利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法

2023-05-29 16:53:16

專利名稱：利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物工程技術領域的檢測方法，具體地涉及一種利用 特異基因序列鑑別對藥用靈芝的檢測方法。
背景技術：
對於藥用靈芝的檢測，傳統的鑑定方法主要是依靠形態學鑑定，主要是靈芝子 實體的形、色、氣、味、質地等外觀性狀觀察，該方法簡便、直接，缺點是主觀性 強，其準確性完全取決於檢驗者的經驗判斷，且難以鑑定加工炮製後的碎片或粉末 藥材。目前較多的是從生物分類學(基原鑑定)、組織學(顯微鑑定)、化學(理 化鑑定)角度建立了相對比較客觀的檢測標準；同時，隨著科學技術的發展，細胞 學、酶學(同工酶分析)、生物化學(蛋白質分析及效價評價)、血清學(免疫測 定)等生物技術亦逐漸應用到靈芝鑑定中來。分子生物學研究發現，中藥(不含礦 物類)所依賴的生物資源一 "物種"的多樣性是由於其基因(核苷酸序列)多態性 的結果，而基因(核苷酸序列)多態性可在分子水平上檢測，它比在形態、組織和 化學水平上檢測更能代表中藥的遺傳變異。
以個體間遺傳物質內核苷酸序列的變異為基礎進行個體的鑑別方法稱為分子標 記 (Molecular Genetic Markers) 或分子診斷技術 (DNA-Based Diagnostic Techniques)，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種標記一形態學標記、 生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有明顯的優越性分子標記揭示 來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測 手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，現在DNA分子標記技術已有數十種， 廣泛應用於遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關係鑑別、基因庫構建、 基因克隆等方面。利用特異基因序列進行鑑別是分子標記的一種新的類型，他是基 於PCR和(或)限制性酶切技術的DNA標記，他能反映生物個體或種群間基因組中 某種差異的特異性。基於PCR技術的基本原理是利用鑑別物種已知的DNA序列，通 過比對，找出每一個物種特有的DNA序列，設計出一套特異性的PCR引物(19-27bp)，
然後用這一引物擴增出該物種的一段特異的DNA序列，凝膠電泳，染色並對條帶進 行分析。此方法揭示的是特異片段的有和無的信息。基於PCR和限制性酶切技術的 DNA標記是利用鑑別物種的特徵序列(如與此物種功能相關的基因)，設計出一對 特異性的PCR引物(19-27bp)，然後用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接 著用一或兩種專一性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段， 染色並對條帶進行分析。此方法揭示的是特異片段的限制性長度變異的信息。
經對現有技術文獻的檢索發現，蘇春麗、唐傳紅、張勁松、潘迎捷，文章名稱 基於e-微管蛋白基因部分序列探討靈芝屬菌株的親緣關係(菌物學報，2006，25(3): 439 445)，研究者利用e-微管蛋白基因部分序列對靈芝屬菌株的親緣關係進行了 探討，利用特徵序列進行物種的鑑別是一種較新的分子標記技術，在藥用靈芝的鑑 別研究中，利用此特異序列可對樹舌亞屬、紫芝組和靈芝組之間的菌株進行鑑別。 但上述文章涉及的技術不能區分靈芝組內的菌株。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種利用特異基因序列鑑別藥 用靈芝的檢測方法，本發明利用PCR擴增、序列測定和(或)限制性內切酶酶切技 術對藥用或食用靈芝菌株、原藥材，精粉，切片、孢子粉以及破壁孢子粉特異基因 序列(真菌免疫調節蛋白基因的編碼區和非編碼區序列)進行鑑定，以獲得藥用靈 芝特異的序列特徵和電泳檢測圖譜。
本發明是通過以下技術方案實現的
本發明具體包括如下步驟-
(1) 購回的市售藥用靈芝菌株，保藏和培養；
放在4℃冰箱保藏，每3 5個月更換一次培養基。將斜面菌株放至28℃活化 24h，挑取斜面試管菌種的菌絲接至PDA固體培養基平板上，28℃恆溫培養7d。用 接種鏟將lcm2左右的平板菌種接至YPS液體培養基，並搗碎。28℃， 120rpm震蕩培 養。
(2) 將培養好的藥用靈芝菌絲體經洗滌沉澱，研磨成粉末狀； 將培養好的菌絲體10， OOOg離心10min，去上清，加入PBS緩衝液洗滌沉澱三次，用液氮將洗滌好的菌絲體研磨成粉末狀。
(3) 藥用靈芝DNA的提取和純化；
(4) 藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產物的電泳檢測和限制性內切酶 酶切產物的電泳檢測；
(5) 從藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異性條帶，通過進一步 的序列測定和酶切電泳，發現差異，利用差異進行鑑別；
(6) 從藥用靈芝菌絲中可分別擴增出580bp、 495bp和836bp的特異性條帶， 通過電泳檢測，發現差異，利用差異進行鑑別，判定檢測結果。
根據所使用特異引物的不同分三個層面進行結果判定①選用特異引物(FIPA 和FIP B)從所選藥用靈芝菌絲中均能擴增出大約336bp的特異性條帶，通過序列 比對，發現差異，利用序列差異進行初步鑑別，判定檢測結果；②選用特異引物 (FIPGLUF和FIPGLUR、 FIPGSIF和FIPGSIR、 FIPGTSF和FIPGTSR)可分別從藥用靈 芝的不同種中擴增出大小不同的特異性條帶(580bp、 495bp、 836bp)，通過電泳檢 測，發現差異，利用電泳條帶大小和有無進行鑑別，判定檢測結果；③選用特異引 物(FIPGF和FIPGF)從所選藥用靈芝菌絲中均能擴增出大約721bp的特異性條帶， 通過限制性內切酶酶切產物的電泳檢測，發現電泳條帶的差異，利用條帶差異進行 鑑別，判定檢測結果。
所述的藥用靈芝，包括赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)、松杉 靈芝(G. tsuage)。
步驟(3)中所述的藥用靈芝DNA的提取和純化，採用高鹽低pH提取法提取基因 組DNA，包括(並不限於)以下步驟
① 經液氮研磨的樣品(大約lg)放入65。C預熱的提取緩衝液，放入65。C水浴保 溫30min,不時緩慢振搖，室溫下10，000Xg離心10min;
② 在上清液中加入2/3體積的KAc高鹽溶液，混勻後置於(TC保持30min以沉澱蛋 白質；
③ 在4'C下10，000Xg離心10min，棄蛋白質沉澱。上清液加入等體積的氯仿/異 戊醇(24/1)抽提，在6，000Xg離心10min，取出水相轉入另一離心管，
如果中間層仍有白色沉澱，則再用氯仿/異戊醇(24/1)抽提一次；
④ 在上清液中加入2/3體積的預冷異丙醇，混勻後置於—2(TC靜置30min，以沉 澱核酸，可以重複一次，用70%乙醇清洗沉澱，在空氣中乾燥50min，將DNA沉澱溶 解在合適體積的TE緩衝液中，分裝存放於-2(TC或4'C冰箱中保存。
步驟(3)中藥用靈芝DNA的檢測，採用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法進行檢測， 包括以下步驟
① 取10ul DNA溶液，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電泳成像系統分析結 果及攝取圖像。
② 吸光值的測定提取的DNA經50倍稀釋後，於紫外可見分光光度計上測定其 濃度和純度。
所述步驟(4)藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產物的電泳檢測和限制 性內切酶酶切產物的電泳檢測，是通過以下三部分內容來實現的 第一部分藥用靈芝特異基因序列的測定，包括以下步驟 所述的藥用靈芝特異基因的序列測定，包括以下步驟-
① 引物的設計
上遊引物FIP A: 5， -ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3，，
下遊引物FIP B: 5， -CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3，；
② PCR擴增
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25ul，單位(ul):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa) 0. 25
10XPCR Buffer 2. 5
dNTP Mix (2.5 mM) 2.0
MgCl2 (25mM) 1.5
■ 0.5
FIP A (10 u M) 0. 5
FIP B (10 uM) 0.5
PCR-Grade Water 17. 25
總體積 25
PCR程序95。C變性5min,(95。C變性30sec, 6(TC退火30sec， 72。C延伸 40sec)共進行35個循環，72°C延伸10min。反應結束後取5 w L產物電泳檢測。 ③PCR擴增片段的回收、連接
使用膠回收試劑盒回收片段(按膠回收試劑盒的步驟操作)。
採用T-A系統將DNA片段與pMD 18-T載體連接，反應體系如下，總體積10 u 1， 單位(Ul):
pMD18-T VectorDNA 1 回收片斷 1連接溶液I5無菌水3總體積 10
反應條件16°C， 30min以上。連接好的片段可用於轉化。
④ PCR擴增片段的轉化
感受態細胞的製備在工作平板上挑取DH5 a單菌落接種到20-30mL無抗生素 的LB培養基中，在240-260rpm搖床中37。C搖菌至OD6。。=0. 5 (約6 8h);取出菌液 與0. 1M CaCl2同時置於冰浴中15~30min;在滅菌的超淨臺上取1.5mL菌液於 1.5mL-EP管中，4。C5000 8000rpm離心5 min收集菌體；用移液器吸去上清，並用 500uL冰冷的0.1M CaCL重懸菌體；離心後用移液器儘可能吸去上清，用200uL 冰冷的0. 1M CaCl2重懸菌體，置冰浴過夜備用。
轉化採用常規的分子生物學方法進行轉化。將10u 1連接片段與100y 1感受 態細胞混合；放置冰上，30min; 42。C水浴放置90sec;放置冰上1-2min;加入800 u 1 LB培養液，在搖床(37°C， 200rpm)中培養lh;取100u 1溶液均勻塗在LB平板 上(含Amp， X-gal， IPTG);培養箱(37°C)中培養過夜。
⑤ 陽性菌落的鑑定
取白色菌落用菌落PCR法或轉化質粒的酶切鑑定陽性菌落。
⑥ 序列測定。
第二部分藥用靈芝赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝 (G. tsuage)特有基因序列PCR擴增產物的電泳檢測。
所述的赤靈芝(G. lucidum)特有基因序列的PCR擴增產物的電泳檢測，包括 以下步驟
① 引物的設計(primer design)
FIPGLUF: 5' - GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3'
FIPGLUR: 5' - CGCTATGCCATACCCGGAGTTG -3'
② PCR擴增(PCR amplification )
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25ul，單位(ul):Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa)0. 25
10XPCR Buffer2.5
dNTP Mix (2. 5 mM)2. 0
MgCl2 (25mM)1.5
DNA0. 5
FIPGLUF (10 wM)0.5
FIPGLUR (10 pM)0.5
PCR-Grade Water17.25
總體積25
PCR程序:95℃ 變性5min，(95℃ 變性30sec, 60'C退火30sec, 72。C延伸 40sec)共進行35個循環，72°C延伸10min。反應結束後取5 u L產物電泳檢測。
③電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產物lOy l，在1XTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染 色後，用凝膠成像系統觀察電泳條帶和拍照。
所述的紫芝(G. sinense)特有基因序列的PCR擴增產物的電泳檢測，包括以 下步驟
① 引物的設計(primer design)
FIPGSIF: 5'- GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3' FIPGSIR: 5' - ACCCCMCAGGTTCGTCGACAACG-3'
② PCR擴增(PCR amplification)
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25pl，單位(ul):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa)0.25
10乂PCR Buffer2. 5
dNTP Mix (2. 5 mM)2.0
MgCl2 (25mM)1.5
DNA0.5
FIPGSIF (10 uM)0. 5
FIPGSIR (10 yM)0.5
PCR-Grade Water17.25
總體積25
PCR程序95。C變性5min, (95。C變性30sec， 60。C退火30sec， 72℃ 延伸 40sec)共進行35個循環，72°C延伸10min。反應結束後取5 u L產物電泳檢測。
③電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產物10μl，在1XTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色後，用凝膠成像系統觀察電泳條帶和拍照。
所述的松杉靈芝(G. tsuage)特有基因序列的PCR擴增產物的電泳檢測，包括以下步驟
① 引物的設計(primer design)
FIPGTSF: 5'- TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC -3'
FIPGTSR: 5' - AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA -3'
② PCR擴增(PCR amplification)
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25μl，單位(μl):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa) 0. 25
10XPCR Buffer 2.5
dNTP Mix (2.5 mM) 2.0
MgCl2 (25mM) 1.5
DNA 0.5
FIPGTSF (10 μM) 0. 5
FIPGTSR (10 μM) 0.5
PCR-Grade Water 17.25
總體積25
PCR程序95。C變性5min,(95℃變性30sec, 60℃退火30sec, 72℃延伸 40sec)共進行35個循環，72℃延伸10min。反應結束後取5 μ L產物電泳檢測。
③電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產物10 μl，在1 XTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色後，用凝膠成像系統觀察電泳條帶和拍照。
第三部分藥用靈芝特異基因序列的PCR擴增產物的限制性內切酶酶切的電泳檢測；包括以下步驟
①引物設計(primer design)
FIPGF: 5' -CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3，
FIPGR: 5，- CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3，
②PCR擴增(PCR amplification)
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25ul，單位(ul):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa) 0. 25
10XPCR Buffer2. 5
dNTP Mix (2. 5 mM) 2.0
MgCl2 (25mM) 1.5
DNA 0. 5
FIPGF (10 uM)0.5
FIPGR (10 uM)0. 5
PCR-Grade Water 17. 25
總體積25
PCR程序95。C變性5min,(95。C變性30sec, 60。C退火30sec, 72。C延伸 40sec)共進行35個循環，72°C延伸10min。反應結束後取5 u L產物電泳檢測。
③ 電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產物lOix l，在1XTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染 色後，用凝膠成像系統觀察電泳條帶和拍照。
④ PCR產物的回收(recovering PCR products)
使用膠回收試劑盒回收片段(按膠回收試劑盒的步驟操作)。
⑤ 酷切(enzyme cleaving)
在1. 5mL-EP管中加入下列試劑，總體積25iU，單位(u 1):
膠回收片斷 5
10X buffer 5
100XBSA 1
酶(Acc III or Ava II) 1
ddH20 8
總體積 20
混勻後在37。C (Ava II)或60。C (Acc III)酶切過夜。取酶切產物10ul， 在IXTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色後，用凝膠成像系統 觀察電泳條帶和拍照。
步驟(5)中所述的從所選藥用靈芝菌絲中均能擴增出大約336bp的特異性條帶，是指以提取的靈芝菌絲DNA為模板，使用上遊引物FIP A和下遊引物FIP B，進 行標準程序的PCR擴增，從藥用靈芝(包括赤靈芝G. lucid咖、紫芝G. sinense 和松杉靈芝G. tsugae)菌絲中均能擴增出大約336bp的特異性條帶。
步驟(5)中所述的通過序列比對，發現差異，利用序列差異進行初步鑑別，是 指在克隆出赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae) 336bp特異基因序列基礎上，通過測序後進行序列比對，發現赤靈芝(G. lucidum) 和松杉靈芝(G. tsugae)這336bp特異基因序列沒有差異，而兩者與紫芝(G. sinense)的336bp特異序列有差異，利用這些差異可以進行赤靈芝(G. lucidum)、 松杉靈芝(G. tsugae)和紫芝(G. sinense)的鑑別。
步驟(5)中所述的利用電泳條帶大小和有無差異進行鑑別，是指通過步驟(3) DNA的提取和純化的實施，應在電泳圖上顯示提取的DNA樣品沒有降解；通過步驟(4) 的實施從電泳圖譜上能觀察到從所選三種藥用靈芝中均能擴增出大小不同的特異性 條帶，通過觀察電泳圖譜上擴增條帶的大小和有無來進行鑑別；引物FIPGLUF和 FIPGLUR是用來擴增赤靈芝(G. lucidum)的特異引物，可擴增得到大約580bp的的 特異性條帶；引物FIPGTSF和FIPGTSR是用來擴增松杉靈芝(G. tsugae)的特異引物， 可擴增得到大約836bp的特異性條帶。引物FIPGSIF和FIPGSIR是用來擴增紫芝(G. sinense)的特異引物，可擴增得到大約495bp的特異性條帶。
步驟(5)中所述的利用條帶差異進行鑑別，是指將從所選藥用靈芝菌絲中擴 增出的大約721bp的特異性條帶分別用限制性內切酶Acc III (T*CCGGA)進行酶切， 從赤靈芝(G. lucidum)和松杉靈芝(G. tsugae)種來的721bp的特異性條帶，酶 切產物電泳時顯示出大約442 bp和270 bp兩個條帶，從紫芝(G. sinense)種來的 721bp的特異性條帶，酶切產物電泳時顯示出大約721bp的一個條帶；同時將擴增得 到的這個721bp的特異性條帶分別用限制性內切酶Ava11 (G*GWCC)進行酶切，從紫 芝(G. sinense)種來的721bp的特異性條帶，酶切產物電泳時顯示出大約402 bp， 48 bp和262 bp的三個條帶(由48bp條帶太小，不宜被看清，故主要通過判斷402bp 和262bp兩個條帶的有無來進行鑑定)。從赤靈芝(G. lucidum)和松杉靈芝(G. tsugae)種來的721bp的特異性條帶，酶切產物電泳時顯示出大約721bp—個條帶。
本發明利用特異基因序列對三種靈芝— 一赤靈芝(Ganodermalucidum)、紫芝 (Ganaderma sinensis)和松杉靈芝(Ganoderma tsuage)進行鑑別，能夠有效地
確定藥用靈芝的分類地位，對藥用靈芝產品原料藥的來源鑑定提供了簡單、快速、 準確的鑑別方法，為靈芝藥用產品的研發和臨床應用使用劑量的確定奠定了基礎， 為中藥加快現代化的步伐。
本發明所涉及的菌種來源於中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(CGMCC)，其簡稱和保藏編號、保藏單位名稱具體如下
所述的赤靈芝(Ganoderma lucidum)來源於中國普通微生物保藏管理中心 (China General Microbiological Culture Collection Cente英文縮寫CGMCC), 編號AS 5.65;保藏單位廣東省微生物研究所菌種保藏中心(Microbiological Culture and Collection center of Guangdong Institute of Microbiology) 保 藏編號GIM 5.9;
所述的紫芝(Ganaderma sinensis)來源於中國農業微生物菌種保藏管理中心 (Agricultural Culture Collection of China英文縮寫ACCC )編號51332;
所述的松杉靈芝(Ganoderma tsuage)來源於中國普通微生物保藏管理中心 (China General Microbiological Culture Collection Center英文縮寫CGMCC) 菌種編號:5.0542。
具體實施例方式
以下結合實驗室具體的試驗數據對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以 本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保 護範圍不限於下述的實施例。
下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規條件或按照製造廠商所建 議的條件。
實施例1
利用特異基因序列進行藥用靈芝菌種的鑑定。 1.菌絲體的培養(culture the mycelia)
靈芝(G.lucidum)菌種，來源於廣東省微生物研究所菌種保藏中心MCCGM (GIM 5.11， GIM 5.250， GIM 5.251， GIM 5.257， GIM 5.259)、中國農業微生物 菌種保藏管理中心(ACCC) (50088)、華中食用菌栽培研究所(南韓靈芝)、上 海農科院食用菌研究所(紅靈芝)、黑龍江科學院應用微生物研究所(韓國靈芝)、四川省農科院土壤肥料所(靈芝)、山東農業大學(泰山靈芝)。購回的菌株的培 養、保藏具體操作步驟同本發明步驟(1)的具體內容。
2. 菌絲體的準備(preparation the mycelia) 菌絲體的準備的具體操作步驟同本發明步驟(2)的具體內容。
3. 菌絲體基因組DNA提取(extractiontheDNAofmycelia) 選取高鹽低pH提取法提取基因組DNA，具體操作步驟同本發明步驟(3)的
具體內容。
4. DNA的檢測(detection of DNA)
採用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法進行檢測，具體操作步驟同本發明步驟(4) 的具體內容。
5. 弓l物設計(primer design)
根據我們的實施方案設計五對引物，引物FIP A和FIP B對、引物FIPGLUF和 FIPGLUR對、引物FIPGTSF和FIPGTSR對、引物FIPGSIF和FIPGSIR對、引物FIPGF和FIPGR 對。引物序列同本發明步驟(5)、 (6)的具體內容。
6. PCR擴增(PCR amplification)
反應程序94。C變性5min後，按照94。C變性30sec; 60。C退火30sec; 72°C， 延伸40sec進行35個循環，最後在72'C延伸10min。
7. PCR產物的電泳檢測(electrophoresis detection)
PCR產物在1XTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色後，用凝 膠成像系統拍照。
使用引物FIPA和FIPB對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense) 和松杉靈芝(G. tsugae)三個藥用靈芝的特異基因序列，在電泳圖上可見大約336bp 的特異性條帶；使用引物FIPGLUF和FIPGLUR對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)特 有的基因序列，在電泳圖上可見大約580bp的特異性條帶；使用引物FIPGTSF和 FIPGTSR對可擴增出松杉靈芝(G. tsugae)特有的基因序列，在電泳圖上可見大約 836bp的特異性條帶;使用引物FIPGSIF和FIPGSIR對可擴增出紫芝(G. sinense) 特有的基因序列，在電泳圖上可見大約495bp的特異性條帶；使用引物FIPGF和 FIPGR對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae) 三個藥用靈芝的特異基因序列，在電泳圖上可見大約721bp的特異性條帶。
在電泳圖譜上可根據三對引物的擴增結果進行鑑定。弓l物FIPGLUF和FIPGLUR 對只能將屬於赤靈芝(G. lucidum)種的基因序列進行擴增，在電泳圖上可見大約 580bp的特異性條帶；而不能將非赤靈芝(G. lucidum)的種進行擴增；引物FIPGTSF 和FIPGTSR對只能將屬於松杉靈芝(G. tsugae)種的基因序列進行擴增，在電泳圖 上可見大約S36bp的特異性條帶；而不能將非松杉靈芝(G. tsugae)種的基因序列 進行擴增；引物FIPGSIF和FIPGSIR對只能將屬於紫芝(G. sinense)種的基因序 列進行擴增，在電泳圖上可見大約495bp的特異性條帶；而不能將非紫芝(G. sinense)種的基因序列進行擴增。
8. 序列測定(sequence determination)
將從赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae)三 個藥用靈芝種中擴增到的大約336bp的的特異性條帶，膠回收、連接和克隆後進行 序列測定。可根據測定出的序列與實施方案中測定的序列是否相同進行鑑別。
9. 酶切產物的電泳檢測(Electrophoresis of enzyme cleaving)
將從赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae)三
個藥用靈芝種中擴增到的大約721bp的特異性條帶分別用限制性內切酶Acc III (T氺CCGGA)進行酶切，從赤靈芝(G. lucidum)和松杉靈芝(G. tsugae)種來721bp 特異序列，酶切產物電泳時顯示出大約442 bp和270 bp兩個條帶，而從紫芝(G. sinense)種來的721bp特異序列，酶切產物電泳時顯示出大約721bp的一個條帶； 或將擴增到的這個721bp的特異性條帶分別用限制性內切酶Ava II (6*6\￥(:0進行 酶切，從紫芝(G. sinense)種來的721bp特異序列，酶切產物電泳時顯示出大約 402 bp, 48 bp和262 bp的三個條帶。由48bp條帶太小，不宜被看清，故主要通 過判斷402bp和262bp兩個條帶的有無來進行鑑定。從赤靈芝(G. lucidum)和松 杉靈芝(G. tsugae)種來的721bp特異序列，酶切產物電泳時顯示出大約721bp 一個條帶。根據酶切條帶的大小進行鑑別。
實施例2
利用特異基因序列進行赤靈芝(G. lucidum)子實體(切片和精粉)、孢子粉 (破壁和未破壁)的鑑定 1.基因組DNA提取
選取高鹽低pH提取法提取基因組DNA，具體操作步驟同本發明步驟(3)的具體內容。
2. DNA的檢測
採用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法進行檢測，具體操作步驟同本發明步驟(4) 的具體內容。
3. 引物設計
根據我們的實施方案設計五對引物，引物FIP A和FIP B對、引物FIPGLUF和 FIPGLUR對、弓1物FIPGTSF和FIPGTSR對、弓|物FIPGSIF和FIPGSIR對、弓|物FIPGF和FIPGR 對。引物序列同本發明步驟(5)、 (6)的具體內容。。
4. PCR反應
反應程序94℃變性5min後，按照94。C變性30sec; 60℃退火30sec; 72°C， 延伸40sec進行35個循環，最後在72℃延伸10min。
5. PCR產物的電泳檢測
PCR產物在1XTAE電泳緩衝液下經1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色後，用凝 膠成像系統拍照。
使用引物FIP A和FIP B對可擴增出以赤靈芝(G. lucidum)子實體(切片和 精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)來源的材料的特異基因序列，在電泳圖上可見大 約336bp的特異性條帶；使用引物FIPGLUF和FIPGLUR對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特有基因 序列，在電泳圖上可見大約580bp的特異性條帶；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR對 和引物FIPGSIF和FIPGSIR對均不能擴增出以赤靈芝來源的(G. lucidum)子實體 (切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特有基因序列，在電泳圖譜上沒 有特異性條帶出現；使用引物FIPGF和FIPGR對可擴增出以赤靈芝(G. lucidum) 來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特異基因序列，在 電泳圖譜上可見大約721bp的特異性條帶。在電泳圖譜上可根據這五對引物的擴增 結果進行判定。
6. 序列測定
將從以赤靈芝(G. lucidum)來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和 未破壁)材料的中擴增到的大約336bp的特異性條帶，膠回收、連接和克隆後進行序列測定。可根據測定出的序列與實施方案中測定的赤靈芝(G. lucidum)序列是 否相同進行鑑別。
7.酶切產物的電泳檢測
將從赤靈芝(G. lucidum)來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未 破壁)中擴增得到的大約721bp的特異性條帶用限制性內切酶Acc III (T*CCGGA) 進行酶切，酶切產物電泳時顯示出大約442 bp和270 bp兩個條帶，或將擴增到的 這個721bp的特異性條帶使用限制性內切酶Ava II (G*GWCC)進行酶切，酶切產 物電泳時顯示出大約721bp —個條帶。根據酶切條帶的大小進行鑑別。
本發明涉及的序列及記號分列如下-
(1) 一種編碼赤靈芝(G./W"WWm)免疫調節蛋白基因的核酸，其特徵在於具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 SEQ ID NO. 1的信息 (i)序列特徵
(A) 長度1078bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(i i)分子類型核苷酸
(i i i)序列描述:SEQ ID NO. 1
〈110>上海交通大學
利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法
〈160〉 3
Patentln version 3.1
1
〈211〉 1078
DNA
〈213>赤靈芝(G. lucidum)
1
cgtatgcaccctggtttacatcatcgtgaaacggcgctccggttgccgtataaaaggacg60
gcsaaggcggccagtggacttcagcacctgctcttgtacccacttctagtaagtcgcata120
ccacctctcctgacagcgacaggttcactgactagttcatagtccacagctctttgccta180
caatcaaggtttgccgacaccctctttgagccctcccccttcaataaccc cctaacttct240
gccccgcagcatcatgtccgacactgccttgatcttcaggctcgcctgggacgtgaagaa300
gctctcgttcgactacaccccgaactggggccgcggcaaccccaacaacttcatcgacac360
tgtcaccttcccgaaagtcttgaccgacaaggcgtacacgtaccgcgtcgccgtctccgg420
acggaacctcggcgtgaaaccctcgtacgcggtcgagagcgacggctcgcagaaggtcaa480
cttcctcgagtacaactccgggtatggcatagcggscacgaacaggatccaggtgttcgt540
tgtcgaccccgacaccaacaacgacttcatcatcgcccagtggaactaggaggaggcagt600
gactgacccctggcggtctaatctgcgggccactgtgggggaggggcatcgcccatcagc660
ttccttgtctcataatcatgcccgtgtagcaattgtaaatcgaccttgttgtaacatgca720
tccagcttttgtggtgtgccgtcttatgtttggttgaatgcgtcagcctatcaaagctag780
cttagggctaggtgggtcgccgtcggccgcgttcaagccttcgggcgctcgtgtctttag840
tttgttatctactcaaatacttacttttgtaagagttactataaacccgattaaaatctg900
tttgttatctgatgattccgatctaatgaaaggctaccccttccgagtcactaatgggta960
ctttgagacaacgagcggaccgtcttggtatgagaataagcttcaagttacgactggcac1020
atatctacagcggataagacgattcgcatcacactatggaacattccgtctgatcgat1078
(2) —種編碼紫芝(《W'/76V7W)免疫調節蛋白基因的核酸，其特徵在於具有 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO. 2的信息
(i)序列特徵
(A) 長度:1072bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(i i)分子類型核苷酸 (i i i)序列描述:SEQ ID NO. 2
〈110〉 上海交通大學
利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法 〈160〉 3
〈170〉 Patentln version 3. 1 〈210〉 2 〈211〉 1072 〈212〉 DNA
〈213〉紫芝(《w'"e/7se) 〈400> 1
complex sequence see original document page 19
(3) —種編碼松杉靈芝(《"i^ae)免疫調節蛋白基因的核酸，其特徵在 於具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO. 3的信息 (i)序列特徵
(A) 長度1015bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(i i)分子類型核苷酸
(i i i)序列描述SEQ ID NO. 3
上海交通大學
〈120〉利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法
3
Patervtln version 3. 1
<210〉 3
〈211〉 1015 〈212〉腿
〈213〉松杉靈芝(C.""卵e)
1
atcgccatccataacc犯cgtctcaacccccg卿tggacgtcatctgga ggt已acgacc60
卿gcggtcttccggcaactgtggtctcg3卿cgtgaggcgtttacaaggttggacatc120
tcggggcaattctgccaaactcgc卿gagaatgtaccgccctatcacctccagtggtca180
gc鄉ggttgcattcaggtccacctgcggtgcagttcggttccctgtggcttgcagggcc240
tcgcacgtcgtatgcaccctggtttacatcatcgtgaaacgacgctccggttgtcgtsta300
a卿gscggca^鄉cggccagtgaacttcagcacctgctcttgtacccactcctagtaa360
gtcgcatacc3CCt3CC3CCtcaccctgaaagcgacgagtttactgacta gttcatagtc420
acagctctttgacttacaatcaaggtttgccgacaccctctttgagcgctcccccttcaa480taaccccctaacctctgccgcgcagcatcatgtccgacaccgctctgatcttcaggctcg540
cctgggacgtgaagaagctctcgttcgact3C3CCCCg犯ctggggccgcggcaacccca600
acaacttcatcgacactgtcaccttcccgaaagtcttgaccgac犯ggcgtacacgtacc660
gcgtcgccgtctccggacggaacctcggcgtgaaaccctcgtacgcggtcg卿gcgscg720
gctcgc3gaa^ggtcaacttcctcgagtacaactccgggtatggcatagcggacacgaaca780
cgstccaggtgttcgttgtcgaccccgacacc犯caacgacttcatcatcgcccagtgga840
ggC3gtg3Ctgacccctggcggtctaatctgcgggccactgtgggggagg■
ggcatcgcccatcagcttccttgtctcataatcatgcccgtggcggatgcgtacaatctc960
agcacgtagtgcatcatccttggggacataaactcggccgcgatagagaagc鄉101權利要求
1、一種利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)購回的市售藥用靈芝菌株，保藏和培養；(2)將培養好的藥用靈芝菌絲體經洗滌沉澱，研磨成粉末狀；(3)藥用靈芝DNA的提取和純化；(4)藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產物的電泳檢測和限制性內切酶酶切產物的電泳檢測；(5)從藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異性條帶，通過進一步的序列測定和酶切電泳，發現差異，利用差異進行鑑別；(6)從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、495bp和836bp的特異性條帶，通過電泳檢測，發現差異，利用差異進行鑑別，判定檢測結果。
2、 根據權利要求l所述的利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法，其特徵 是，步驟(3)中所述的藥用靈芝DNA的提取和純化，採用高鹽低pH提取法提取基因 組DNA，包括以下步驟① 經液氮研磨的樣品放入65'C預熱的提取緩衝液，放入65'C水浴保溫30min，不 時緩慢振搖，室溫下10,000Xg離心10min;② 在上清液中加入2/3體積的KAc高鹽溶液，混勻後置於0'C保持30min以沉澱蛋 白質；③ 在4。C下10，000Xg離心10min,棄蛋白質沉澱，上清液加入等體積的氯仿/異 戊醇抽提，在6，000Xg離心10min，取出水相轉入另一離心管，如果中間層仍有白色沉澱，則再用氯仿/異戊醇抽提一次； 在上清液中加入2/3體積的預冷異丙醇，混勻後置於一2(TC靜置30min，以沉 澱核酸，可以重複一次，用70%乙醇清洗沉澱，在空氣中乾燥50min，將DNA沉澱溶 解在合適體積的TE緩衝液中，分裝存放於—2(TC或4'C冰箱中保存。
3、 根據權利要求1所述的利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法，其特 徵是，步驟(5)中所述的從所選藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異 性條帶，設計了兩對引物序列- 第 1對FIP A : 5' -ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3， 和FIP B : 5， -CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3，；第 2 對FIPGF : 5'-CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3' 和 FIPGR: 5'-CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3，。
4、 根據權利要求1所述的利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法，其特 徵是，步驟(5)中所述的從所選的藥用靈芝菌絲中均能擴增出的336bp和721bp 的特異性條帶，是指以提取的藥用靈芝菌絲DNA為模板，使用引物FIPA和FIPB， 進行標準程序的PCR擴增，從藥用靈芝來源的赤靈芝、紫芝和松杉靈芝菌絲中均能 擴增出336bp大小的特異性條帶；使用引物FIPGF和FIPGR，進行標準程序的PCR 擴增，從赤靈芝、紫芝和松杉靈芝中也均能擴增出721bp大小的特異性條帶。
5、 根據權利要求1所述的利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法，其特 徵是，步驟(6)中所述的從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、 495bp和836bp的 特異性條帶，設計了三對引物序列第1對FIPGLUF: 5' - GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3'和FIPGLUR : 5'-CGCTATGCCATACCCGGAGTTG -3';第2對FIPGSIF : 5， - GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3'和FIPGSIR : 5'-ACCCCAACAGGTTCGTCGACAACG-3';第3對FIPGTSF: 5' - TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC -3'和FIPGTSR: 5，-AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA -3'。
6、 根據權利要求1所述的利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法，其特 徵是，步驟(6)中所述的從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、 495bp和836bp的 特異性條帶，是指以提取的藥用靈芝菌絲DNA為模板，使用引物FIPGLUF和FIPGLUR 只能從赤靈芝中擴增得到5S0bp大小的特異性條帶；使用引物FIPGSIF和FIPGSIR 只能從紫芝中擴增出495bp大小的特異性條帶；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR只能 從松杉靈芝中擴增出836bp大小的特異性條帶。
全文摘要
本發明是一種分子生物工程技術領域的利用特異基因序列鑑別藥用靈芝的檢測方法。包括如下步驟購回的市售藥用靈芝菌株，保藏和培養；將培養好的藥用靈芝菌絲體經洗滌沉澱，研磨成粉末狀；藥用靈芝DNA的提取和純化；藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產物的電泳檢測和限制性內切酶酶切產物的電泳檢測；從藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異性條帶，通過進一步的序列測定和酶切電泳，發現差異，利用差異進行鑑別；從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、495bp和836bp的特異性條帶，通過電泳檢測，發現差異，利用差異進行鑑別，判定檢測結果。本發明利用特異基因序列對藥用靈芝進行簡單、快速、準確的鑑別方法，為進一步研發和使用奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/68GK101200769SQ20071017077
公開日2008年6月18日 申請日期2007年11月22日 優先權日2007年11月22日
發明者周選圍, 唐克軒, 尹燡周, 李琦章, 娟 林 申請人:上海交通大學