoRI和Notl酶切後，再定向克隆到PET30a(+)載體中(Novagen公司)轉化大腸桿菌DH5a，在含有50ug/ml卡那黴素的LB-平皿上，37℃培養過夜，挑取陽性克隆，用常規方法提取重組質粒，經酶切鑑定。再將含目的基因重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)。在含50ug/ml卡那黴素的LB-平皿上，於37℃培養過夜。隨機挑選80個單菌落觀察表達情況。表達條件為用新鮮LB培養液(含50ug/ml卡那黴素)。挑取單菌落在無菌環境中接種於5ml培養液(含50ug/mL卡那黴素)的試管中，37℃於搖床上培養過夜。次日按1∶50的比例接種於20ml培養液中，37℃搖培約3-4小時，待生長至O.D.600為0.5-0.7時，加入1mM(終濃度)IPTG誘導3-5小時。然後取1ml菌液於4℃，4000轉/分，離心5分鐘，棄上清加入常規用蛋白裂鮮液，超聲破碎後，按常規方法進行SDS-PAGE電泳(10％)。電泳完畢後，用考馬斯亮蘭染色液染色2小時，再用脫色液脫色後，可明顯看到一條約30KD的蛋白帶。該蛋白帶在未加誘導劑的對照管中幾乎看不清楚。經用抗HPV16E6及E7(SantaCruz公司產品)分別進行Western blot分析鑑定，證明該蛋白為E6和E7的融合蛋白，且分子量與預計相符。再用同樣條件進行發酵，取不同時間點(1至5小時)的樣品經SDS-PAGE電泳分析，同時與已知濃度的BSA為參照標準同時進行電泳。經染色及脫色後，用自動成象掃描儀進行光密度計算。當發酵培養時間為5小時，目的蛋白產物為菌體總蛋白的40％左右。比國外報導的全長野生型E6/E7融合蛋白產物表達水平佔菌體總蛋白的2.5％高15倍左右(Cancer Research，59184-1187.1999)。不同時間取樣後產物表達水平的電泳結果見
圖1。由於克隆位點是EcoR1和Notl，該表達產物在5′端帶有His-Tag和S-Tag。用類似方法生產的HPV6b-L2E7基因工程疫苗用於治療尖銳溼疣已取得較好的效果，已通過二期臨床觀察(J.Infect.Deseases 1999179612-618)。三、蛋白產物的純化(以100ml培養的細菌為例)1、收穫細胞；待細胞(含上述重組質粒)在37℃搖床培養生長至OD600為0.5-0.7時，加入IPTG最終濃度為1mM。再繼續培養3-4小時，4000g，4℃離心10分鐘收集大腸桿菌。儘可能的吸棄上清。然後將細胞懸浮於4ml溶液I中，(500mM NaCl，20mM Tris-HCl，PH8.0)。懸浮均勻後置冰水浴中，超聲破碎細胞(每次超聲3秒，停3秒，共30次)。
2、包含體的收集；由於表達蛋白是在包含體中，將上述經超聲處理的樣品於16000g，4℃，離心15分鐘。儘量棄盡上清，收集沉澱。將沉澱再懸浮於溶液I中，重複離心一次，以進一步除去雜蛋白。
3、將上述收集的沉澱即包含體。懸浮於5mL含有8M脲素的溶液I中，混合均勻，置冰水浴中1小時以溶解包含體。然後於16000g，4℃離心20分鐘，保留上清，棄去不溶的物質。並用0.45um的過濾器過濾。備下步純化用。
4、預先裝好層析柱(10cm×0.6cm)內含2.5ml層析介質TALONTMMetal親合層析樹脂(Clontech公司)，並已用溶液I(含8M脲素)平衡好備用。把上述已經過濾的溶液小心沿管壁加入柱中，不要使樹脂漂起。控制流速在25ml/小時(相當於柱床體積的10倍/小時)左右，即約0.5ml/分。
5、用25ml溶液I(含8M脲素)衝洗柱子，流速同上，以除去雜質蛋白。
6、用15ml溶液II(20mM咪唑，500mM NaCl，8M脲素，20mMTris-HCl，pH8.0)洗柱以進一步除去非特異性結合的雜蛋白。流速同上。
7、洗脫並收集蛋白；用10mL溶液III(400mM咪唑，500mM NaCl，8M脲素，20mM tris-HCl，PH8.0)洗脫目的蛋白。流速控制在0.3ml/分，分步收集，每管0.3ml。
8、走SDS-PAGE電泳，以檢查目的蛋白收集情況。合併含目的蛋白的各管樣品。
9、用sephadex G50凝膠過濾(1×35cm)脫鹽，用生理鹽水洗脫，分步收集。流速0.5ml/分，1ml/管。電泳檢查各管中蛋白量，並同時用已知濃度的BSA走電脈，以估計含量。合併含目的蛋白的各管，用分光光度法測定蛋白含量(Lowry法)。
用以上方法經重複試驗，目的蛋白回收率基本在50-60％。用1升發酵液，按比例放大上述各步驟，最終可得產品(純度為95％左右)，150至180mg。四、融合蛋白疫苗免疫後使實驗動物排斥癌細胞的攻擊——防癌作用以C57B1/6小鼠(8周左右)為實驗動物。用疫苗免疫動物後，用TC-1腫瘤細胞(來源於小鼠的腫瘤細胞，為用HPV16型E6和E7基因，及激活的Ras癌基因轉化而成，參見Cancer Res，5621，1996，由美國Johns Hopkins大學吳博士惠贈)。接種動物，觀察腫瘤發生及生長情況。具體實驗方案如下實驗動物30隻隨機分三組，每組10隻。第一組，每隻動物皮下注射含15ug蛋白疫苗的不完全福氏佐劑(IFA)100uL；第二組每隻動物只注射同體積的IFA；第三組，每隻動物皮下注射同體積的生理鹽水。第一次免疫後10天，再免疫一次，劑量同上。第二次免疫後10天，給每隻動物右側腹部皮下接種1×105TC-1腫瘤細胞。每周觀察兩次腫瘤生長情況，測量腫瘤體積。以V＝a2b/2計算腫瘤體積，其中；V為腫瘤體積，a為短徑，b為腫瘤長徑。接種腫瘤細胞60天後，第一組(疫苗組)未見腫瘤生長；第二組(IFA組)和第三組(生理鹽水組)所有動物都有腫瘤生長，腫瘤平均體積分別為465±25立方毫米和470±35立方毫米(圖2)。表明注射疫苗後，能有效預防腫瘤生長。
研究工作已經證明，致癌的HPV病毒感染宿主後，其E6和E7基因一直整合在宿主細胞基因組中並表達，經過一個較長的過程，逐漸使宿主細胞發生增生，再漸漸演變成癌細胞，稱為原位癌，然後再經分裂增殖並向周圍侵潤而長成腫瘤。因此，本實驗證明此蛋白疫苗能阻斷腫瘤的形成，而具有預防作用。可用於HPV16感染者高危人群的防癌工作。五、融合蛋白疫苗對腫瘤細胞生長的抑制作用——治療，預防術後復發轉移實驗動物，腫瘤細胞同上。實驗方案如下實驗動物共33隻，每隻動物皮下接種1×105TC-1腫瘤細胞。20天後，檢查腫瘤生長情況，經觀察有30隻動物均有可觸摸到的小腫瘤(約5-8立方毫米)。其中有三隻不能確定而棄去。將其隨機分為三組，每組10隻；第一組(治療組)；皮下注射含15ug蛋白疫苗的IFA100uL；第二組(IFA組)，每隻動物注射100ul IFA佐劑；第三組(生理鹽水組)，每隻動物皮下注射100ul生理鹽水。10d後再按上述劑量注射一次。一直觀察至60天(從接種腫瘤細胞計算時間)，每周二次觀察腫瘤生長情況。至實驗觀察到60天時，第一組(治療組)僅兩隻動物腫瘤有生長，且明顯小於其它組；第二組和第三組腫瘤全部生長，平均體積分別為10±3mm3，650±35mm3，680±45mm3(圖3)。
如前所述，約有40％的宮頸癌患者因復發轉移最終導致死亡。其原因主要是由於經過手術和/或放射治療後，體內仍殘存有癌細胞，這些癌細胞由於數量不太多或比較分散未形成可見或能觸摸到的瘤塊而未能切除，用其它檢查手段如CT或X-光拍片診斷也不易發現(稱為「亞臨床病灶」)所致。本實驗證明，用融合蛋白疫苗能顯著抑制腫瘤細胞生長，說明本發明所製備的新型融合蛋白疫苗在治療及預防轉移復發方面具有較好的作用。
綜上，本發明的優點是通過改造HPV16E6和E7基困保證了其安全性，並實現了高效表達，比國外報導的野生型提高了近15倍(CancerRes 951184，1999)。產物經純化後與福氏不完全佐劑混合均勻(此佐劑用於臨床已多年了)製備成疫苗後，經動物實驗證明具有防癌作用和治療功能。對於已感染HPV16病毒的高危人群預防宮頸癌及對宮頸癌患者術後預防復發，轉移無疑具有重要的應用價值。
實施例2按照與實施例1的步驟一和步驟二類似的方法進行，只是從HPV33型病毒獲取E6和E7基因，同樣獲得了高表達的融合基因及載體。
實施例3
按照與實施例1的步驟一和步驟二類似的方法進行，只是從HPV18型病毒獲取E6和E7基因，同樣獲得了高表達的融合基因及載體。
實施例4按照與實施例1的步驟一和步驟二類似的方法進行，只是從HPV58型病毒獲取E6和E7基因，同樣獲得了高表達的融合基因及載體。
序列表SEQ ID No.1(a)序列特徵長度540鹼基對類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線性(b)序列描述9 18 275』ATG CAC CAA AAG AGA ACT GCA ATG TTTMet His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe36 45 54CAG GCA CCA CAG GAG CGA CCC AGA AAGGln Ala Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys63 72 81TTA CCA CAG TTA TGC ACA GAG CTG CAALeu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln90 99108ACA ACT ATA CAT GAT ATA ATA TTA GAAThr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu117126135TGT GTG TAC TGC AAG CAA CAG TTA CTGCys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu144153162CGA CGT GAG GTA GGT GCA TTT GCT TTTArg Arg Glu Val Gly Ala Phe Ala Phe171180189CGG GAT TTA TGC ATA GTA TAT AGA GATArg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp198207216GGG AAT CCA TAT GCT GTA TGT GAT AAAGly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys225234243TGT TTA AAG TTT TAT TCT AAA ATT AGTCys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser252261270GAG TAT AGA CAT TAT CGT TAT AGT TTGGlu Tyr Arg His Tyr Arg Tyr Ser Leu279288297TAT GGA ACA ACA TTA GAA CAG CAA TACTyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr
306315324AAC AAA CCG TTG TGT GAT TTG TTA ATTAsn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile333342351AGG TGT ATT AAC TGT CAA AAG CCA CTGArg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu360369378TGT CCT GAA ATG CAT GGA GAT ACA CCTCys Pro Glu Met His Gly Asp Thr Pro387396405ACA TTG CAT GAA TAT ATG TTA GAT TTGThr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu414423432CAA CCA GAG ACA ACT GAT CTC TAC GGTGln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly441450459TAT GGT CAA TTA AAT GAC AGC TCA GAGTyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu468477486GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCTGlu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala495504513GGA CAA GCA GAA CCG GAC AGA GCC CATGly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His522531540TAC AAT ATT GTA ACC TTT TGT TGC AAGTyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys LysTAA3』SEQ ID No.2(a)序列特徵長度180個胺基酸類型蛋白鏈型單鏈拓撲結構線性(b)序列描述Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe5Gln Ala Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys10 15Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln20 25Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu30 35Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu4045Arg Arg Glu Val Gly Ala Phe Ala Phe50Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp55 60Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys65 70Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser75 80Glu Tyr Arg His Tyr Arg Tyr Ser Leu85 90Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr95Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile100 105Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu110 115Cys Pro Glu Met His Gly Asp Thr Pro120 125Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu130 135Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly140Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu145 150Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala155 160Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His165 170Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys175 180
權利要求
1.人乳頭瘤病毒的E6/E7融合基因，其特徵在於該融合基因至少包括HPV16的E6基因的編碼其1-120位的胺基酸的核苷酸序列，E7基因中的至少編碼前1-60位胺基酸的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的人乳頭瘤病毒的E6/E7融合基因，其中E6基因的編碼第50位的賴氨酸的密碼子，E7基因編碼第24位的半胱氨酸和第26位的穀氨酸的密碼子採用定點突變方法進行基因突變，使其喪失導致抑癌基因失活的能力。
3.根據權利要求1或2的融合基因，其中所述人乳頭瘤病毒為HPV16型、HPV18型、HPV33或HPV58型。
4.根據權利要求2的融合基因，特徵在於E6基因具有SEQ ID No.1的第1-360位的核苷酸序列，E7基因具有SEQ ID No.1的第361-540位的核苷酸序列。
5.權利要求1-4中任一項的融合基因的突變體。
6.含有權利要求1-4中任一項的融合基因的高效表達載體。
7.用根據權利要求1-4中任一項的融合基因獲得的融合蛋白。
8.根據權利要求7的融合蛋白，特徵在於它具有SEQ ID No.2的胺基酸序列。
9.根據權利要求1-4中任一項的融合基因在醫學中的應用。
10.根據權利要求7的融合蛋白在製備治療和/或預防癌症，尤其宮頸癌的疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種人乳頭瘤病毒E6/E7融合基因,該基因的製備方法,含有該基因的高效表達載體的構建和表達載體,利用該基因所獲得的融合蛋白,以及所述融合基因和表達蛋白在醫學中和在製備治療宮頸癌等腫瘤的藥物(疫苗)中的應用。本發明融合基因的表達水平佔細菌總蛋白的40%左右,比國外已報導的2.5%高15倍左右,且安全,有效,易大批量生產。
文檔編號C12N15/62GK1381583SQ0211714
公開日2002年11月27日 申請日期2002年4月24日 優先權日2002年4月24日
發明者趙清正 申請人:中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所