一種降解羊毛鱗片層的菌株的製作方法

2023-05-30 06:17:06

專利名稱：一種降解羊毛鱗片層的菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬假單胞菌領域，特別是涉及一種降解羊毛鱗片層的菌株。
背景技術：
羊毛織物是除棉織物外第二大天然纖維織物，其本身固有的輕薄、耐磨、吸溼、不 易燃的性能使毛織物成為高檔紡織品，有其他纖維織物無法比擬的優點，因而是深受人們 歡迎的一種高檔產品。我國作為羊毛最大生產國之一，每年羊毛產量在30萬噸左右。但羊 毛原毛鱗片層的存在嚴重影響羊毛品質，如手感、水洗氈縮、染色性能、刺癢感等。可以說羊 毛鱗片層是羊毛作為優質紡織品諸多不利因素的「罪魁禍首」。為了開發出優質毛紡織品，人們很久以來就研究利用各種工藝處理鱗片層。現在 降低羊毛鱗片層影響的方法主要是利用化學物質破壞鱗片層(如氯化法)或使用聚合物 (樹脂法)沉積在纖維表面來處理。前一種方法稱為「減法」處理，後一種方法稱為「加法」 處理，在實踐應用中為了得到更好處理效果，常採用兩種方法組合處理羊毛，例如目前毛紡 企業最成熟的處理工藝是氯化-樹脂工藝(Chlorine-Hercosett)。此工藝優點是處理時 間短，處理效果基本能夠滿足實踐需求，但其缺點是環境汙染嚴重，另外處理後殘留在織物 上的有機氯也會對消費者健康具有潛在不利影響，尤其是近年來各國政府和人民將環境與 健康作為主要考察點，而使得該工藝受到各界很大詬病。酶法作為生態紡織的主要技術，而 越來越受到人們青睞。羊毛鱗片層由富含二硫鍵的角蛋白構成，而角蛋白不被普通蛋白酶 所降解，因此市場上現有各種蛋白酶及脂肪酶都難於很好處理毛織物。人們為了使酶法達 到好的處理效果都增加了化學前處理步驟打斷二硫鍵，如利用雙氧水或過氧化鈉等強氧化 劑，二硫鍵斷裂的鱗片層在蛋白酶作用下可快速降解，但蛋白酶同時可滲透進入羊毛纖維 內部作用，降低了羊毛織物強度。人們為了解決這一問題，正在研究第三步，利用樹脂法或 TG酶(穀氨醯胺轉胺酶)，這就使蛋白酶法工藝步驟增加，耗時延長，費用增加，因此這一工 藝步驟至今沒有走上市場。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種降解羊毛鱗片層的菌株，該菌株所產蛋白 酶活性高，作用羊毛織物抗氈縮性能好，作用條件溫和，穩定性好；獨立降解羊毛鱗片層，不 需要傳統蛋白酶的前處理步驟，不引起羊毛織物強度下降；能夠替代毛紡行業中現有的氯 化_樹脂法，避免其產生有機氯對環境影響。根據BLAST聚類分析及形態學鑑定結果，將該菌株定命名為Pseudomonas sp. 3096-4。該菌經發明人檢測可完全降解，剝除羊毛鱗片層，該菌發酵液處理羊毛後可有 效提高羊毛織物抗氈縮性能並不引起毛織物強度降低，這種功能國內外已經發現菌株是前 所未見或未有應用的。本發明的一種降解羊毛鱗片層的假單胞菌3096-4(Pseudomonas sp. 3096-4)已 於2010年6月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，
3北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中科院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 3888，其 16SrRNA序列見表1。本發明提供的假單胞菌3096-4的特徵如下該菌菌落圓形，凸起，表面光滑溼潤，邊緣整齊，呈紅色半透明狀；呼吸類型為好 氧呼吸，在有氧條件下生長良好，革蘭氏染色呈陰性，形態觀察菌體杆狀，有端生鞭毛，可運 動，無芽孢的短桿菌，菌體大小為0. 5 1 X 1. 5 4 μ m。測定菌株的16S rRNA部分序列， 進行系統發育學分析(菌株的16S rRNA序列見表1)。本發明的一種蛋白酶複合酶，製備包括將假單胞菌3096-4接種於發酵培養基，30°C發酵23_72小時，通氣量3-5L/min， 攪拌速度為120-600rpm，培養24-72小時，測得其角蛋白酶的最高酶活達30. 3U/mL ；終止發 酵，過濾或離心菌體，得到蛋白酶粗酶液。所述的發酵培養基，每IOOmL含葡萄糖lg、羊毛粉2. 0g、乾酪素0. 2g、KCl 0. 0373g、NaCl 0. 0294g、吐溫 800. 4g、磷酸氫二鈉 0. 4g、磷酸二氫鉀 0. 03g, pH 7. 4-7. 8。所述的蛋白酶粗酶液在pH 6. 5-8. 0，5°C -30°C酶活穩定。本發明的蛋白酶粗酶液用於羊毛織物抗氈縮處理。本發明的蛋白酶複合酶由微生物產生，可為胞外酶，也可為胞內酶；該酶具有蛋白 酶活性，同時具有二硫鍵還原酶活性。本發明蛋白酶粗酶液用於羊毛織物抗氈縮處理工藝步驟如下，其粗酶液酶原液或 稀釋2-10倍，放入毛或毛織物，浴比為1 20-40，pH為7. 0-8. 0，溫度為20_35°C，作用時 間為30分鐘至4小時。所述反應的最適作用pH為7. 6，最適作用溫度為30°C。所述蛋白酶粗酶液低溫乾燥後處理毛織物時酶溶解濃度為0. 1-0. 5%。蛋白酶活性測定方法在0.05mol/L pH 10的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝溶液中，將 ImL待測樣品溶液與ImL酪蛋白溶液在40°C恆溫水浴鍋中反應lh，加入2. OmL 10% TCA 終止反應。IOOOg離心lOmin。取ImL上清液，加入0. 5mL Folin-Ciocalteau酚試劑，在 660nm下測定吸光度。反應前即加TCA處理用作對照。酶活定義=A66tl值每增加0. 1為1個 單位⑶。二硫鍵還原酶活性測定方法lmL由待測樣品溶液、0. lmol/L pH8的磷酸緩衝溶 液和蒸餾水按3 2 5比例混合組成的酶混合液與ImL 2mmol/L溶解於pH 7的磷酸緩衝 溶液中的氧化型穀胱甘肽，5mmol/L苯甲基磺醯氟(PMSF)在40°C恆溫水浴鍋中反應20min。 IOOOg離心lOmin，取1. 5 μ L上清液，加入50 μ L 二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)，靜置2min後 於420nm下測定吸光度並計算巰基含量。酶對照為除了加入ImL pH 7的磷酸緩衝溶液取 代氧化型穀胱甘肽外，其餘按同樣的方式進行。1個單位(U) 二硫鍵還原酶活性相當於每毫 升酶在40°C下每分鐘釋放出1 μ mol巰基。有益效果(1)本發明分離出一株生產直接降解羊毛鱗片層角蛋白新型蛋白酶的細菌菌株， 並利用該菌株發酵產物處理羊毛織物；(2)本發明的菌株所產蛋白酶活性高，作用羊毛織物抗氈縮性能好，作用條件溫 和，穩定性也較好；獨立降解羊毛鱗片層，不需要傳統蛋白酶的前處理步驟，同時比傳統酶
4的另一個優點是不引起羊毛織物強度下降；能夠替代毛紡行業中現有的氯化-樹脂法，避 免其產生有機氯對環境影響。


圖1 3096-4菌株作用羊毛效果；a表示未處理對照，b表示處理48小時，c表示處 理72小時；圖2 3096-4菌株16S rRNA序列系統發育樹。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1新菌株假單胞菌3096-4(Pseudomonas sp. 3096-4)，已保藏在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號是=CGMCC No. 3888。菌種來源本菌種來源於上海市松江綿羊養殖場羊毛堆積地腐爛羊毛，具體分離 方法如下(1)富集取羊毛堆積地腐爛羊毛Ig於富集培養基(牛肉膏0.5g、蛋白腖lg、氯化 鈉0. 5 g，ρΗ7· 0 7· 6)中，於28°C、120轉/min恆溫培養48h ；再取其培養液2mL轉入富 集培養基2中，28°C，120轉/min進一步富集培養48h ；(2)初篩取終富集液IOOyL塗布於磷酸消解蛋白培養基平板，篩選出生長的單 菌落；(3)復篩將初篩得到的菌種分別點接於磷酸消解蛋白培養基平板和羽毛粉平板 培養基平板，於30°C下恆溫培養48h，對照觀察兩平板上的菌種生長，選定有效菌株；再將 有效菌株塗布於磷酸消解蛋白培養基平板，重複幾次做進一步的分離純化，最後獲得菌株 3096-4;所述有效菌株為在羽毛粉平板培養基上能與磷酸消解蛋白培養基平板生長一樣良 好的菌株；菌種鑑定(1)菌落形態觀察將菌株3096-4在牛肉膏蛋白腖平板上進行劃線分 離，於33°C下恆溫培養48h，觀察菌落的形狀、顏色、表面質地、菌落邊緣等並記錄；(2)菌體形態觀察將菌株3096-4製片，進行革蘭式染色後，用帶拍攝裝置的光學 顯微鏡觀察菌體的形狀、大小、及其特殊構造，並拍攝菌體染色照片；(4)分子鑑定①菌株DNA的提取方法A、取Iml細菌過夜培養液移至1. 5mL的Eppendorf管中，5000rpm離心10分鐘，去
上清液；B、立即加入600 μ L預熱的提取緩衝液，混勻後，65°C溫浴Ih ；C、冰浴冷卻(5分鐘)，加入600 μ L酚/氯仿(1 1)溶液，顛倒混勻後，靜置 IOmin,然後 12000rpm 離心 6min ；
D、上清轉移至另一個Eppendorf管中，加入等體積氯仿，靜置5min，12000rpm離心 5min ；Ε、取上清液，加入等體積異丙醇，沉澱DNA ；F、用玻棒撈出DNA沉澱，70%乙醇漂洗後，吸乾，溶解於500 μ LTE或重蒸水 中，_20°C保存；如DNA沉澱無法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉澱；②16S rRNA的基因擴增A、PCR 反應弓丨物 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGB、在冰上建立PCR反應體系IOX擴增緩衝液5yL引物(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCG) 各 50pmoldNTP各 200 μ moL/L模板 DNA0. 1 2 μ gTaq DNA 聚合酶IUMg2+1. 5mmol/L加雙或三蒸水至50mL94°C預變性 5min ；94°C變性 60sec ；55°C復性 30sec ；72°C延伸 90sec ；32 個循環， 72°C下延伸為雙鏈lOmin。最後將系統穩定在4°C。取3 μ L的PCR產物，在1 %的瓊脂糖凝 膠100V下電泳30min，電極緩衝液為0. 5 X TAE，然後用溴化乙錠(EB)染色檢驗擴增產物。 擴增產物由上海生工生物工程有限公司完成。(6)所得序列的分析序列同源性搜索使用Blast 進行在 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast) 中進行° 並應用 MEGA 4. 0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, version 4. 0) 對其進行分子進化系統發育樹分析，見圖2。粗酶液製備該菌株接種於含滅菌發酵培養基(每IOOmL含葡萄糖lg、羊毛粉 2. 0g、乾酪素 0. 2g、KCl 0. 0373g、NaCl 0. 0294g、吐溫 80 0. 4g、磷酸氫二鈉 0. 4g、磷酸二氫 鉀0.03g，pH 7.4-7.8)中，利用上海寶興生物工程公司發酵罐發酵，30°C，通氣量3L/min， 120-500rpm發酵培養48h ；終止發酵，過濾菌體，得發酵酶液，稀釋4倍，置毛織物，浴比為 1 20，30°C作用90分鐘，處理後水洗烘乾，測氈縮率為2. 7%。實施例2為了進一步增強假單胞菌3096-4發酵所產蛋白酶液工業實踐可應用性，本發明 將發酵液鹽析沉澱，乾燥後，再溶於緩衝液中，測定其抗氈縮效果。具體操作方法是單胞菌 3096-4發酵酶液加入30%硫酸銨，4°C放置5_12小時，離心，去掉上清，冷凍乾燥，備用。使 用時首先利用緩衝液(磷酸鹽緩衝液或Tris-HCl緩衝液，pH 7. 4-7. 8)，溶解為0. 5% (w/ ν)。處理羊毛布，浴比為1 30，30°C作用50分鐘，處理後水洗烘乾，測氈縮率為4.2%。
權利要求
一種降解羊毛鱗片層的假單胞菌3096 4(Pseudomonas sp.3096 4)CGMCC No.3888，其16S rRNA序列如下TTAATCGGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGAGTGAATTCATGACTGGGGGAAGTCGAACAAG
全文摘要
本發明涉及一種降解羊毛鱗片層的假單胞菌3096-4(Pseudomonas sp.3096-4)，保藏號為CGMCC No.3888，其16S rRNA序列見表1。本發明的菌株所產蛋白酶活性高，作用羊毛織物抗氈縮性能好，作用條件溫和，穩定性好；獨立降解羊毛鱗片層，不需要前處理步驟，不引起羊毛織物強度下降；能夠替代毛紡行業中現有的氯化—樹脂法，避免其產生有機氯對環境及人體健康影響。
文檔編號C12R1/38GK101935632SQ20101021651
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者周美華, 張興群, 曹張軍, 洪楓, 蔡少博, 黃錚華 申請人:東華大學