一種快速檢測核酸病毒的試劑盒的製作方法
2023-05-29 14:29:16 2
專利名稱：一種快速檢測核酸病毒的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速檢測核酸病毒的試劑盒。
背景技術：
中國有I億3千萬B肝病毒(HBV)攜帶者，4千萬C肝病毒(HCV)攜帶者，專家預測2010年我國將有100(Γ1500萬人愛滋病毒(HIV)攜帶者，這三種疾病為全球性疾患。血液是愛滋病，B肝及C肝的主要傳播途徑，保證輸血安全是控制這些疾病血液傳播的最有效的環節之一。縱觀現代採血、輸血發展歷程，各種血液安全政策的實施或是重大革新技術的應用，都能明顯降低因輸血造成傳染性疾病的傳播風險。雖然第3代的酶聯免疫檢測技術(ELISA)的應用已經能夠降低這一風險，但是感染HBV、HCV、HIV後，產生抗HBV、抗HCV、抗HIV的「窗口期」較長，在窗口期內用ELISA技術很有可能產生漏檢，所以國外從上世紀末開始就採用了核酸檢測(nucleic acid test, NAT)的方式來篩查血液,確保檢測的準確性。目前NAT技術主要是提高核酸探針的敏感性，從而提高檢測水平。主要分為兩種主要方法1)模板擴增技術主要有聚合酶鏈式反應(PCR)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、自主序列複製系統、連接酶鏈式反應等；2)信號放大系統，主要有分支DNA探針、3D DNA探針等。第一種模板擴增技術，需要用到相應的PCR儀或是螢光定量PCR儀，擴增所用的試劑基本依賴於國外幾個大公司的試劑盒產品，價格昂貴，先期投資較大，同時檢測時間長。與第二種方法比較，第一種模板擴增的方法還存在技術上的局限1)不論是Tag酶或是逆轉錄AMV酶都沒有3』 -5』核酸外切酶的活性，容易發生鹼基的錯配；2)引物3』端部分配對可導致非特異性的擴增，造成假陽性；3)外源性汙染也容易導致假陽性。而第二種方法核酸檢測信號放大方式則是通過增加標記探針的數量或增強標記物的信號強度來提高靈敏性，不存在擴增靶序列的問題，所以其反應迅速，重複性好，依託相應的檢測儀器，升級其檢測功能，其臨床應用潛力巨大。
發明內容
為了解決現有技術的不足，本發明提供一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，其原理是利用核酸檢測信號放大技術，依託相應的檢測儀器，利用同時標記有羅丹明染料和報告探針的脂質體，與經分離的血液樣本混勻，這樣脂質體和病毒核酸靶序列通過報告探針結合。然後混合血液樣本點滴於帶正電荷的尼龍膜上，根據毛細作用原理，血液樣本在膜上遷移，當移動至事先固定於尼龍膜上的捕獲探針時，脂質體-病毒核酸複合物通過與捕獲探針之間的鹼基互補作用，富集於捕獲探針區域，形成可分辨的紅色螢光斑點，通過測定吸光值大小，根據標準曲線獲得病毒核酸靶序列的含量。一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，該試劑盒包括帶正電荷的尼龍膜、報告探針、捕獲探針、預雜交液和雜交液；所述的報告探針是標記在包裹有磺醯羅丹明B的脂質體上。所述的包裹有磺醯羅丹明B脂質體的製備方法是精密稱取20. Omg蛋黃卵磷脂、、5.Omg磷脂醯乙醇胺、25. Omg膽固醇溶於20mL氯仿,加入4mL 125Pg/mL磺醯羅丹明B溶液，混合後水浴超聲5min，製成均勻的白色乳劑，40° C水浴中減壓蒸發至凝膠態，然後加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺醯羅丹明B脂質體混懸液，儲存於4° C冰箱中。報告探針標記包裹有磺醯羅丹明B的脂質體的方法是取合成的羧基修飾的DNA探針，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室溫靜置。加入I mL製備的脂質體溶液，混合，4°C下孵育。透析除去過量EDC，S-NHS和副產物脲。反應結束後4°C下離心，重複洗滌離心2次分離出遊離探針，收集沉澱脂質體重懸於HEPES緩衝液中備用。所述預雜交液配方為50%的去離子甲醯胺，5XSSC，0. 1% SDS, O. 1%BSA，0. 1%PVP，用PH7的PB調終體積；並加入鮭魚精DNA50 μ g/mL。使用時預雜交液放入沸水中IOmin後放入-20°C冰箱中迅速冷卻IOmin,備用。所述的雜交液配方為50%的去離子甲醯胺，5XSSC，0. 1%SDS, 5 X Denhardt, s, 1%葡聚糖，用蒸餾水調終體積，現用現配。應用本發明試劑盒快速檢測核酸病毒的時間可以在10分鐘內完成。
具體實施例方式本發明所提到的百分比都是質量體積比，即w/v (mg//mL)
SSC :檸檬酸緩衝液
SDS :十二烷基磺酸鈉 BSA :牛血清白蛋白 PB 磷酸鹽緩衝液。實施例一試劑盒的使用方法
(I)處理帶正電荷的尼龍膜首先剪成5X2cm大小，然後置於2XSSC中5min後取出，室溫乾燥。(2)用移液槍取200ng的捕獲探針，點樣於已經乾燥的尼龍膜上。(3)將尼龍膜放置於紫外交聯儀2min，將捕獲探針固定在尼龍膜上，然後在室溫條件下等待膜乾燥，使探針結合得更牢固。(4) 在培養皿中加入預雜交液2mL，然後將尼龍膜放入，將培養皿放置於脫色搖床上，並將脫色搖床放置於恆溫培養箱中，在42°C的條件下反應30min。(5)反應結束後，將尼龍膜取出，4°C保存。(6)提取血液中的核酸，並與標記上報告探針的內部包裹有磺醯羅丹明B脂質體混合，目的是讓病毒靶序列通過鹼基互補配對與報告探針結合。(7)在混合樣品中加入雜交液並點樣於固定好捕獲探針的尼龍膜上在毛細遷移作用下，探針和靶序列的複合體向前遷移。(8) IOmin後檢測固定捕獲探針處螢光信號的強度，從而定性定量分析所檢測病
毒核酸的含量。
實施例二 HBV病毒的快速檢測
I.探針的設計
利用BLAST軟體對其序列進行比對並獲得特異序列；利用軟體Primer Premier 5.0設計特異性高、Tm值接近、長度均一的寡核苷酸探針。捕獲探針的序列為5-CTTTCACTTTCTCGCCAACTTACA-3(SEQ ID No. I)
報告探針的序列為5-CTCTGCCAAGTGTTTGCTGACG-3 (SEQ ID No. 2)
2.脂質體的製備
精密稱取20. Omg蛋黃卵磷脂、5. Omg磷脂醯乙醇胺、25. Omg膽固醇溶於20mL氯仿,力口Λ 4mL 125Pg/mL磺醯羅丹明B溶液,混合後水浴超聲5min,製成均勻的白色乳劑,40° C水浴中減壓蒸發至凝膠態，然後加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺醯羅丹明B 脂質體混懸液，儲存於4° C冰箱中。3.脂質體上報告探針的標記
在40 μ L 20 μ M 5'端羧基修飾的報告探針中加入40 μ L EDC水溶液和S-NHS溶液，4°C靜置I h活化，然後加入到ImL脂質體溶液中，4°C孵育4 h後於4°C、20000 rpm下離心30 min,重複洗滌離心2次分離出遊離探針，收集沉澱脂質體重懸於HEPES緩衝液中備用。4.探針的固定
首先將帶正電荷的尼龍膜剪成5 X 2cm大小，然後置於2 X SSC中5min後取出，室溫乾燥，用移液槍取2ul50uM的捕獲探針，點樣於已經乾燥的尼龍膜上，將尼龍膜放置紫外交聯儀2min，將捕獲探針固定在尼龍膜上。5探針雜交
在培養皿中加入預雜交液2mL，然後將尼龍膜放入，將培養皿放置於脫色搖床上，並將脫色搖床放置於恆溫培養箱中，在42°C的條件下反應30min。提取病毒核酸加入雜交液以及報告探針標記的脂質體，反應lOmin，然後點樣於固定好捕獲探針的尼龍膜上在毛細遷移作用下，探針和靶序列的複合體向前遷移。6.信號檢測
IOmin後檢測固定捕獲探針點樣處螢光信號的強度，從而定性定量分析病毒含量。實施例三 HCV genotype I病毒的快速檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- CTGTCTACCACGGGGCCGGA -3 (SEQ ID No. 3)
報告探針的序列為5- GGAAATGGGCCGGGGCGAAA -3 (SEQ ID No. 4)。實施例四HCV genotype 2的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- AGCTACGCCCCCTGGGTCAG-3 (SEQ ID No. 5)
報告探針的序列為5- GCCGCGAGCTCGTCACACTT-3 (SEQ ID No. 6)。實施例五HCV genotype 3的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- CAAGTTCCCGGGTGGCGGAC -3 (SEQ ID No. 7)
報告探針的序列為5- TCCGACGCGCCTTGGGGATA -3 (SEQ ID No. 8)。實施例六HCV genotype 4的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- TTGCGTGCCCTGCGTGAGAG -3 (SEQ ID No. 9)
報告探針的序列為5- GGCGCCGTGGTCGGAATGAA -3 (SEQ ID No. 10)。
實施例七HCV genotype 5的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- GCCGTCATACCCGCGACAGG -3 (SEQ ID No. 11) 報告探針的序列為:5- TCCCTGTACGGCCCCTACGC -3 (SEQ ID No. 12)。實施例八HCV genotype 6的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- CGAGAAGCCAACGGCGTGGT -3 (SEQ ID No. 13) 報告探針的序列為5- CCATGCGCACCCCGTGTCAT -3 (SEQ ID No. 14)。實施例九HIVl的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- CTAGCAGTGGCGCCCGAACA -3 (SEQ ID No. 15) 報告探針的序列為5- AGCCGAGTCCTGCGTCGAGA -3 (SEQ ID No. 16)。實施例十HIV2的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在於
捕獲探針的序列為5- CAGACGGCTCCACGCTTGCT -3 (SEQ ID No. 17) 報告探針的序列為5- ACACCGAATGACCAGGCGGC -3 (SEQ ID No. 18)。權利要求
1.一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，該試劑盒包括帶正電荷的尼龍膜、報告探針、捕獲探針、預雜交液和雜交液；其特徵在於報告探針是標記在包裹有磺醯羅丹明B的脂質體上。
2.根據權利I所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特徵在於，包裹有磺醯羅丹明B脂質體的製備方法是精密稱取20. Omg蛋黃卵磷脂、5. Omg磷脂醯乙醇胺、25. Omg膽固醇溶於20mL氯仿,加入4mL 125Pg/mL磺醯羅丹明B溶液，混合後水浴超聲5min,製成均勻的白色乳劑，40° C水浴中減壓蒸發至凝膠態，然後加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺醯羅丹明B脂質體混懸液，儲存於4° C冰箱中。
3.根據權利2所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特徵在於，報告探針標記包裹有磺醯羅丹明B的脂質體的方法是取合成的羧基修飾的DNA探針，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室溫靜置；加入I mL製備的脂質體溶液，混合，4°C下孵育；透析除去過量EDC，S-NHS和副產物脲；反應結束後4°C下離心，重複洗滌離心2次分離出遊離探針，收集沉澱脂質體重懸於HEPES緩衝液中備用。
4.根據權利I所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特徵在於，預雜交液配方為50%的去離子甲醯胺，5 X SSC，O. 1% SDS, O. 1%BSA，0. 1% PVP，用pH7的PB調終體積，並加入鮭魚精DNA50y g。
5.根據權利I所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特徵在於，雜交液配方為50%的去離子甲醯胺,5 X SSC, O. 1%SDS, 5 X Denhardts, 1%葡聚糖,用蒸懼水調終體積。
全文摘要
本發明涉及一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，屬於生物技術領域。該試劑盒用夾心雜交法檢測核酸病毒，包括探針(報告探針和捕獲探針)的設計、脂質體上報告探針的標記、捕獲探針的固定、報告探針與靶序列的雜交、靶序列與捕獲探針的雜交、螢光信號的檢測等過程。本發明的試劑盒能夠實現定性定量快速檢測人體血液中的病毒，具有檢測快速、操作簡便、靈敏度高、低成本、準確度高等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102634611SQ20121014859
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月15日 優先權日2012年5月15日
發明者呂煒鋒, 李利潔, 鄒洪平, 高向東 申請人:中國藥科大學