枯草芽孢桿菌製劑的製作方法
2023-05-30 01:43:11
專利名稱:枯草芽孢桿菌製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及含枯草芽孢桿菌的製劑，特別是水質改良劑。
背景技術：
近年來，水產養殖業發展極其迅速，大規模集約化過程中大量使用抗生素及其它化學藥物，雖然達到了增產與抗病的目的，但長期濫用抗生素不僅會引起病原菌的抗藥性，而且水產品和水環境中抗生素的化學殘留直接威脅著人類的健康。抗生素的殘留已成為我國的水產品國際貿易的技術壁壘，令我國的水產品出口蒙受巨大的損失。近年來國家嚴格限制抗生素的使用，並積極尋求其替代品。
微生態製劑(或稱微生態調節劑microeclogical modulator)的使用已有百年的歷史，從二十世紀初梅切尼科夫(Elie Metchnikoff)在歐洲提倡飲用酸牛奶可健康長壽以來，微生態製劑在世界各地發展迅猛，二十世紀七十年代德國Volkor Rusch在赫爾本建立了微生態學研究所，並從事對雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌等活菌作生態療法的研究與應用。日本於80年代初已有26種微生態製品用於醫療和保健。其他各國亦有多種微生態製品投放市場，而且數量和品種亦在不斷擴大。我國最早使用微生態製劑乳酶生(乳桿菌)來防治腸道疾病。80年代初研製成功促菌生(蠟杆芽孢桿菌)以來，各種活菌微生態製劑相繼研製成功。如麗珠腸樂(雙歧桿菌)、整腸生(地衣芽孢桿菌)、三株口服液(雙歧桿菌、乳酸菌、DL菌活生物體及其代謝物)，並陸續投放市場。同時獸用微生態製劑如芽孢桿菌類、乳酸菌類和酵母菌類的微生態製劑研製成功並作為飼料添加劑被廣泛使用，1999年農業部規定了枯草芽孢桿菌等12種飼料級微生物添加劑(中華人民共和國農業部公告第105號 允許使用的飼料添加劑品種目錄)。
水產生物生活的水體環境是一個微生物的動態平衡系統，有益菌群和病原菌群共同生存，但由於環境汙染日益嚴重，養殖水體的水質惡化、致使病原菌大量繁殖，使得近年來水產養殖動物病害不斷發生，並呈暴發流行趨勢，危及魚蝦蟹貝藻鱉等幾乎所有的養殖動物。與此同時由於水產食品中的漁用藥物殘留及漁用藥物對水環境的影響，使得漁用藥物的使用受到嚴格控制。因此在80年代開始用微生態製劑作為漁用水質改良劑。但使用的種類主要為光合細菌、乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、噬菌蛭弧菌和複合EM菌群等(鯉微生態製劑及其製備方法 專利公開號CN1100271；微膠囊益生淨水複合菌修復水產養殖環境的方法 專利公開號CN1461734A；一種池塘養蝦的前期養水方法 專利公開號CN1460414A)。但用枯草芽孢桿菌作為漁用水質改良劑則鮮有報導。目前生產的漁用微生態製劑主要採用常規的深層液體發酵法，該法存在著生產成本高，只能以水劑劑型為主，固化困難等缺點。
發明內容
本發明要解決養殖水體水質因汙染而日益惡化以及目前漁用微生態水質改良劑品種較單一或者生產成本高、存在二次汙染、劑型固化困難等問題，為此提供本發明的一種枯草芽孢桿菌製劑，本改良劑能有效改良養殖水體水質，對魚類無毒性和致病性。
為解決上述問題，本發明枯草芽孢桿菌製劑採用的技術方案其特殊之處是以其重量為基準含有1.4～4.0％下述的發酵培養基固形物、86～90％下述的填充料和餘量的水，所述的製劑中枯草芽孢桿菌B115(Bacillus subtilis B115CGMCC No 1210)含量為1～100×108個/克；所述的發酵培養基固形物可以是豆餅粉、麩皮、玉米粉中的二種或三種的組合物；所述的填充料可以是礦粉、農作物桔杆籽粒粉或礦粉和農作物桔杆籽粒粉的組合物。礦粉和農作物桔杆籽粒組合物，兩者可以任何比例組合。
本發明所述的礦粉可以是沸石粉、膨潤土、麥飯石粉、陶土、高嶺土中的一種或二種以上的組合物，所述的農作物桔杆籽粒粉可以是礱糠粉、米糠、豆粕粉、麩皮、花生粕、菜粕、玉米芯粉中的一種或二種以上的組合物。
本發明中的枯草芽孢桿菌B115於2004年8月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為No1210。
枯草芽孢桿菌從池塘淤泥中分離得到。取池塘淤泥，加水稀釋，攪拌混勻，煮沸後冷卻，再用水稀釋至，取稀釋液均勻塗於按重量由胰蛋白腖1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，餘量為水，組成的LB固體培養基(pH 7.0～7.2)上，挑取可疑菌落(菌落邊緣不整齊)，再接種到另一上述組成的LB固體培養基上，純培養後鑑定，得到枯草芽孢桿菌B115。
以下對本發明作進一步說明。
1、枯草芽孢桿菌B115的主要特徵枯草芽孢桿菌B115的主要特徵為革蘭氏陽性，杆狀，能形成芽孢，芽孢呈橢圓形，芽孢囊不膨大，觸酶陽性，VP試驗陽性，甲基紅陰性，能利用葡萄糖不產氣，能利用木糖、阿拉伯糖、甘露醇、澱粉、明膠、檸檬酸鹽，硝酸鹽還原陽性，50℃生長，pH5.7生長，7％NaCl生長。
2、枯草芽孢桿菌B115的保存與培養菌種於4℃保存於膠狀LB培養基中，此培養基配方(W/W)為胰蛋白腖1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，餘量為水，pH 7.0～7.2。細菌菌種的長期保存採用冰冷乾燥方法。
用接種針挑枯草芽孢桿菌B115菌落，接種於含3～5ml液狀培養基的試管內，此培養基配方(W/W)為胰蛋白腖1％，牛肉膏0.25％，NaCl0.5％，餘量為水，pH7.0～7.2；200轉/分搖床培養，30℃，18～20小時；再將試管中的細菌接種於含上述液狀培養基250mL的錐形瓶內，200轉/分搖床培養，30℃，21～24h，得到菌液，其中枯草芽孢桿菌B115濃度不小於5×109CFU/mL。
3、枯草芽孢桿菌B115固體發酵固體發酵採用構造簡單的淺盤式發酵器，由一個無菌溫室和許多可移動的託盤組成，發酵培養基經滅菌、冷卻、接種後裝入託盤，料層厚度為1cm～2cm，託盤放在溫室的架子上，通過加溫增溼器調節溫室空間的溫度和溼度，溫室的溫度控制在28～35℃，同時不斷通入低壓無菌空氣，使菌體處於最適生長狀態。
發酵培養基的配方(W/W)為3.5％豆餅粉，4％麩皮，5％玉米粉，餘量為水。發酵培養基經120～125℃(0.1～0.15Mpa)高溫消毒30分鐘，冷卻後接種。
以重量計，按發酵培養基1％的量，將上述菌液分別接種到準備好的發酵培養基，混合均勻，混勻後平鋪在搪瓷盆或不鏽鋼淺盤上進行好氧發酵，時間1～2d，得到含菌糊漿。
4、枯草芽孢桿菌B115製劑的配製將上述含菌糊漿與等重量的本發明所述的填充料混勻後，於40±1℃鼓風式乾燥箱中烘乾，過18～20目篩，拌勻，製成粉末狀的製劑。
按本發明製備的枯草芽孢桿菌B115株的芽孢含量≥20×108CFU/mL。
5、對水質改良作用(1)不同濃度的枯草芽孢桿菌B115製劑對室內靜態水體改良效果枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，對室內池水的溶氧、pH無明顯的影響。
室內池水在使用枯草芽孢桿菌B115製劑後，0.1ppm組氨氮降低5.62～28.51％，最大降解峰值出現在第4d，亞硝酸鹽氮降低1.52～10.61％，最大降解峰值出現在第3-4d；硫化物降低2.17～20.65％，最大降解峰值出現在第4d，COD降低0.00～13.83％；0.5ppm組氨氮降低6.93～40.26％，最大降解峰值出現在第4d，亞硝酸鹽氮降低7.01～21.66％，最大降解峰值出現在第3d；硫化物降低17.19～31.25％，最大降解峰值出現在第4d，COD降低-0.380～15.22％；1.0ppm組氨氮降低6.28～47.83％，最大降解峰值出現在第5-7d，亞硝酸鹽氮降低5.11～24.82％，最大降解峰值出現在第4d；硫化物降低2.91～43.69％，最大降解峰值出現在第4d，COD降低3.98～20.15％。而未使用枯草芽孢桿菌B115製劑的對照池氨氮的變化量為-2.43～13.11％，亞硝酸鹽氮的變化量為-5.08～8.47％，硫化物的變化量為-6.41～12.82％，無明顯的降解峰出現，COD變化量為-1.95～-7.06％。表明枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，可明顯降低池水的氨氮濃度、亞硝酸鹽氮、硫化物濃度。由於本次實驗在靜態水環境中進行，因此對照組的COD也呈下降的趨勢，但與試驗組相比，第7d時，下降幅度僅為使用芽孢桿菌製劑組的50％以下，結果表明，枯草芽孢桿菌B115對有機質有降低作用。
0.1ppm、0.5ppm、1.0ppm的枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，均對池塘水質有不同的改良作用，在該濃度範圍內改良效果與濃度呈正相關，但0.1ppm枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，池水中氨氮降解率為28.51％、亞硝酸鹽氮為10.61％、硫化物為20.65％，而0.5ppm和1.0ppm的枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，氨氮降解率＞40％、亞硝酸鹽氮＞20％、硫化物＞30％。雖然1.0ppm使用後效果要優於0.5ppm的使用效果，但兩者相比，效果差別不是非常大，因此從使用成本和使用效果等方面的綜合考慮，作為微生態水質改良劑，當枯草芽孢桿菌B115濃度為20億/克時，0.5ppm的使用劑量比較合理的。
(2)枯草芽孢桿菌B115製劑對養殖魚池的水質改良效果測定試驗在湖州市金泰水產養殖有限公司的3號、4號和5號池進行，其中3號和4號池為試驗池，5號池為對照池，池塘相鄰，面積均為8畝，水深1.5米，3號和5號池塘主要養殖太湖白魚、4號池塘主要養殖鱖魚。3號和4號池按枯草芽孢桿菌B115製劑使用說明，每池用枯草芽孢桿菌B115製劑4000g全池潑灑，使用後的第3、第7及第15天採集水樣分析測定。第15天時試驗池塘第二次使用枯草芽孢桿菌B115製劑4000g全池潑灑。
在試驗期間，兩試驗魚池pH的變化量分別為-0.26～0.40％和-0.39～0.66％，而對照魚池pH變化量為-0.39～-0.13％；兩試驗魚池溶氧的變化率為-0.53～5.20％和-0.239～0.13％；對照魚池溶氧變化率為0.51～5.68％，表明枯草芽孢杆製劑使用後對養殖魚池溶氧和pH無明顯的影響。試驗魚池在使用枯草芽孢桿菌B115製劑後最大降解峰出現在第3d，氨氮分別降低49.45％和48.57％，亞硝酸鹽氮分別降低13.86％和13.22％，硫化物分別降低25.81％和16.49％，之後各項水化指標逐漸升高，至第15d時，兩試驗魚池氨氮僅降低3.3％和11.43％；亞硝酸鹽氮降低4.95％和4.13％，硫化物降低14.52％和2.06％。因此在第15d時繼續用0.5ppm的枯草芽孢桿菌B115製劑全池潑灑，第二次使用後的最大降解峰仍出現在第3d，氨氮分別降低45.60％和50.29％，亞硝酸鹽氮降低18.81％和11.57％，硫化物降低30.65％和19.59％，至30天時各項水化指標又逐漸升至使用前水平。對照魚池氨氮變化範圍為-3.09％～13.58％，亞硝酸態氮-46.65％～11.63％，硫化物能降低-3.95％～11.63％，無明顯的降解峰出現。4號和3號試驗池塘的COD分別為降低0.59～6.00％和0.28～3.92％，而對照池塘的COD增加0.00～4.09％。結果表明枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，對池塘氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和有機物具有明顯的降解作用，降解高峰出現用後第3d左右，在池塘中的維持時間在15d左右，追加使用後的第3d能再次出現氨氮，亞硝酸態氮和硫化物降解高峰。因此建議在生產中，枯草芽孢桿菌B115製劑一次使用後，在15天以內應繼續使用，以有效地改善養殖池塘的環境，降低池塘中有毒有害物質的量，提高養殖效益。
(3)枯草芽孢桿菌B115製劑對養殖蟹池的水質改良效果測定試驗在湖州市青山鄉張新江河蟹養殖場的東1和東2池塘進行，池塘相鄰，面積分別為15畝和7畝，平均水深為0.6m。東1池塘為試驗池，主要以飼養成蟹為主。試驗時用3000g枯草芽孢桿菌B115製劑全池潑灑。東2池塘為對照池。
在試驗期間，試驗蟹池pH的變化量分別為0.57％～1.58％，溶氧的變化率為-1.22％～2.91％，對照蟹池pH變化量為0.14％～0.42％；溶氧變化率為0.63％～3.30％，表明枯草芽孢桿菌B115製劑使用後對養殖蟹池溶氧和pH無明顯的影響。試驗蟹池在使用枯草芽孢桿菌B115製劑後第3天出現降解高峰，氨氮降低38.25％；亞硝酸鹽氮降低17.05％，硫化物降低14.29％；之後各項水化指標逐漸升高。而總大腸菌群則在第7天出現最大降低值為33.90％，在3-15天內均保持了較低的值。
總之，三種不同水體枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，對溶氧和pH均無明顯的影響。而對氨氮最大降解峰值出現在用後的3～4d，最大平均降低率為45.40±5.06％，亞硝酸鹽氮的最大降解峰值出現在使用後3d，最大平均降低率為16.03±3.82％，硫化物的最大降解峰值出現在使用後3～4d，最大平均降低率為23.01±7.27％；而各對照組的氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物呈波動變化，且出現時間也不固定，統計分析兩者有明顯差異(P＜0.1)。因此可以判斷枯草芽孢桿菌B115劑使用後，對水體中氨氮、亞硝酸鹽氮及硫化物有明顯的改良作用。
6、枯草芽孢桿菌B115微生態製劑對常見致病微生物的影響篩選出抗菌活性較強的菌株B115。B115菌液培養並經離心後，其培養濾液對常見的魚類病原菌具有抑菌活性，能較強地抑制細菌性敗血症病原(BSK-10)、金黃色葡萄球菌、大黃魚致病菌(副溶血弧菌、哈維氏弧菌)，但不能抑制中華鱉致病菌(TL970424)。對BSK-10的抑菌圈為14mm，對大黃魚哈維氏弧菌的抑菌圈為15mm，對大黃魚副溶血弧菌的抑菌圈為13mm，對河蟹致病菌Cl99920的抑菌圈為13mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為10mm。說明B115菌在培養過程中可分泌出一種抗菌物質，其抑菌範圍是相當廣泛的包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，但並不是所有的細菌。
(1)對BSK-10的作用B115與BSK-10混合培養時，BSK-10的初始濃度與B115一致均為5000CFU/ml時BSK-10的生長不受B115的抑制，24h培養產物中BSK-10的含量與BSK-10純培養濃度一致，BSK-10的初始濃度為B115的1/10和1/100時，6h時計數結果表明BSK-10的生長基本不受B115的影響，但至24h時未檢測到BSK-10(最低檢出值為100CFU/ml)，說明B115對中、低濃度的BSK-10具有明顯的殺滅作用；但高濃度的BSK-10對B115的生長具有抑制作用，24h時B115的增殖倍數為對照的1/1200，中、低濃度的BSK-10對B115的生長基本無影響。
(2)對Cl99920的作用B115與Cl99920混合培養的抑殺菌效果，試驗結果表明B115(濃度為5000CFU/ml)對中高濃度(5000和500CFU/ml)的Cl99920具有明顯的抑制作用，且在6h時就已表現出來，中高濃度的Cl99920在6h時其增殖量分別為對照的1/5和1/12，至24h時為對照的1/600和1/300；B115對低濃度(50CFU/ml)的Cl99920有明顯的殺滅作用，6h和24h時均未檢出Cl99920的存在，即起始濃度為50CFU/ml的Cl99920沒有增殖到100CFU/ml，可見5000CFU/ml的B115對50CFU/ml的Cl99920具有殺滅作用；而Cl99920對B115的生長基本無影響，三個濃度的Cl99920與B115混合培養至24h後，B115的含量與對照無明顯差異。
氣單胞菌廣泛分布於水體環境中，能夠引起鯽、鯿、鰱、鱅等普通養殖魚類及蝦、蟹、鱉、蛙等特種水產動物的嚴重疾病。B115與致病性氣單胞菌混合培養的結果顯示，5000CFU/ml的B115能殺滅500CFU/ml、50CFU/ml的魚類氣單胞菌敗血症病原菌BSK-10以及50CFU/ml的河蟹氣單胞菌致病菌Cl99920，能抑制5000CFU/ml和500CFU/ml的Cl99920的生長。但B115對甲魚致病性氣單胞菌TL97424無抑制作用。因此，在養殖水體中施用B115製劑對防治某些致病性氣單胞菌引起的疾病具有一定的效果。
7、枯草芽孢桿菌B115微生態製劑的毒性及致病性(1)芽孢桿菌的毒性試驗A、對鯽魚的急性毒性試驗10ppm、100ppm枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，試驗魚攝食、活動正常，成活率為100％；1000ppm使用後，池水稍變渾濁，但鯽魚攝食、活動正常，成活率為100％；4000ppm使用24h後，水質渾濁，試驗魚缺氧浮頭，96h內平均死亡率為35％。枯草芽孢桿菌B115株對鯽魚的96小時LD50＞4000ppm。
B、對淡水青蝦的急性毒性試驗
10ppm、100ppm枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，試驗蝦攝食、活動正常，成活率為100％；1000ppm枯草芽孢桿菌B115製劑使用後，池水稍變渾濁，淡水青蝦出現浮頭，96h內平均成活率為60％；2000ppm使用後，池水變渾，24h後，淡水青蝦嚴重缺氧浮頭，48h內全部死亡。用直線內插法計算枯草芽孢桿菌B115製劑對淡水青蝦的96hLD50為1350ppm。
C、對小白鼠毒性試驗小白鼠隨機分組，每組10隻，雌雄各半，每籠10隻，給藥前稱重。試驗分口灌給藥、拌餌給藥兩組，各組按高、中、低三個劑量給藥，其中高劑量組分別口灌和拌餌給菌5×1010CFU/只，中劑量組口灌和拌餌給菌1×1010CFU/只，低劑量口灌和拌餌給菌0.5×1010CFU/只每天給藥一次。同時設試驗對照組和空白對照組。
各組小鼠用枯草芽孢桿菌B115製劑投餵後，每天觀察小白鼠的外表、行為、飲食等情況。30天試驗結束於末次給藥後24h，採血測定血液學、血液生化學指標，各組小白鼠採血後斷頸處死，迅速解剖，仔細觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、子宮、卵巢、睪丸病變。
30天試驗結束於末次給藥後24h，眼眶取血，用全自動血液分析儀測定紅細胞總數、血紅蛋白、白細胞和淋巴細胞；用BackMan全自生化分析儀測定穀草轉氨酶、谷丙轉氨酶、AST和ALK，對測定的數據作方差檢驗30天試驗結束後，各試驗組和對照組小白鼠的活動、顏色光澤、呼吸均正常，鼻腔末見分泌物外溢，糞便成形，成活率為100％。30天飼料消耗及小白鼠體重均無差異(P＞0.1)，心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、子宮、卵巢、睪丸均正常。試驗組和對照組小白鼠的血液學和血液生化學指標經t檢驗結果表明小白鼠口灌和拌餌投飼枯草芽孢桿菌B115製劑後，t值均＞0.1，兩者無差異，表明枯草芽孢桿菌B115株對小白鼠無毒性。
(2)枯草芽孢桿菌B115製劑的致病性試驗(1)鯽魚口灌枯草芽孢桿菌B115株的致病性試驗將枯草芽孢桿菌B115製劑稀釋至50×108cfu/mL及用4℃，6000rpm離心10min，取菌泥，用生理鹽水稀釋至200×108cfu/mL後，用自製的口灌器，分別灌入1ml、0.5ml和0.1ml的枯草芽孢桿菌B115培養物和菌泥稀釋液，每兩天口灌一次，連續口灌三次，同時設口灌1ml滅菌LB培養基對照組，口灌結束後連續觀察15天，各組試驗組和對照組鯽魚口灌枯草芽孢桿菌B115製劑後均未出現死亡，成活率為100％，與對照組相比體重未有明顯下降，體表和臟器解剖觀察未出現異常，表明口灌枯草芽孢桿菌B115株對鯽魚無致病性。
(2)注射枯草芽孢桿菌B115株的致病性試驗枯草芽孢桿菌B115離心後菌泥用生理鹽水稀釋成200×108cfu/mL後，腹腔注射鯽魚10尾/組，每尾分別注射0.5和0.1ml。對照組鯽魚注射滅菌生理鹽水，每尾注射0.5ml。中華絨螯蟹於第三步足基部注射10隻，每隻注射0.1ml，對照組每隻注射生理鹽水0.1ml；南美白對蝦注射10尾，每尾注射0.1ml，對照組每尾注射0.1ml生理鹽水；小白鼠腹腔注射10隻/組，皮下注射10隻/組，每隻分別注射0.5ml和0.1ml，每2d注射一次，連續注射3次，對照組每隻注射生理鹽水0.5ml。連續觀察15天。試驗期間水溫為25±1℃，池水溶氧在5mg/L以上，pH7.35，氣溫為30±3℃。各試驗組和對照組鯽魚、中華絨螯蟹和南美白對蝦注射枯草芽孢桿菌B115後的15天內，均未出現死亡，成活率為100％，與對照組相比體重未有明顯下降，體表和臟器解剖觀察未出現異常。各試驗組和對照組小白鼠的活動、皮毛顏色光澤、呼吸均正常，鼻腔末見分泌物外溢。皮下注射部分有結塊，腹腔注射的小白鼠腹水增多，肝、脾、腎、腸、性腺等臟器解剖觀察正常。因此初步判斷本實驗室從池塘淤泥中分離的枯草芽孢桿菌B115株對常見水產動物及小白鼠無致病性。
試用表明，本發明的水質改良劑，對池塘氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和有機物具有明顯的降解作用，能有效改善養殖池塘的環境，降低池塘中有毒有害物質的量，並且對魚類無毒性和致病性，能有效提高養殖效益。本發明的製劑，可以是固體劑型，有利於儲存、包裝、運輸。
具體實施方式
實施例1取池塘淤泥，加10倍重量的無菌水稀釋，攪拌混勻，煮沸8分鐘，冷卻，再分份用無菌水分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取不同稀釋度的液體0.1ml，均勻塗於按重量由胰蛋白腖1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，餘量為水，組成的LB固體培養基(pH 7.0～7.2)上，挑取可疑菌落(菌落邊緣不整齊)，再接種到另一上述組成的LB固體培養基上，純培養後鑑定，得到枯草芽孢桿菌B115。
將枯芽孢桿菌B115接種於含4ml按重量由胰蛋白腖1％，牛肉膏0.25％，NaCl0.5％，餘量為水，組成的液狀培養基(pH7.0～7.2)的試管內，再將試管中的細菌接種於含上述液狀培養基250mL的錐形瓶內，200轉/分搖床培養，30℃，21小時，得到菌液，此菌液中枯草芽孢桿菌B115濃度不小於5×109CFU/mL。
按重量將麩皮4％、豆餅粉3.5％、玉米粉5％和餘量的水混勻後，高壓滅菌，冷卻後製成發酵培養基。將發酵培養基重量1％的上述菌液加入發酵培養基，混勻後平鋪於搪瓷託盆，料層厚度為1.5cm，託盤放在溫室的架子上，通過加溫增溼器調節溫室空間的溫度和溼度，同時不斷通入低壓無菌空氣，使菌體進行好氧發酵，時間24小時，得含菌糊漿。
按重量由沸石粉和礱糠粉按1∶1的比例混合，得填充料。將等重量的所述填充料和含菌糊漿混勻後，於40±1℃鼓風式乾燥箱中烘乾，過18～20目篩，拌勻，製成粉末狀的製劑。經測定該製劑的枯草芽胞桿菌B115為8.2×109個/g；再加所含填充料3倍重量的所述填充料，製成枯草芽孢桿菌B115製劑，其中含枯草芽孢桿菌B115 21×108個/g。
實施例2區別於例1的是，本例發酵培養基按其重量計組成為豆餅粉4％，麩皮5％，玉米粉5％和餘量的水；填充料按重量由沸石粉∶米糠為2∶1混合組成，填充料與含菌糊漿混合後41℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為9.8×109個/g，再加所含填充料3倍重量所述的填充料，製成菌含量為24×108個/g的製劑。其它步驟與例的相同。
實施例3本例發酵培養基按其重量計組成為豆餅粉4％，麩皮4％，玉米粉3％和餘量的水，發酵培養24小時；填充料按重量由高嶺土∶玉米芯粉為2∶1混合組成，測定粉末狀製劑其活菌含量為9.2×109個/g，再加所含填充料3倍重量所述的填充料，製成菌含量為22×108個/g的製劑。
實施例4本例發酵培養基按其重量計組成豆餅粉4％，麩皮2％，玉米粉4％和餘量的水；填充料按重量由膨潤土∶麩皮為4∶1混合，填充料與含菌糊漿混合後40℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為7.8×109個/g，再加所含填充料2.5倍重量所述的填充料，製成菌含量為21×108個/g的製劑。
實施例5本例發酵培養基按其重量計組成為豆餅粉3％，麩皮5％，玉米粉3％和餘量的水；填充料按重量由陶土∶豆粕粉為3∶1混合，填充料與含菌糊漿混合後41℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為7.6×109個/g，再加所含填充料2.5倍重量所述的填充料，製成菌含量為20×108個/g的製劑。
實施例6本例發酵培養基按其重量計組成為豆餅粉2％，麩皮3％和餘量的水；填充料按重量由麥飯石粉∶花生粕為3∶1混合，填充料與含菌糊漿混合後40℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為6.8×109個/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，製成菌含量為22×108個/g的製劑。
實施例7本例發酵培養基按其重量計組成為麩皮5％，玉米粉4％和餘量的水；填充料按重量由沸石粉∶菜粕為3∶1混合，填充料與含菌糊漿混合後41℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為6.6×109個/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，製成菌含量為21×108個/g的製劑。
實施例8本例發酵培養基按其重量計組成為豆餅粉3％，麩皮4％和餘量的水；填充料為沸石粉混合，填充料與含菌糊漿混合後40℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為6.3×109個/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，製成菌含量為20×108個/g的製劑。
實施例9本例發酵培養基按重量計組成為豆餅粉3％，玉米粉4％和餘量的水；填充料為礱糠粉，填充料與含菌糊漿混合後41℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為9.8×108個/g，再加所含填充料3倍重量的大糠，製成菌含量為3×108個/g的製劑。
實施例10本例發酵培養基按重量計組成為豆餅粉2％，麩皮5％，玉米粉1.5％和餘量的水；填充料為玉米芯粉，填充料與含菌糊漿混合後41℃烘乾，測定粉末狀製劑其活菌含量為168×108個/g的製劑，再加所含填充料1倍重量的礱糠粉，製成菌含量為84×108個/g的製劑。
權利要求
1.枯草芽孢桿菌製劑，其特徵是以其重量為基準含有1.4～4.0％下述的發酵培養基固形物、86～90％下述的填充料和餘量的水，所述的製劑中枯草芽孢桿菌B115(Bacillus subtilis B115 CGMCC No1210)含量為1～100×108個/克；所述的發酵培養基固形物為豆餅粉、麩皮、玉米粉中的二種或三種的組合物；所述的填充料為礦粉、農作物桔杆籽粒粉或礦粉和農作物桔杆籽粒粉的組合物。
2.如權利要求
1所述的微生態改良劑，其特徵是所述的礦粉為沸石粉、膨潤土、麥飯石粉、陶土、高嶺土中的一種或二種以上的組合物，所述的農作物桔杆籽粒粉為礱糖粉、米糠、豆粕粉、麩皮、花生粕、菜粕、玉米芯粉中的一種或二種以上的組合物。
專利摘要
能有效改善養殖水質、降低水中有毒有害物質、對魚類無毒性和致病性、提高養殖效益的枯草芽孢桿菌製劑，以其重量為基準含有1.4～4.0％下述的發酵培養基固形物、86～90％下述的填充料和餘量的水，所述的製劑中枯草芽孢桿菌B115(Bacillus subtilis B115 CGMCC № 1210)含量為1～100×10
文檔編號C12N1/20GKCN1632105SQ200410101021
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月2日
發明者沈錦玉, 尹文林 申請人:沈錦玉, 尹文林導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan