透明生物物體的分析的製作方法

2023-05-29 16:51:51

專利名稱：透明生物物體的分析的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於至少一個透明生物物體的數字全息顯微術的觀測容器，用於 至少一個透明生物物體的數字全息顯微術的觀測容器蓋，以及用於通過數字全息顯微術分 析至少一個透明的生物樣品的方法。
背景技術：
對於關於諸如在人類、動物、植物和其他生物中細胞的生物物體的額外的和更準 確的信息存在永無止境的需求。細胞已通過光學顯微鏡研究了很長時間，諸如螢光、共焦和 相襯顯微術。但是，在使用螢光或共焦顯微鏡時，細胞必須被標記或者染色，並且所使用的 標記或染色對細胞具有潛在毒性作用，細胞可能受到影響並從而擾亂細胞的發育。此外，標 記隨著時間的推移可能被漂白，這使得實質時間範圍內對細胞發育的研究變得困難。當使 用螢光顯微鏡時，焦平面還必須機械地設置，這可能隨著時間扭曲，例如由於周圍環境中溫 度變化。此外，使用共焦顯微鏡，一次只照亮一點以實現所需要的2或3維圖像掃描。在許多情況下，重要的是能夠研究活細胞，而沒有用有毒標記或染色影響細胞和 細胞發育的危險。相襯顯微鏡(Phase contrast microscopy)使在不需要標記的情況下研 究活的細胞成為可能。然而，相襯顯微鏡不允許對所研究的物體的相移，這意味著它是難以 量化分布區或細胞的厚度。焦平面的機械設定的缺點也適用於相襯顯微鏡。此外，由於所 研究的物體通常有一個不規則的上表面，焦平面從一點到另一點不同。因此，不可能在一個 圖像中實現物體的所有部分的清晰圖像。必須產生具有焦平面變化設置的幾個圖像，以實 現該物體的所有部分的銳利視覺效果。尤其是如果所研究的物體有突起，一個圖像的清晰 度會不滿意，因為突起不會在同一焦平面。數字全息顯微術使在不需要標記或染色的情況 下的活細胞研究成為可能，並且使所研究的物體的量化成為可能。由於數字傳感器和計算 機迅猛發展，數字全息顯微鏡的可能性在近幾年中增加。一種通過數字全息顯微鏡研究細 胞的方法在WO 2007/073345中披露，其中披露用於分析細胞的發展階段的方法以及用於 啟用分析的設備。細胞樣品被保存在標準型的細胞培養容器中。然而，全息圖的質量，並且 因而由該方法和裝置實現的信息的準確性是有限的。因此，仍然需要改良的技術，這將導致 具有高品質的全息圖和關於所研究物體的真實信息。

發明內容
一個本發明的目的是提供關於透明生物物體的準確的相位和振幅信息。這個準確 的信息可以採用以產生透明生物物體的高解析度全息圖像。這個和進一步的目的通過用於數字全息顯微術的觀測容器實現，觀測容器物體第 一保持裝置和第二保持裝置，其中，所述第一次保持的裝置包括第一外表面和第一內表面， 所述第二保持裝置包括第二內表面和第二個外表面，其中，所述第一和第二內表面被設置以保持包括至少一個透明生物物體和至少一 種介質的樣品並且接觸所述樣品。
這個觀測容器可以使生物物體可視。在不需要費時又費錢的標記或染色物體的情 況下顯影是可能的。因此，觀測容器使活體細胞以及諸如細胞生長的細胞發育的研究成為 可能。觀測容器還可以以小的樣品量進行研究。特別地，這個觀測容器使降低意外幹擾率、 低水平噪音、關於透明生物物體的準確的相位和振幅信息、以及生物學物體的高解析度圖 像成為可能。根據本發明的觀測容器的其他特徵和實施方式披露在隨後的從屬權利要求2-10中。上述目的還通過用於數字全息顯微術的包括第一保持裝置的觀測容器蓋來實現， 其中，所述第一保持裝置包括第一外表面和第一內表面。其中，所述第一內表面被設置以浸入包括至少一個透明生物物體和至少一種介質 的樣品中並且要接觸所述樣品。這個觀測容器蓋實現生物物體的可視。在不需要費時又費錢的標記或染色物體的 情況下可視是可能的。因此，觀測容器蓋使活體細胞以及諸如細胞生長的細胞發育的研究 成為可能。觀測容器蓋還可以以小的樣品量進行研究。特別地，這個觀測容器蓋使降低意 外幹擾率、低水平噪音、關於透明生物物體的準確的相位和振幅信息、以及生物學物體的高 解析度圖像成為可能。根據本發明的觀測容器蓋的其他特徵和實施方式披露在隨後的從屬權利要求 12-18 中。上述目的也通過用於通過數字全息顯微術分析的包括至少一個透明的生物物體 和至少一種介質的樣品的方法實現，其中，所述樣品保持在如任何一個相關權利要求限定 的觀測容器中，或者位於如任何一個相關權利要求限定的觀測容器蓋的下方，其中所述樣 品與所述第一內表面接觸並且，如果存在所述第二內表面，所述樣品與所述第二內表面接 觸，所述方法包括步驟a)產生至少一個物體光束和至少一個基準光束，其中所述至少一個物體光束和所 述至少一個基準光束相互相干；b)使所述至少一個物體光束通過所述第一內和外表面並且如果存在第二內和外 表面，使所述至少一個物體光束通過所述第二內和外表面，並且因而使所述樣品暴露於所 述至少一個物體光束；c)疊加已經通過所述樣品的所述至少一個物體光束與所述至少一個基準光束，並 且因而產生幹涉圖案；d)檢測所述幹涉圖案，所述幹涉圖案稱為全息圖；和e)從所述幹涉圖案重構物體波陣面的相位和/或振幅信息。這種方法實現了對生物物體的可視。在無需標記或染色該物體的情況下可視化是 可能的，標記或染色費時又費錢。該方法是非破壞性的，因為所分析的物體不被該分析影 響。該方法能夠研究活體細胞以及諸如細胞生長的細胞發育。該方法還能夠確定細胞狀 態，諸如形狀、密度、體積和活力(活細胞的比例)以及在細胞周期的階段。該方法還可以 研究小樣品量物體。該方法是一個全領域的技術，其中樣品在無需掃描區域的情況下進行 分析。此外，這種方法意味著能夠保存所取得的數據，並且以後在另外的環境或在其他時間 進行數據研究和處理。可以研究幾個焦平面而無需相對不同的焦平面機械地設置。相反，可以通過處理所取得的數據來研究不同焦平面。因此，可以獲得三維圖像。特別地，這個方 法實現了低的不良幹擾率、低水平噪聲、關於透明生物物體的準確的相位和振幅信息以及 生物物體的高解析度的全息圖像。根據本發明的方法的其他功能和實施方式在隨後從屬權 利要求20-23中披露。


可以結合附圖從下面的詳細說明中更充分地理解本發明。圖1是根據本發明的觀測容器實施方式的示意圖。圖2是通過透明的生物物體之前和之後的物體光束的波陣面示意圖。圖3是根據本發明的觀測容器的實施方式的透視圖。圖4是根據本發明的觀測容器的另一個實施方式的透視圖。圖5是圖4中所示實施方式的側視圖。圖6是根據本發明的觀測容器蓋的實施方式的頂視圖。圖7是在圖6所示實施方式的側視圖。
具體實施例方式如圖1所示，根據本發明的觀測容器包括第一保持裝置1和第二個保持裝置2。第 一保持裝置1包括第一外表面Ia和第一內表面lb。第二保持裝置包括第二內表面加和第 二外表面2b。第一內表面Ib和第二內表面加被設置以保持樣品並且與樣品接觸，樣品包 括至少一個透明的生物物體3和至少一種介質4。此外，圖1顯示物體光束5及其與第一保 持裝置1和第二保持裝置2的關係。在根據本發明的方法的一個實施方式中，通過將源自相干光源的光束分成兩個光 束(例如通過分束器)產生光的相互相干的至少一個物體光束和至少一個基準光束。源自 相干光源的光束可以是雷射束。雷射束可以源自任何類型的雷射源，諸如633nm波長的氦 氖(He-Ne)雷射發射光。物體光束和基準光束是相互相干的，這意味著它們具有相同的頻率並且在時間進 程期間顯示恆相關係。物體光束通過第一內表面和第一外表面，然後通過至少一個生物物體，光束然後 通過第二內表面和第二外表面，或者如果根據本發明的觀測容器蓋與其他類型容器結合， 則通過該容器的底部的內表面和外表面。由於基準光束例如通過反射鏡或光纖被導向與物 體光束不同的其它路徑，基準光不受至少一個生物物體的影響。該樣品保持在第一和第二內表面之間。如圖2所示，該物體光束在通過包括至少一個透明的生物物體3的樣品之前具有 已知波陣面(wavefront) 11。當物體光束通過至少一個透明生物物體時，生物物體實質上不 吸收任何光線，但是與周圍介質相比，穿過生物物體的光線將經歷的光路長度不同。從生物 物體呈現的波陣面，目標波陣面12因此將相移，其如圖2所示。當然，基準光束也有已知的 波陣面。光路的長度限定為物理/幾何厚度乘以折射率。在根據本發明的方法的一個實施方式中，已通過包括至少一個透明的生物物體的 至少在一個物體光束和至少一個基準光束的疊加通過將兩個光束帶到一起而實現，例如通過另一個分束器。這種疊加出現幹涉圖案，幹涉圖案例如包括有關受到至少一個生物物體 影響的目標波陣面的信息。在根據本發明的方法的實施方式中，幹涉圖案由諸如CCD或CMOS的數字傳感器檢 測。檢測到的幹涉圖案被稱為全息圖。為了疊加了已通過包括至少一個透明的生物物體的樣品的至少一個物體光束和 至少一個基準光束，並且因而產生幹涉圖案和檢測幹涉圖案，例如傅立葉裝置或菲涅爾裝 置可能會被使用。優選地使用菲涅爾裝置。目標波陣面的信息從檢測到的幹涉圖案相和/或振幅重構。重構工作通過常用重 構程序執行。振幅信息可被用來設置所需的焦平面。重構後的信息，例如可用於獲取所研 究的至少一個生物物體的2或3維圖像。該信息例如也可能被用於確定至少一個生物物體 的形狀和光學密度，並且當研究一個或多個細胞時也被用於確定細胞周期中的階段。作為用於產生一個物體光束和一個基準光束的備選方案，可以使用同軸數字全息 術。在研究本說明書時，如何修改本發明的方法以便使用同軸數字全息術對於本領域技術 人員是顯然的。在傳統的系統中，其中樣品存放在一個開放的容器中而沒有任何第一保持裝置， 具有樣品的自由面。這個自由面不會是平坦的，將由於周圍地面或設備的振動和/或在周 圍的空氣運動而總振動。樣品表面的不規則和震動會引起對於物體光束的不規則散射和噪 聲，從而導致低質量全息圖和不準確的相位和振幅信息。根據本發明的樣品與第一內表面 接觸(如果存在也與第二內表面接觸)的事實意味著對樣品的表面始終與第一內表面(如 果存在也與第二個內表面)一樣平坦。此外，樣品表面的振動被消除。從而，物體光束的散 射和噪聲降低。因此，發現全息圖的質量得到改善，並且因而也改善了相位和振幅信息的準 確性。根據本發明的樣品與第一內表面接觸(如果存在也與第二內表面接觸)的事實意 味著至少一個物體光束通過的不同材料之間的界面數減少。在樣品僅與第二內表面或另一 種類型的容器的相應內表面接觸的系統中，並且其中在樣品的表面和第一內表面之間有空 間(由空氣或其他介質填充)，物體光束穿過第一保持裝置和該空間之間的界面，還穿過該 空間和樣品之間的界面。此外，在這樣一個系統中，冷凝物通常會在第一內表面上，這進一 步增加了物體光束穿過的界面的數量，由於物體光束然後在穿過空間和樣品之間的界面之 前，穿過第一保持裝置和冷凝物之間的界面和冷凝物與該空間之間的界面。在本發明中，相 反地，物體光束穿過的第一保持裝置和樣品之間的界面，這消除了至少一個(一般為兩個) 幹涉通道。從而內部幹擾源被消除，從而降低了物體光束的散射和噪音。因此發現全息圖 的質量和相位和振幅信息的準確性被改善。此外，與開口容器相同的問題適用於該系統，使 本發明更有利。樣品表面的誤差和振動的消除，以及用於物體光束的界面通道的數量的減少，對 於本發明相關的改進非常重要。這些改進降低了散射，並且因而相當大地降低物體光束的 噪音。從而，不受歡迎的內部幹擾明顯減少。誠如上文所披露，幹涉圖案包括有關目標的波 陣面的信息。優選地，如圖2顯示，目標波陣面僅被透明的生物物體影響，而不被用於確定 目標波陣面的裝置影響。如果存在，設備的影響會引起不希望的內部幹擾。偽像，即由所使 用的設備引起的錯誤和扭曲，通過以上改善而減少。因此，通過這些改進，相位和振幅信息的準確性大大提高。根據本發明的一個實施方式，當至少一個物體光束通過一個或多個第一內表面和 外表面和如果存在第二內表面和外表面時，減少或消除所產生的反射。當光束為了通過該 界面針對不同材料之間界面入射時產生的反射散射光線，並且從而噪聲被加到全息圖。反 射的減少或消除降低了散射光量。這減少內部幹擾。因此，噪聲被降低，從而全息圖的質量 和相位和振幅信息的準確性得到提高。反射的減少或消除也增加了通過保持裝置或者至少 一個生物物體的所期望的路徑傳輸的光量。在一個實施方式中，通過至少第一內表面和外 表面，如果存在，第二內表面和外表面被抗反射處理，反射被減少或消除。表面的抗反射處 理是降低當物體光束穿過第一內表面和外表面(如果存在，第二內表面和外表面)時產生 的反射的有效方式。這種反射的減少提高了全息圖的質量以及相位和振幅信息的準確性。 在一個實施方式中，通過第一外表面和如果存在第二外表面中的至少一個被防反射處理， 反射被減少或消除。優選地，第二個外表面被防反射處理。當第一外表面和/或第二外表 面，特別是當第二外表面，被防反射處理時，該反射在很大程度上被減少，導致了全息圖的 質量有較大改善，並且從而改善相位和振幅信息的準確性。在一個實施方式中，防反射表面 處理通過在表面上塗層實現，優選地，通過塗覆幹涉防反射塗層。在本發明的一個實施方式中，第一和第二個內表面相互平行。利用平行表面，觀測 容器的幾何形狀的本身簡單並且已知。光束的光路因此更容易預測。因此，理論表達式和 計算變得方便。根據本發明的一個實施方式，第一保持裝置和第二保持裝置(如果存在)的至少 一個的至少部分地可滲透氣體，諸如氧氣和/或二氧化碳。這可以使諸如細胞的生物物體 存活所必需的氣體被運送進入樣品，從而有可能在充實的時間期間研究一個或多個活細 胞。它也可能在觀測容器中保持和生長細胞，並且在不同時間研究細胞，而不必從在數字全 息顯微術過程使用的容器和在細胞的發育或生長過程中使用的容器轉移該細胞。在本發明的一個實施方式中，第一保持裝置至少部分地由玻璃製造，由於玻璃的 使用增強了保持裝置的光學特性。玻璃作為一種無定形的材料，通常在其組成部分沒有任 何特定方向的情況下製造，從而玻璃非偏振。用於生產塑料的製造工藝，諸如擠壓和壓縮成 型，通常會影響其組成部分的定向，從而塑料材料偏振通過該材料的光束。通過由塑料製成 的保持裝置的物體光束將因而被偏振引起以引起不必要的內部幹擾。非偏振玻璃不會引起 偏振，並且因而提高了全息圖的質量和相位和振幅信息的準確性。此外，由於玻璃是一種光 學上有利的材料，可以製造出非常平坦的表面，當通過由玻璃製造的第一保持裝置時，物體 光束的散射將進一步減少。因此，全息圖的質量和相位和振幅信息的準確性得到提高。據本發明的一個實施方式，第二個保持裝置至少部分地由塑料製成。當使用塑料 時有可能實現保持裝置的滲透性，因為塑料可以製成可滲透氣體。在本發明的一個實施中，第一和第二內外表面的至少一個包括圖案，用於相對針 對第一外表面入射的光束(即至少一個物體光束)定位觀測容器的或觀測容器蓋。這種圖 案可能是諸如線條或點的格柵或者指南針卡樣的標記。這種圖案使觀測容器或觀測容器蓋 每次放置在其被分析的同一地點。既然由於定位圖案，相同的生物物體每次容易定位，這意 味著通過在不同的時間處分析生物物體，可以在長時間段內的研究相同的至少一個生物物 體。根據本發明的方法的一個實施方式包括觀測容器或觀測容器蓋關於至少一個物體光束定位的步驟，優選地通過定位圖案，該步驟在步驟b之前執行。這個步驟可以在步驟a之前 或者之後執行，優選地在步驟a之後執行。圖案優選地位於第一內表面和外表面(如果存 在，在第二內和外表面)的至少一個上或其中。根據本發明的一個實施方式，觀測容器或觀測容器蓋包括減少或消除生物物體的 出現的至少一個基準點。第一內表面和第二內表面(如果存在)的至少一個，優選地是第二 次的內表面，通常被處理以促進諸如細胞的生物物體的附著。促進細胞附著的處理可以通 過增強細胞親和性而實現，通過用帶正電的聚合物(如聚賴氨酸)塗覆表面，或暴露表面到 等離子處理。減少或消除生物物體的出現的基準點可以從而通過從表面的一個或多個點的 處理的排除或刪除而實現。這些點可以布置在諸如網格的圖案中。該基準點有利於基準的 確定。優選地，消除了生物物體的出現，從而不受至少一個生物物體影響的光的相位和振幅 是已知的，這意味著用於不受生物物體影響的光的零水平是已知的。這可以應用在分析的 計算中，其從而得到簡化。這也意味著，分析的質量得到提高。不受生物物體影響的關於零 水平的光的信息能夠確定生物物體的高度，因為在沒有這個信息的情況下，只可能獲得高 度的相對測量。根據本發明的方法的一個實施方式包括確定不受至少一個生物物體影響的 光的相位和/或振幅的步驟，優選地，通過減少或消除生物物體的出現的至少一個基準點， 這個在步驟e後執行。優選地，至少一個基準點消除生物物體的出現。在本發明的一個實施方式中，觀測容器或觀測容器蓋包括至少一個校準基準。這 個校準基準的尺寸本身可以是已知的，並且因此為長度的比例的設置提供便利。從而可以 使用校準基準以確定所分析的至少一個生物物體的尺寸。這有利於生物物體的發育的研 究，諸如細胞的生長。校準基準的高度可以已知，並且因此能夠校準相移。通常情況下，介 質的折射率是已知的，但校準基準意味著在不知道介質的折射率的情況下能夠分析樣品， 因為分析的計算可以基於校準基準的已知尺寸。在一個實施方式中，至少一個校準基準位 於至少在第一內外表面和第二內外表面(如果存在)之一上。在一個實施方式中，至少一 個校準基準是至少一個標記，諸如直線、劃痕或半球。校準基準也可以是分隔開已知距離的 兩個或兩個以上標記，諸如半球的格柵。該標記的尺寸(諸如線、劃痕或半球的長度，半球 和/或格柵的半球之間的距離的高度)本身也已知。在觀測容器或觀測容器蓋的製造期 間，校準基準可以獲得，例如通過使用具有凹槽和凸起的模具，通過固定物體到觀測容器或 觀測容器蓋，或通過在觀測容器或容器蓋子中形成劃痕。該方法的一個實施方式包括校準 長度比例的步驟，優選地，通過至少一個校準基準，該步驟在步驟e之後執行。優選地，用於定位觀測容器或觀測容器蓋的圖案和校準基準相結合。例如，用於定 位的圖案的部分或全部可以用作校準基準，反之亦然。通過透明的生物物體是指光線可通過生物物體傳播，但生物物體可以包括吸收部 分，諸如細胞器。生物物體可以是，諸如細胞、花粉粒、精子、玻片培養物、組織塗片或活組織 檢查樣品。在一本發明實施方式中，至少一個透明生物物體是至少一個細胞。優選地，至少 在一個透明的生物物體是至少有一個活細胞。要分析樣品包括至少一個透明生物物體和至少一種介質。至少一種介質可以是流 體，並且優選地是培養基，諸如細胞培養介質。試樣應與第一內表面接觸和第二內表面接觸 (如果存在)，即，介質和/或生物物體與第一內表面接觸和第二個內部表面接觸(如果存 在)。通常，介質與這些表面接觸，而生物物體可以在兩個表面之間的任何地方，例如，在第一和第二內表面之間懸浮，或者位於第一內表面上或第二內表面上。優選地，至少一個透明 生物物體位於第二內表面上。根據本發明的一個實施方式，觀測容器包括盒子，優選地，長方體形狀，樣品存放 在其中。第一和第二保持裝置於是可以是盒子的兩個相對側。如果物體光束從上面入射，第 一保持裝置是盒的頂部並且第二保持裝置是盒的底部。如果物體光束是從下面入射，第一 保持裝置是盒的底部及第二保持裝置是盒的頂端。如果物體光束從側面入射，第一保持裝 置是盒的一個橫向側而第二保持裝置是相對的橫向側。很明顯，盒可以設置有圓角、圓邊、 倒角，凹槽和/或其他幾何變體。在一個實施方式中，盒具有一個或多個開口，例如，用於連 接盒的內腔與一個或多個容器，用於大量儲存的樣品，其中只有部分樣品被分析。該容器有 利於在相當的時間內研究活體生物物體，由於介質的體積可以足夠大，以為生物物體的存 活提供活體生物物體所需要的營養物質。這些開口可以衝洗樣品或介質通過觀測容器，並 且然後包括至少一個透明生物物體或介質的樣品在所述第一和第二內表面之間流動。觀測容器的一個實施方式包括圖3中顯示的長方體形式的盒子，其中示出第一保 持裝置1、第二保持裝置2和開口 6、7。在另一個實施方式中，觀測容器包括圓柱體，優選地，具有平坦底部和平坦頂部， 樣品保持在圓柱體中。如果物體光束從上面入射，第一保持裝置是圓柱體的頂部和第二個 保持裝置是圓柱體的底部。如果物體光束從下面入射，第一保持裝置是圓柱體的底部和第 二保持裝置是圓柱體的頂部。很明顯，圓柱體還可以設置有圓邊、倒角、凹槽和/或其他幾 何變體。在一個實施方式中，圓柱體具有一個或多個開口，例如，用於連接圓柱體的內腔與 一個或多個容器，用於大量儲存的樣品，並且其中只有部分樣品被分析。該容器有利於在相 當時間內研究存活的生物物體，由於介質的體積可以足夠大，以為生物物體的存活提供活 體生物物體所需要的營養物質。這些開口可以衝洗樣品或介質通過觀測容器，並且然後包 括至少一個透明生物物體或介質的樣品在所述第一和第二內表面之間流動。在一個實施本發明，所述第一和第二保持裝置之一可從另一個中拆卸。在一個實 施方式中，可拆卸的保持裝置浸入所述樣品。當第一保持裝置可從第二保持拆卸時，第一保 持裝置可以是根據本發明的觀測容器蓋子的部分。在本發明的進一步實施方式中，觀測容器包括一個底部，具有底側和一個或多個 橫向壁，形成碗形的容器，優選地，具有平坦底側。在這個實施方案中，觀測容器還包括具 有底側的頂部，優選地具有平坦底側，其頂部可從底部拆卸。頂部和/或底部還可以包括， 用於相對底部布置頂部從而頂部的底側浸入要進行分析的樣品的裝置，該樣品保持在底部 中。如果物體光束從上面入射，第一保持裝置是頂部的底側，而第二保持裝置是底部的底 側。如果物體光束從下面入射，第一保持裝置是底部的底側，第二保持裝置頂部的底側。優 選地，底部的底側是圓形的，從而底部僅包括一個(圓形)壁。在一個實施方式中，上部的 底側遠小於底部的底側，這意味著，上部的底側僅接觸樣品表面的部分。因此，樣品的表面 的部分暴露到外界空氣，能夠為所研究的至少一個生物物體(諸如一個或多個細胞)提供 體所研究的生物物體存活所必需的氣體，而不用使用可透氣的保持裝置。在圖4和5中，顯示包括可從底部8拆卸的頂部9的觀測容器的一個實施方式。頂 部9包括第一保持裝置1，並且底部8包括第二保持裝置2，從而第一保持裝置1可從第二 個保持裝置2拆卸。頂部9包括用於相對底部8布置頂部9的裝置10，從而第一保持裝置1浸入意圖存儲在底部8中的樣品之中。根據本發明的觀測容器蓋可以被放到標準的細胞培養容器的底部的頂側上，然後 該容器的底部包括表示並且視為第二保持裝置。代表第二保持裝置的標準細胞培養容器的 部分應該是透明的，至少用於通過這部分的光的波長，即，光的物體光束。標準細胞培養容 器可以是，比如說，一個皮氏(Petri)培養皿。在根據本發明的觀測容器蓋的一個實施方式中，觀測容器蓋包括用於相對標準細 胞培養容器的底部布置觀測容器蓋的裝置，以使觀測容器蓋的第一保持裝置浸入將被分析 的樣品中，該樣品保持在標準細胞培養容器的底部中。在根據本發明的觀測容器蓋的實施方式中，觀測容器蓋的第一保持裝置大致小於 標準細胞培養容器的內底表面，這意味著觀測容器蓋的第一保持裝置與樣品的表面的部分 接觸。因此，樣品的表面部分暴露到外界空氣，能夠為所研究的至少一個生物物體，諸如一 個或多個細胞，提供所研究的生物物體存活所必需的氣體，而不用使用可透氣的保持裝置。在根據本發明的觀測容器蓋的實施方式中，第一內表面平行於標準細胞培養容器 的底部的內底表面。通過使用平行表面，包括觀測容器蓋的單元和標準細胞培養容器的幾 何形狀簡化並且本身已知。光束的光路因此更容易預測。因此，理論表達和計算便利。在根據本發明實施方式的觀測容器蓋中，觀測容器蓋可以是在圖4和5所示的觀 測容器的實施方式的頂部9。在一個實施方式中，觀測容器蓋包括多個第一保持裝置，其中每個第一保持裝置 包括第一外表面和第一內表面，其中，每個第一內表面被設置以浸入包括至少一個透明生 物物體和至少一種介質的樣品中並且與將與樣品接觸。這個觀測容器蓋可以放在標準孔細 胞培養板的底部的頂側上，該底部然後包括代表和用作多個第二保持裝置的部分。標準孔 細胞培養板可能是，比如說，6孔細胞培養板、M孔細胞培養板或96孔細胞培養板。包括這 種多個第一保持裝置的實施方案顯示在圖6和7中。該觀測容器蓋包括第一保持裝置1。 該觀測容器蓋還包括用於相對標準孔細胞培養板布置觀測容器蓋的裝置10，以使每個第一 保持裝置浸入意圖存儲在標準孔細胞培養板的配合孔的樣品中。第一內表面和第二內表面之間的距離優選地是大到足以容納將被分析的至少一 個透明生物物體。當細胞將被分析時，第一內表面和第二內表面之間的距離有利地至少達 到一個細胞的尺寸。至少在第一和第二保持裝置的部分處，其中物體光束通過第一和第二內和外表面 傳輸以暴露樣品到物體光束，第一和第二保持裝置至少對於通過第一和第二內表面和外表 面的光的波長(即光的物體光束)是透明的。根據本發明的一個實施方式，觀測容器包括在所述第一和第二保持的裝置之間的 外殼，樣品保存在該外殼中。外殼可以有一個或多個開口，例如，用於連接外殼與一個或多 個容器，用於存儲大量樣品，並且其中只有部分樣品被分析。該容器有利於在相當時間內研 究活體生物物體，由於介質的體積可以足夠大以為活體生物物體提供生物物體的存活所需 要的營養物質。這些開口也可以衝洗樣品或介質通過觀測容器，並且然後包括至少一個透 明的生物物體或介質樣品在第一和第二內表面之間流動。本申請全文的「第一和第二內和外表面」的表達是指第一內表面、第一外表面、第 二內表面和第二外表面。
類似地，通過「第一和第二內表面」表示第一內表面和第二內表面，通過「第一和第 二外表面」表示第一外表面和第二外表面，通過「第一內和外表面」表示第一內表面和第一 外表面，並通過「第二內和外表面」表示第二內表面和第二外表面。
權利要求
1.一種用於數字全息顯微術的觀測容器，其包括第一保持裝置和第二保持裝置，其中， 所述第一保持裝置包括第一外表面和第一內表面，並且所述第二保持裝置包括第二內表面 和第二外表面，其中，所述第一和第二內表面被設置以保持包括至少一個透明生物物體和 至少一種介質的樣品並且接觸所述樣品。
2.根據權利要求1所述的觀測容器，其中所述第一和第二內和外表面中的至少一個被 抗反射處理。
3.根據權利要求1或2所述的觀測容器，其中所述第一和第二內表面彼此平行。
4.根據上述任何一項權利要求所述的觀測容器，其中所述第一保持裝置和第二保持裝 置的至少一個至少部分地能夠滲透氣體。
5.根據上述任何一項權利要求所述的觀測容器，其中所述第一保持裝置和第二保持裝 置的一個能夠與另一個拆開。
6.根據權利要求5所述的觀測容器，其中能夠拆開的保持裝置能夠浸入所述樣品中。
7.根據上述任何一項權利要求所述的觀測容器，其中所述第一和第二內和外表面中的 至少一個包括圖案，用於相對於入射在所述第一外表面上的光束定位所述觀測容器。
8.根據上述任何一項權利要求所述的觀測容器，其中所述觀測容器包括減少或者消除 生物物體的出現的至少一個基準點。
9.根據上述任何一項權利要求所述的觀測容器，其中所述觀測容器包括至少一個校準 基準。
10.根據上述任何一項權利要求所述的觀測容器，其中所述至少一個透明生物物體是 至少一個細胞。
11.一種用於數字全息顯微術的觀測容器蓋，其包括第一保持裝置，其中，所述第一保 持裝置包括第一外表面和第一內表面，其中，所述第一內表面被設置以浸入包括至少一個 透明生物物體和至少一種介質的樣品並且接觸所述樣品。
12.根據權利要求11所述的觀測容器蓋，其中所述第一內和外表面中的至少一個被抗 反射處理。
13.根據權利要求11或12所述的觀測容器蓋，其中第一保持裝置至少部分地能夠滲透 氣體。
14.根據權利要求11-13中的任何一項權利要求所述的觀測容器蓋，其中所述第一內 和外表面中的至少一個包括圖案，用於相對於入射在所述第一外表面上的光束定位所述觀 測容器蓋。
15.根據權利要求11-14中的任何一項權利要求所述的觀測容器蓋，其中所述觀測容 器蓋包括減少或者消除生物物體的出現的至少一個基準點。
16.根據權利要求11-15中的任何一項權利要求所述的觀測容器蓋，其中所述觀測容 器蓋包括至少一個校準基準。
17.根據權利要求11-16中的任何一項權利要求所述的觀測容器蓋，其中所述至少一 個透明生物物體是至少一個細胞。
18.根據權利要求11-17中的任何一項權利要求所述的觀測容器蓋，其中所述蓋包括 多個第一保持裝置，其中每個第一保持裝置包括第一外表面和第一內表面，其中，每個所述 第一內表面被設置以浸入包括至少一個透明生物物體和至少一種介質的樣品並且接觸所述樣品。
19.一種通過數字全息顯微術分析包括至少一個透明生物物體和至少一種介質的樣品 的方法，其中所述樣品保持在根據權利要求1-10中的任何一項所述的觀測容器中或者位 於根據權利要求11-18中的任何一項所述的觀測容器蓋下方，其中所述樣品與所述第一內 表面接觸並且，如果存在所述第二內表面，所述樣品與所述第二內表面接觸，所述方法包括 步驟a)產生至少一個物體光束和至少一個基準光束，其中所述至少一個物體光束和所述至 少一個基準光束相互相干；b)使所述至少一個物體光束通過所述第一內和外表面並且如果存在第二內和外表面， 使所述至少一個物體光束通過所述第二內和外表面，並且因而使所述樣品暴露於所述至少 一個物體光束；c)疊加已經通過所述樣品的所述至少一個物體光束與所述至少一個基準光束，並且因 而產生幹涉圖案；d)檢測所述幹涉圖案，所述幹涉圖案稱為全息圖；和e)從所述幹涉圖案重構物體波陣面的相位和/或振幅信息。
20.根據權利要求19所述的方法，其中當所述至少一個物體光束經過所述第一內和外 表面中的一個或多個時並且如果存在所述第二內和外表面，當所述至少一個物體光束經過 所述第一內和外表面和所述第二內和外表面中的一個或多個時發生的反射被減少或者消除。
21.根據權利要求19或20所述的方法，還包括相對於所述至少一個物體光束定位觀測 容器/觀測容器蓋的步驟，該步驟在步驟b之前執行。
22.根據權利要求19-21中的任何一項權利要求所述的方法，還包括確定不被至少一 個生物物體影響的光的相位和/或振幅的步驟，該步驟在步驟e之後執行。
23.根據權利要求19-22中的任何一項權利要求所述的方法，還包括校準長度比例的 步驟，該步驟在步驟e之後執行。
全文摘要
本發明涉及一種用於至少一個透明生物物體的數字全息顯微術的觀測容器，用於至少一個透明生物物體的數字全息顯微術的觀測容器蓋，以及用於通過數字全息顯微術分析包括至少一個透明的生物樣品和至少一種介質的樣品的方法。
文檔編號G01L3/00GK102067046SQ200980122819
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月17日 優先權日2008年6月19日
發明者倫納特·伊塞爾松, 安娜·默爾德, 米卡埃爾·謝拜什陶 申請人:相位全息成像技術公司